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Immunology and Infection

Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a 기반 시스템을 사용한 Acinetobacter Baumannii 감염의 빠르고 특이적 검출

Published: April 25, 2025
doi:
10.3791/67542
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1Department of General Practice,The First Hospital of Jilin University2Department of Respiratory Medicine, Center for Pathogen Biology and Infectious Diseases,The First Hospital of Jilin University3Bioinformatics Laboratory,The First Hospital of Jilin University

Summary

Acinetobacter baumannii의 빠르고 정확한 검출을 촉진하기 위해 A. baumannii 감염을 식별하기 위해 LbaCas12a 엔도뉴클레아제와 함께 Recombinase Polymerase Amplification(RPA)을 사용하는 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

그람 음성 박테리아인 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)는 높은 사망률과 함께 심각한 감염을 일으키는 것으로 악명이 높습니다. A. baumannii의 빠르고 정확한 검출은 신속한 치료, 효과적인 감염 통제 및 항생제 내성 억제에 매우 중요합니다. 그러나 A. baumannii를 현장에서 빠르고 쉽게 검출할 수 있는 적절한 방법은 없습니다. DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter(DETECTR) 시스템은 Cas12a의 표적별 인식 기능과 Recombinase Polymerase Amplification(RPA)의 등온 증폭 효율을 통합하여 A. baumannii 검출에 대한 빠르고 정확하며 민감한 접근 방식을 제공합니다. 이 프로토콜은 LbaCas12a 엔도뉴클레아제와 결합된 RPA를 사용하여 A. baumannii를 검출하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 문서에서는 DNA 추출, 특정 DNA 염기서열 선택, 프라이머 및 CRISPR RNA(crRNA) 설계, 양성 재조합 플라스미드 구축, Cas12a-RPA 분석 설정, RPA 증폭 시스템 최적화, Real-Time PCR 기기와 같은 형광 검출 도구를 사용한 RPA-CRISPR/Cas12a 분석 시각화 단계에 대해 설명합니다. 민감도 및 특이도 평가에 대한 평가.

Introduction

임상 미생물학에서 아시네토박터 바우마니이 감염을 검출하는 것은 매우 어려운 과제입니다. 이 그람 음성 박테리아는 특히 면역이 저하된 환자에서 높은 사망률에도 불구하고 심각한 임상 증상을 동반한 감염을 유발할 수 있습니다1. 병원체 감염에 대한 기존의 배양 기반 검출 방법은 시간이 많이 걸리고 민감도가 부족하여 항생제 치료를 지연시키고 환자의 결과를 손상시킬 수 있습니다. A. baumannii의 신속하고 정확한 식별은 효과적인 치료와 발병 통제에 매우 중요합니다. 이러한 요구를 충족하기 위해 핵산 증폭을 사용하는 분자 기술이 연구되었습니다. 그러나 이러한 접근 방식은 종종 정교한 열 순환 장비가 필요하며 잘 훈련된 기술자와 잘 정립된 실험실에 의해 제한될 수 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 등온 증폭 방법 2,3,4를 개발하는 데 연구가 점점 더 집중되고 있습니다.

재조합효소 중합효소 증폭(RPA)은 Piepenburg et al 5 에 의해 확립된 방법으로, 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 유사하지만 온도 사이클링이 필요 없는 DNA를 증폭하는 데 사용됩니다. 이 방법은 50mM Tris(pH 7.5), 100mM 초산칼륨, 14mM 마그네슘 아세테이트, 2mM DTT, 5% PEG20000(고분자량 폴리에틸렌 글리콜), 200μM dNTP, 3mM ATP, 50mM 포스포크레아틴, 100μg/mL 크레아틴 키나아제, 120μg/mL UvsX, 30μg/mL UvsY, 900μg/mL Gp32, 30μg/mL Bsu LF, 450 nM 프라이머 및 DNA 템플릿. 증폭 과정은 3mM ATP와 5%의 존재 하에서 프라이머에 결합하는 재조합효소 단백질 UvsX PEG20000 재조합효소-프라이머 복합체를 형성하는 것으로 시작됩니다. 그런 다음 이 복합체는 이중 가닥 DNA의 상동 서열과 프라이머의 결합을 촉진합니다.

UvsY의 도움으로 재조합효소 UvsX는 프라이머와 템플릿 가닥 간의 교환을 촉진하여 표적 DNA의 한 가닥을 변위시킵니다. Gp32는 단일 가닥 DNA 구조를 유지하는 데 도움이 됩니다. 마지막으로, 재조합효소가 해리되고 DNA 가닥을 치환할 수 있는 DNA 중합효소(Bsu LF)가 프라이머의 3′ 말단에 결합하여 디옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP)가 있는 상태에서 프라이머를 연장합니다. 이 프로세스는 주기적으로 반복되어 기하급수적 증폭을 달성합니다. 모든 증폭 과정은 20-40분 이내에 완료할 수 있으며 37°C에서 42°C 사이의 비교적 일정한 온도에서 완료할 수 있습니다. 이 온도 범위는 생리학적 온도와 거의 동일하므로 RPA가 미니멀한 환경에서 수행될 수 있으므로 RPA는 DNA 검출 및 분석을 위한 다재다능하고 효율적인 도구입니다.

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 및 CRISPR-Cas(CRISPR-Cas) 시스템은 Class I 및 Class II 시스템을 포함하는 박테리아 및 고세균에서 적응 면역 메커니즘으로 기능합니다. 클래스 II에는 Cas12 (a, b, f), Cas13 (a, b) 및 Cas14와 같은 단백질이 포함되며, 이는 CRISPR RNA (crRNA) 6,7,8에 의해 유도되는 표적 DNA 또는 RNA를 식별하고 절단합니다. LbaCas12a(또는 Cpf1)는 crRNA 유도 DNA 엔도뉴클레아제입니다. crRNA는 CRISPR-Cas 시스템 내에서 안내 RNA 역할을 하며, 여기서 Cas 단백질과 복합체를 이룹니다. 이는 spacer region을 활용하여 표적 DNA와 쌍을 이루어 단백질 복합체를 표적 염기서열로 효과적으로 조종합니다. 서열 5′-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3’은 모든 LbaCas12a crRNA의 상수 요소인 보존된 crRNA 반복으로 작용합니다. 이 반복 다음에는 의도된 DNA 표적에 따라 다른 표적 특이적 세그먼트가 있습니다. 이 표적 서열의 길이는 18 – 24개의 뉴클레오티드입니다.

PAM(Protospacer-Adjacent Motif) 서열(TTTV, 여기서 V는 A, C 또는 G일 수 있음)은 DNA 표적의 비상보적 가닥의 5′ 끝에 위치합니다. Cas12a는 PAM 염기서열에서 표적 이중 가닥 DNA를 절단합니다. 그 후, 활성화된 Cas 단백질은 단일 가닥 DNA(ssDNA)의 비특이적 트랜스 절단을 실행합니다.9,10,11,12. 따라서 형광단과 소광체로 표지된 ssDNA는 절단을 거쳐 측부 절단 후 형광 신호가 방출됩니다 8,13. 형광 강도는 정확한 핵산 검출을 위해 형광 판독기를 사용하여 정량화할 수 있습니다14. 특히, Cas12a는 PAM(Protospacer-Adjacent Motif)의 인식에 따라 표적 염기서열의 결합 및 절단을 통해 DNA 분석에 광범위하게 활용되는 반면, Cas13a는 이러한 요구 사항과 독립적으로 작동합니다.

CRISPR-Cas 시스템 15,16,17은 단일 반응 18,19,20,21 내에서 절단을 용이하게 합니다. 위의 두 가지를 결합하면 핵산 검출을 위한 A. baumannii-DETECTR(LbaCas12a-Enabled Detection of Targeted A. baumannii)로 알려진 강력한 도구를 만들 수 있습니다 22,23,24. 이 프로토콜은 A. baumannii의 16s rDNA 유전자 내에서 crRNA 유도 염기서열을 특이적으로 표적화하고 절단하기 위해 Cas12a의 DNase 활성과 함께 RPA를 사용하여 병원체를 민감하고 정밀하게 검출할 수 있음을 보여줍니다.

A. baumannii-DETECTR 방법은 기존 검출 방법에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다25,26. 첫째, RPA의 등온 특성은 열 순환기 독립적인 증폭 메커니즘을 통해 운영 절차를 간소화하고 비용을 절감합니다5. 둘째, Cas12a 엔도뉴클레아제는 crRNA 매개 표적화 및 Watson-Crick 염기 쌍을 통해 분석의 특이성을 증가시킵니다7. 마지막으로, A. baumannii-DETECTR의 원-튜브 방법을 사용하면 시간을 절약할 수 있을 뿐만 아니라 앰플리콘 오염 위험을 크게 줄일 수 있습니다19.

이 프로토콜은 DNA 추출 추출, 표적 DNA 염기서열 선택, 프라이머 및 crRNA 설계, 양성 재조합 플라스미드 구축, Cas12a-RPA 분석 설정 수립, RPA 증폭 최적화 최적화, Real-time PCR 기계와 같은 형광 검출 기기 도구를 사용하여 결과 시각화 시각화 단계를 간략하게 설명합니다. 민감도 및 특이도 평가로 완료됩니다.

A. baumannii-DETECTR 방법은 시기적절하고 효과적인 치료, 강력한 감염 통제 및 항생제 내성 확산 억제를 촉진하여 환자 결과를 향상시킬 수 있는 가능성을 가지고 있습니다. 이 프로토콜은 Cas12a-RPA 기술 구현을 위한 포괄적인 지침 역할을 하여 다양한 의료 환경에서 유용성을 향상시킬 수 있습니다. 그러나 일관되고 신뢰할 수 있는 결과를 보장하기 위해 특정 실험실 조건과 다양한 샘플에 따라 모든 단계를 최적화해야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

Protocol

1. A. baumannii -DETECTR의 건설

참고: A. baumannii-DETECTR의 구축은 primer 및 crRNA 설계, positive recombinant plasmid 구축, 반응 용액 준비, RPA에 의한 등온 DNA 증폭 및 RPA-CRISPR/Cas12a 분석의 시각화를 포함하는 4단계 프로세스입니다. DETECTR 분석의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.

  1. primer 및 crRNA의 설계( 보충 파일 1 참조)
    1. Primer 설계 원칙에 따라 설계 도구를 사용하여 12쌍의 프라이머를 설계합니다. 4개의 순방향 프라이머(F0-F3)와 3개의 역방향 프라이머(R1-R3)를 획득하여 12쌍의 프라이머(F0R1, F0R2, F0R3, F1R1, F1R2, F1R3, F2R1, F2R2, F2R3, F3R1, F3R2, F3R3)를 구성합니다.
      1. 프라이머의 5′ 말단에 연속적인 G 스트레치 대신 처음 3-5개의 뉴클레오티드 내에 C 또는 T 염기가 포함되어 있는지 확인합니다. 또한 3′ 말단에 있는 마지막 3개의 뉴클레오티드가 증폭을 강화하기 위해 이상적으로 G 및 C 염기인지 확인하십시오.
      2. 헤어핀 형성을 피하기 위해 자체 보완적 염기서열 없이 프라이머를 설계하고 그 사이에 4개 이하의 상보적 또는 상동성 염기가 없도록 합니다. 프라이머 이합체화를 피하기 위해 3′ 말단 상보성을 피하십시오.
    2. NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 Primer-BLAST 도구를 사용하여 각 프라이머 쌍의 특이성을 평가하여 프라이머의 효능과 특이성을 평가합니다.
      참고: Primer-BLAST는 NCBI 데이터베이스를 활용하여 설계된 프라이머와 일치하는 염기서열을 찾을 수 있으므로 사용자가 프라이머의 효능과 특이성을 평가할 수 있습니다.
    3. 프라이머 스크리닝 후 LbaCas12a crRNA 스캐폴드 염기서열(5′-UAAUUUCUACUAAGUGUGUAGAU-3′)을 고정 염기서열로 사용하여 CRISPR RNA(crRNA) 또는 가이드 RNA(gRNA)를 설계합니다. 타겟 특이적 세그먼트(5′-GUUAAUACCUAGAGAUAGUG-3′)를 통합하여 PAM 모티프가 비상보적 가닥의 5′ 끝에 위치하도록 합니다.
      참고: 모든 올리고뉴클레오티드 및 crRNA의 염기서열은 표 1에 제시되어 있습니다.
  2. 양성 재조합 플라스미드 구조
    1. 프라이머 세트 A. baumannii 16s rDNA-F(전방 프라이머) 및 A. baumannii 16s rDNA-R(역방향 프라이머)을 사용하여 16s rDNA 세그먼트를 증폭합니다.
      1. 1 μL의 10 μM F 및 10 μM R, 10 μL의 5x FastpFu 완충액, 1 μL의 FastpFu 중합효소, 4 μL의 2.5 mM dNTP, 1 μL 의 10 ng/μL A. baumannii 게놈 DNA, 32 μL의 Nuclease-free Water를 50 μL PCR 시스템에 추가합니다.
      2. PCR 사이클링 조건을 다음과 같이 설정합니다: 95°C에서 5분 동안 초기 변성, 95°C에서 30초 동안 변성 33회, 55°C에서 30초 동안 어닐링, 72°C에서 1분 및 20초 동안 연장. 마지막으로 최종 확장을 위해 72°C에서 10분 동안 수행합니다.
    2. 양성 PCR 산물을 정제하려면 제조업체의 지침에 따라 DNA 정제 키트를 사용하십시오. 그 후, 정제된 DNA를 BamHI 및 SalI 효소로 절단된 pUC57 벡터에 복제합니다.
      참고: 이 과정은 보존된 영역을 포함하는 positive recombinant plasmid를 생성하는 결과를 낳습니다.
    3. 양성 재조합 플라스미드를 멸균된 ddH2O로 10배 단위로 직렬로 희석하여 1 copy/μL에서 107 copies/μL 의 농도를 달성합니다. 후속 실험을 위해 희석된 플라스미드를 -20°C에 보관하십시오.
  3. 용액 준비
    1. 다음과 같이 용액 A를 준비합니다: 각 반응에 대해 29.5μL의 Primer Free Rehydration buffer, 2.4μL의 10μM A. baumannii-F 및 10μM A. baumannii-R, 12.2μL의 ddH2O를 추가하여 46.5μL의 최종 부피를 얻습니다. Vortex를 생성하고 간단히 회전합니다. 다음으로, 반응 혼합물을 RPA Kit의 효소 반응 튜브에 추가합니다. 혼합할 피펫.
      참고: A. baumannii-F 및 R의 프라이머는 A. baumannii 유전자를 표적으로 하는 분석에 사용됩니다. 순서는 표 1 을 참조하십시오.
    2. 다음과 같이 용액 B를 준비합니다: 각 반응에 대해 0.24 μL의 10 μM ssDNA 리포터, 2 μL의 10x Cas12a 반응 버퍼, 1 μM crRNA 1 μL, 1 μM Cas12a 1 μL 및 10.76μL의 ddH2O를 추가하여 15 μL의 최종 부피를 얻습니다.
      참고: 프로브(ssDNA 리포터)를 구매하여 5′ 말단에 5-Carboxyfluorescein(FAM) 형광단, 3′ 말단에 블랙홀 소광재(BHQ1) 소광체로 태그가 지정된 단일 가닥 DNA 리포터로 구성되었습니다. 검출이 필요한 샘플이 많은 경우 상당한 양의 용액 B를 준비한 다음 나중에 샘플을 부분 표본으로 나눕니다.
  4. 등온 DNA 증폭(RPA)
    1. 107 copies/μL의 양성 재조합 플라스미드 1 μL를 다른 프라이머 쌍을 가진 용액 A에 추가합니다. 철저히 섞는다. 그런 다음 2.5μL의 280mM 마그네슘 아세테이트(MgOAc)를 용액에 넣고 잘 섞습니다.
      참고: RPA 반응은 MgOAc가 추가되는 즉시 시작됩니다.
    2. 39 ° C에서 20 분 동안 배양하십시오. 20분 후, 정제 키트와 함께 RPA를 사용하여 다른 프라이머로 증폭된 제품을 정제한 다음 120V에서 1% 아가로스 젤에 깨끗한 앰플리콘을 10분 동안 실행하여 가장 밝고 넓은 대역을 최상의 프라이머 쌍으로 선택합니다.
      알림: 템플릿 복사 수가 낮은 경우 4분 후에 EP 튜브, 와류를 제거하고 잠시 회전합니다. 그런 다음 가열 장치에서 16분 더 교체하십시오. 후 amplification, 튜브는 앰플리콘으로 작업 표면이 오염되지 않도록 각별히 주의하여 열어야 합니다. 이 예방 조치는 후속 실험 절차에서 위양성 결과를 유도할 위험을 줄입니다.
  5. RPA 증폭 시스템 최적화
    참고: 이전 단계에서 선택한 최적의 프라이머 쌍 F3R3는 최적의 프라이머 농도와 시간을 선별하기 위해 RPA 증폭 반응을 위해 다른 최종 농도로 설정되었습니다. NC는 해당 프라이머 농도에 대한 빈 제어입니다.
    1. 용액 A에서 다른 성분의 농도를 일정하게 유지하고 총 부피 46.5 μL를 유지하십시오.0.40 μM (2.0 μL), 0.44 μM (2.2 μL), 0.48 μM (2.4 μL) 및 0.52 μM (2.6 μL)에서 10 μM F3 및 10 μM R3의 최종 프라이머 농도를 달성하기 위해 RNase-free ddH2O의 부피를 적절하게 조정하고, 각각.
    2. 39 °C에서 다른 시간 동안 배양하십시오 : 10 분, 20 분, 30 분.
    3. DNA Purification Kit를 이용하여 RPA 제품을 세척하고 120V에서 1% 아가로스 젤을 10분 동안 전기영동하여 밴드의 특성을 분석하여 최적의 프라이머 농도와 배양 시간을 확인합니다.
  6. RPA-CRISPR/Cas12a 분석의 시각화
    1. RPA 제품 5μL를 용액 B에 첨가하고 균질해질 때까지 철저히 혼합합니다.
    2. 형광 정량 PCR 기기에 샘플을 넣고 FAM 채널을 설정한 다음 37°C에서 60분 동안 1분마다, 총 60분 동안 60배 값을 읽습니다.
      알림: 녹색 형광 신호는 며칠 동안 지속될 수 있습니다. 시스템이 효과적으로 작동하는지 확인하려면 DNA 및 RNase free 테스트를 수행하는 것이 좋습니다.

2. RPA-CRISPR/Cas12a 기반 검출 플랫폼의 특이도 평가

참고: A. baumannii-DETECTR의 특이성을 테스트하기 위해 A. baumannii, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Rickettsia mooseri, Enterobacter, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella, Chlamydia psittaci, Legionella, Cockerella burnetii, Serratia 및 인간 샘플의 핵산을 DETECTR 테스트를 실시했습니다.

  1. 참조된 DNA Kit를 사용하여 다양한 종에서 얻은 DNA 템플릿을 사용하거나 물에서 박테리아를 끓여 분리합니다. 모든 템플릿의 농도가 동일한지 확인합니다. 물을 네거티브 컨트롤로 사용하십시오.
  2. 10ng 또는 1μL의 DNA 템플릿을 F3R3 프라이머가 포함된 용액 A에 추가합니다. 2.5 μL의 MgOAc를 첨가하고 철저히 혼합한 후 39°C에서 20분 동안 혼합물을 배양합니다.
  3. 20분 후 용액 B에 이전 단계의 생성물 5μL를 첨가하고 혼합합니다.
  4. 형광 정량 PCR 기기에 넣고 채널을 FAM으로 설정한 다음 37°C에서 1분에 한 번씩 총 60분 동안 60 x 값을 읽습니다.

3. RPA-CRISPR/Cas12a 기반 검출 플랫폼의 민감도 평가

  1. 1-107 copies/μL의 농도로 제조된 양성 재조합 플라스미드를 반응의 주형으로 사용합니다. 네거티브 컨트롤을 위해 물을 사용하십시오.
  2. 2.2-2.4 단계에 따라 방법을 수행합니다.
    참고: 프라이머 세트 RPA-F3 및 RPA-R3는 양성 재조합 플라스미드에서 174개 염기쌍의 더 짧은 단편을 증폭하도록 설계되었습니다.

4. 샘플이 자외선 및 LFS 검출 하에 있는 동안의 준비

  1. 필요한 수의 테스트 스트립을 꺼내 적절하게 레이블을 지정합니다.
  2. 2단계 및 3단계에서 증폭된 산물 10μL를 각각 별도의 PCR 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 각 튜브에 40μL의 ddH2O를 추가합니다.
    참고: 자체 준비 반응 시스템을 사용하는 경우 최적의 희석 비율을 탐색하는 것이 좋습니다.
  3. 테스트를 수행합니다.
    1. 증폭된 산물이 들어 있는 PCR 튜브를 transilluminator에 적용하여 형광의 존재를 평가합니다.
    2. 샘플 패드 끝이 아래를 향하도록 하여 PCR 튜브에 테스트 스트립을 삽입합니다.
    3. 결과를 읽기 위해 실온에서 5-10분 동안 그대로 두십시오. 이 시간이 지나면 계속 진행하기 전에 액체 레벨이 최대 라인을 초과하지 않는지 확인하십시오.
    4. T 선에 색상이 표시되지 않으면 결과를 음수로 해석합니다. T 라인이 육안으로 보이는 경우 결과를 긍정적으로 해석하여 핵산 프로브가 Cas 효소에 의해 절단되고 Cas 효소가 활성화되었음을 나타냅니다. C 라인과 T 라인 모두에 색상이 표시되지 않으면 결과가 유효하지 않은 것으로 간주합니다.

Representative Results

Discussion

A. baumannii 감염에 대한 전통적인 진단법은 여러 가지 제약이 있어 현장 검사에 대한 접근성과 실현 가능성을 떨어뜨린다27. 예를 들어, PCR은 감도와 특이도가 우수하지만 전문가가 작동해야 하는 특수 열 사이클링 장비와 복잡한 워크플로우가 필요합니다. 여기에 제시된 새로운 방법은 RPA 및 CRISPR-LbaCas12a 게놈 편집을 A. baumannii-DETECTR 분석으로 알려진 재조합과 결합하여 효율적인 유전자 조작을 가능하게 합니다. Acinetobacter baumannii 감염 및 다른 박테리아 병원체의 진단에 대한 빠르고 민감하며 특이적인 검출 방법을 제공합니다. 워크플로우는 그림 1에 나와 있습니다.

본 연구법은 감염을 진단하고 관리하는 데 특히 유리하며, 기존 진단 기법의 단점을 극복하여 환자의 회복을 촉진하고 A. baumannii 의 확산을 완화할 수 있습니다. A. baumannii-DETECTR 시스템은 높은 특이성과 민감도로 A. baumannii 를 식별하는 것으로 밝혀졌습니다(그림 5 및 그림 6). 연구 결과에 따르면 실시간 평가 과정에서 A. baumannii 게놈만 긍정적인 형광 주름 변화를 보인 반면, 다른 모든 종의 게놈은 부정적인 결과를 보였습니다(그림 5).

RPA-CRISPR/Cas12a 검출 플랫폼의 민감도를 평가하기 위해 A. baumannii에 대해 양성인 재조합 플라스미드 pUC57-16s rDNA를 시스템의 검출 한계(LOD)를 결정하기 위한 표적으로 사용했습니다. 형광 기반 RPA-CRISPR/Cas12a 분석에서 검출 범위는 마이크로리터당 1회에서 마이크로리터당 10,7회까지였으며, 음성 대조군에 비해 1 copy/μL 그룹에서 형광 강도가 눈에 띄게 향상되었습니다(그림 6). 중요한 것은 실시간 진단의 경우 실시간 진단에 필수적인 실험실 기반 장비와 독립적인 휴대용 휴대용 장치를 통해 감지 결과를 직접 시각화할 수 있다는 것입니다.

프로토콜26과 관련하여 몇 가지 중요한 요소를 고려해야 합니다. 첫째, A. baumannii-DETECTR 분석의 높은 감도를 감안할 때 샘플 채취 과정에서 교차 오염을 방지하는 것이 필수적입니다. 또한 반응 시약은 직사광선 노출로부터 보호되어야 합니다. 모든 절차 단계를 준수하는 것은 최상의 결과를 얻는 데 매우 중요합니다. A. baumannii 특이적 유전자 단편을 포함하는 플라스미드로 구성된 positive control을 통합하여 실제 응용 분야에서 A. baumannii-DETECTR 시스템의 적절한 기능을 검증해야 합니다.

이 프로토콜은 특정 실험실 조건 및 프라이머 농도, 반응 시간 및 기타 변수와 같은 샘플 유형에 맞게 파라미터를 최적화할 수 있음을 보여줍니다. 본 실험에서는 RPA 증폭을 위한 최적의 프라이머 조합, 프라이머 농도 및 반응 시간을 선택하여 최고의 증폭 효율과 특이성을 도출하였다. 이는 아가로스 겔 전기영동에 의해 결정되었습니다(그림 2 및 그림 3). 또한, A. baumannii 게놈의 보존 영역을 포함하는 양성 재조합 플라스미드를 대조군으로 사용하여 프로토콜의 정확성을 보장했습니다. 상용 박테리아 게놈 DNA 추출 키트가 이 프로토콜에서 DNA 추출을 위한 표준화되고 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 그러나, 향후 연구에서, 임상적 또는 환경적 샘플과 같은 다른 샘플 유형은 A. baumannii DNA를 효과적으로 분리하기 위해 특정 추출 방법(28)을 필요로 할 수 있다.

양성 대조군에서 검출 가능한 형광 신호가 없는 경우, 반응 혼합물에 억제제가 존재할 가능성이 높으며, 이로 인해 시약의 변경이 필요합니다. 반대로, 형광 강도가 명확한 분화를 위해 충분하지 않은 경우 배양 기간을 연장하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 그러나 장기간의 배양은 위양성(false positive)을 초래할 수도 있다26.

현재 A. baumannii에 대한 검출 방법론은 값비싼 PCR 장비, 고정된 작업 위치 및 전문 인력의 사용을 필요로 합니다. 대조적으로, 본 명세서에서 제안된 방법은 현장 환경에서 A. baumannii의 정확하고 민감한 진단을 용이하게 하여 더 광범위한 인구 통계학적으로 접근할 수 있도록 합니다.

등온 증폭의 특성과 형광을 통해 수집된 데이터로 인해 A. baumannii-DETCTER 워크플로우는 간단하고 장비 요구 사항이 낮을 뿐만 아니라 외딴 지역이나 발병 시 신속한 병원체 검출을 수행할 수 있습니다. 새로운 등온 핵산 증폭 기술인 RPA-LFS 29,30,31,32는 작동이 간단하고 시간적 요구가 감소하여 바이러스, 박테리아, 진균 및 기생 병원체를 검출하는 데 상당한 견인력을 얻었습니다. 이 프로토콜은 자외선(UV) 또는 Transilluminator 및 LFS(Lateral Flow Strips) 검출 하에서 샘플의 형광 신호를 자세히 설명합니다. 육안 검사가 짧은 시간에 이루어지기 때문에(그림 7) 고정밀 기기와 전문 기술자에 대한 의존도를 피할 수 있으므로, 비싸고 복잡한 실험실 장비와 운영 인력의 필요성을 없앨 수 있습니다. 또한 단일 튜브 방법은 시간을 절약할 뿐만 아니라 앰플리콘 오염 위험을 줄여줍니다33.

향후 연구는 보다 효율적이고 저렴한 DNA 추출 기술을 탐구하는 것과 같이 다양한 유형의 샘플과 다양한 환경 조건에서 사용할 수 있도록 방법을 개선하는 것을 목표로 해야 합니다. A. baumannii-DETECTR의 사용은 임상 진단뿐만 아니라 환경 평가, 발병의 모니터링 및 관리에도 사용할 수 있으므로 지역 사회와 병원에서 A. baumannii를 신속하게 식별할 수 있습니다. 또한, crRNA 및 프라이머를 변형함으로써 이 분자 진단 접근법은 폐렴 연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 엔테로박터(Enterobacter)와 같은 다양한 호흡기 세균 감염의 검출에 적용할 수 있습니다.

요약하면, A. baumannii-DETECTR는 높은 감도와 특이성, 사용자 친화적인 디자인 및 휴대성으로 인해 A. baumannii 를 최대한 빠르고 정확하게 식별할 수 있습니다. 이 방법은 시기적절하고 효과적인 치료, 감염 통제를 촉진하고 항생제 내성의 확산을 완화하는 동시에 증가하는 A. baumannii 감염 위협을 해결함으로써 환자의 건강 결과를 향상시킬 수 있습니다.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Materials

 -20 °C FreezerHaierHYCD-290China
Agarose BasicBioFroxx1110GR100China
All oligonucleotides and crRNA were synthesized by companywww.comatebio.com
Cas12a cutting substrate – ssDNA – fluorescent typeEZassay Biotech. Co. Ltd.DNA-FAM-BHQChina
Cas12a cutting substrate – ssDNA – test paper typeEZassay Biotech. Co. Ltd.DNA-FAM-BIOChina
Electrophoresis apparatusBIO-RADPOWER PAC1000USA
Fluorescence quantitative PCR instrumentBIO-RADCFX ConnectUSA
Gel Imaging SystemBIO-RADGel Doc 2000USA
https://ezassay.com/rna
https://www.ezassay.com/primer  
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast
Lateral flow paper strip (Biotin/FAM)EZassay Biotech. Co. Ltd.HD-FMBOChina
LbaCas12a (Cpf1) enhanced proteinEZassay Biotech. Co. Ltd.CAS-12E-001China
LED TransilluminatorLABGICBL-20China
Magnesium acetate, MgOAcTwistDxTABAS03KITUK
MicrocentrifugeallshengMini-6kChina
PCR strip tubesPCR strip tubesPST-0208-FT-CChina
TGrade Dry Bath IncubatorTiangen biochemical technology OSE-DB-01China
Tianamp Bacteria DNA KitTiangen biochemical technology DP302-02China
TIANamp Bacteria DNA Kit TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.; LTD.DP302 China 
TransStart FastPfu DNA Polymerase TransGen Biotech. Co. Ltd.AP221 China 
TwistAmp Basic KitTwistDXTABAS03KITUK
Universal DNA Purification KitTiangen biochemical technology DP214-03China
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Rapid and Specific Detection of Acinetobacter baumannii Infections Using a Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a-based System

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Zhang, X., Duan, M., Zhao, Y., Zhang, K., Liu, F., Jie, J., Li, C., Chen, D., Li, D., Hua, S., Wang, C., Guan, Q., Wu, J., Liu, B., Song, L. Rapid and Specific Detection of Acinetobacter baumannii Infections Using a Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a-based System. J. Vis. Exp. (218), e67542, doi:10.3791/67542 (2025).
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