우리는 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 조혈전구세포(HPC)를 오가노이드 개발에 통합하여 상주 미세아교세포를 가진 인간 뇌 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
유도만능줄기세포(iPSC)에서 유래한 3차원(3D) 뇌 오가노이드 배양은 인간의 뇌 발달 및 신경 질환의 발병을 연구하기 위한 중요한 체외 도구를 제공합니다. 그러나 인간 뇌 오가노이드에 미세아교세포가 통합되지 않은 것은 여전히 신경염증의 3D 모델에 대한 주요 장애물입니다. 현재의 접근법에는 완전히 분화된 미세아교세포를 성숙한 뇌 오가노이드에 통합하거나 iPSC 유래 배아체(EB)의 초기 단계에서 미세아교세포를 분화시키는 것이 포함됩니다. 첫 번째 접근 방식은 미세아교세포 분화가 인접한 신경 환경과 상호 작용하는 단계를 놓치고, 두 번째 접근 방식은 기술적으로 까다로워 미세아교세포의 양과 품질 측면에서 최종 오가노이드 간에 불일치가 발생합니다. 미세아교세포와 신경세포 발달 사이의 초기 상호작용을 연구하기 위해 미세아교세포를 이용한 뇌 오가노이드를 모델링하기 위해, 인간 iPSC와 분화된 고순도 조혈전구세포(HPC)를 iPSC 유래 EB에 통합하여 뇌 오가노이드를 만들었습니다. 면역염색 및 단세포 RNA 염기서열분석(sc-RNA-seq) 분석을 통해 HPC가 3D 오가노이드에 통합되었으며, 이는 결국 미세아교세포와 뉴런을 모두 가진 뇌 오가노이드로 발전했음을 확인했습니다. HPC가 없는 뇌 오가노이드와 비교했을 때, 이 접근법은 뇌 오가노이드에 상당한 미세아교세포 통합을 생성합니다. 미세아교세포와 신경 발달 특성으로 구성된 이 새로운 3D 오가노이드 모델은 선천성 면역 및 신경계 발달 간의 초기 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있으며 잠재적으로 신경 염증 및 신경 감염 질환의 모델로 사용될 수 있습니다.
서론
미세아교세포(Microglia)는 뇌의 상주 면역 세포로, 뇌 발달과 항상성 모두에 중요한 역할을 합니다 1,2. 미세아교세포의 활성화는 전염증 인자, 식세포작용 증가, 반응성 산화 스트레스를 생성하여 침입하는 병원체와 손상된 세포를 제거합니다. 그러나, 미세아교세포의 과잉 활성화 또는 장시간 활성화는, 다른 한편으로는, 파킨슨병을 포함하여 많은 신경학상 무질서에 있는 병인의 기전으로 neurodegeneration를 일으키는 원인이 될지도 모른다 3,4. 미세아교세포가 인간의 신경 질환을 연구하기 위한 관련 모델에 포함되는 것이 중요합니다. 최근 몇 년 동안 인간 줄기세포는 동물 모델 및 인간 피험자 연구의 대안으로 체외 모델과 같은 3D 오가노이드를 개발하는 데 사용되었습니다5. 이상적으로, 인간 오가노이드는 해당 인간 장기와 유사한 여러 세포 유형 및 조직 구조를 구성하여 동물 모델보다 인간의 생리학 및 발병기전을 더 잘 나타내지만 인간 개인에 대한 연구와 직접....
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프로토콜
건강한 성인 기증자의 원본 혈액 샘플은 NIH의 수혈 의학 혈액 은행에서 수집되었으며, NIH 기관 검토 위원회에 따라 서명된 정보에 입각한 동의서를 입수했습니다.
1. 인간 iPSC에서 조혈전구세포(HPC) 생산
참고: 대표적인 결과를 생성하기 위해 인간 iPSC 세포(510 및 507)를 사용했습니다. iPSC의 생성 및 유지 방법은 이전 간행물16에서 확인할 수 있습니다.
- Day 0: DMEM/F12 배지로 희석된 얼음처럼 차가운 Matrigel(기저막 매트릭스[BMM]) 용액 500μL/웰을 첨가하여 12웰 셀 플레이트를 코팅하고 실온(RT)에서 최소 30분 동안 배양합니다.
- 코팅 상층액을 완전히 제거하고 웰당 1mL의 E8 Flex 배지로 교체합니다.
- 현미경으로 6웰 플레이트의 iPSC 배양을 확인하여 iPSC가 고품질이며 차별화 징후가 없는지 확인합니다. 중간 크기의 군락을 선택하여 접시 바닥 아래에 마커 펜으로 표시하십시오.
- iPSC 배양액에서 배지를 제거하고 500μL의 에....
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결과
당사의 프로토콜은 HPC와 iPSC를 구별한 다음 HPC와 iPSC를 혼합하여 EB를 만든 다음 신경 유도, 분화 및 성숙을 수행하는 체계를 따릅니다(그림 1). 높은 품질의 HPC 분화는 EB 형성과 향후 오가노이드 분화의 성공에 매우 중요합니다. 연속 희석 배양 기법을 사용하여 HPC 분화를 시작하기 위해 적절한 수와 크기의 iPSC 콜로니를 생성합니다(그림 2A). 일반적으로 iPSC 콜로니는 배지 A(그림 2B)에서 배양이 끝날 때 상당한 형태학적 변화를 겪고, 배지 B(그림 2C)에서 3일 후에 균질한 원형 세포가 배양 용기 바로 위에 떠다니거나 배양 용기 바닥에 부착되어 HPC로 분화됩니다. HPC는 군체와 같은 세포 클러스터를 형성하기 위해 확장될.......
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토론
여기에서는 혼합 iPSC 및 iPSC 분화 HPC에서 유래한 EB의 선천성 미세아교세포를 포함하는 3D 신경 오가노이드를 만들기 위한 자세한 프로토콜이 제시됩니다. 대부분의 실험실에서 일반적으로 사용할 수 있는 세포 배양 기술과 장비만 포함하는 비교적 짧고 쉬운 접근 방식입니다.
이 프로토콜의 성공을 위한 가장 중요한 요소는 HPC의 차별화 품질입니다. 우리는 HPC를 iPSC와 구별하기 위해 몇 가지 수정을 가하여 상용 키트를 사용하여 발표된 방법17 을 채택했습니다. 기존 프로토콜과 비교했을 때, 당사는 더 작고 더 낮은 범위의 iPSC 콜로니로 시작하여 12일이 아닌 10일 후에 분화된 HPC를 수집합니다. 이 접근 방식은 웰당 1-200만 HPC만 생성하지만 3D 오가노이드 생산의 다음 단계에 여전히 충분합니다. 과도한 수의 세포는 결국 죽은 세포/파편을 초래하여 EB .......
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공개 사항
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감사의 글
이 연구는 NINDS 교내 연구 기금의 지원을 받습니다.
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재료
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참고문헌
- Sabate-Soler, S., et al. Microglia integration into human midbrain organoids leads to increased neuronal maturation and functionality. Glia. 70 (7), 1267-1288 (2022).
- Lazarov, T., Juarez-Carreño, S., Cox, N., Geissmann, F. Physiology and diseases of tissue-res....
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