방법 논문

제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

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DOI:

10.3791/67616

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2025년 1월 24일

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1State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Faculty of Medicine and Life Sciences, Xiamen University, 2Technology Center, Shanxi Xinghuacun Fenjiu Distillery Co., Ltd., 3Research Unit of Cellular Stress of CAMS, Cancer Research Center of Xiamen University, Xiang'an Hospital of Xiamen University, School of Medicine, Xiamen University, 4Laboratory Animal Center, Xiamen University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서는 제브라피시 유충에서 형광 단백질 태그로 단백질을 라벨링하는 프로토콜을 제시하며, 이는 새로 개발 및 수정된 생체 내 시스템으로, 제브라피시의 저농도 단백질을 시각화하는 데 특히 유용합니다.

초록

CRISPR/Cas9 매개 knock-in(KI) 기술을 사용하면 초기 발달 단계의 투명성으로 인해 in vivo 이미징에 선호되는 모델 유기체인 제브라피시(Danio rerio)에서 형광 단백질 태깅을 쉽게 할 수 있습니다. 여기에서는 제브라피시 유충에서 고효율 형광 유전자 KI를 수행하기 위한 자세한 프로토콜, KI 설립자에 대한 신속한 스크리닝, 저농도 단백질 추적을 제공하며, 이는 제브라피쉬의 후속 생리병리학적 연구를 위한 중요한 기반을 마련할 것입니다. 현재 프로토콜에는 관심 유전자에 대한 sgRNA 설계, sgRNA 체외 전사, Cas9 mRNA 체외 전사, 가장 높은 효율을 가진 유전자에 대한 생체 내 sgRNA 스크리닝, 공여자 플라스미드 설계 및 구축, 제브라피시 유충의 미세 주입, KI 파운더 스크린 및 제브라피시 라이브 이미징을 위한 완전한 단계가 포함됩니다. 중요한 단계, 문제 해결 팁, 품질 관리 방법, 이 프로토콜의 장점 및 응용 프로그램이 포함되고 논의됩니다. 이 프로토콜은 저렴한 비용으로 빠르고 정확한 결과를 보장하며 여러 임상시험을 통해 검증되었습니다.

서론

잘 받아들여지는 모델 유기체로서, 제브라피쉬(Danio rerio)는 발달, 재생, 종양 형성, 감염 및 면역 등에 대한 과학 연구에 널리 사용됩니다 1,2,3,4,5. 제브라피쉬는 멜라닌 형성을 억제하고 제브라피시 유충을 비교적 오랜 기간 동안 투명하게 만드는 독성 화합물인 PTU(1-페닐 2-티오우레아)로 처리할 때 생체 내 라이브 이미징에 특히 적합합니다6. 캐스퍼7 및 크리스탈8과 같은 유전자 변형 투명 제브라피시 균주도 사용할 수 있어 성인이 될 때까지 실시간 시각화 및 혈통 추적이 가능합니다. 성체 물고기의 더 나은 라이브 시각화를 위해 색소 침착을 극복하기 위한 이러한 노력 외에도 우리의 연구는 형광 단백질 태깅을 보다 효율적이고 덜 인위적으로 만들기 위한 강력한 유전자 편집 전략을 개발하는 데 중점을 두고 있습니다.

CRISPR/Cas9 매개 미세상동성 매개 말단 결합(MMEJ) 기반 KI 기술은 상대적으로 높은 KI 효율로 인해 현재 제브라피시를 포함한 여러 유기체의 유전자 변형에 널리 적용되고 있습니다 9,10,11,12. 성공적인 생체 내 이미징을 달성하려면 두 가지 과제를 해결해야 합니다. 하나는 재조합 과정에 의해 도입된 indels 또는 흉터입니다. 다른 하나는 일부 타겟 유전자가 낮은 수준에서 내인성으로 발현되어 동시 발현 형광 태그의 신호가 약하고 in vivo 검출이 실패한다는 것입니다. 효율적이고 정확한 단백질 태깅을 목표로 하고 내인성 유전자 발현 수준의 간섭을 최소화하는 것을 목표로 하는 최근 연구에서는 형광 신호 증폭 "VH" 태깅 방법과 정제된 생식세포 스크리닝 워크플로우13을 결합한 최적화된 전략을 보고했으며, 이는 공여자 골격을 최적화하고 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및 형광 검증을 결합하여 발현이 낮은 유전자의 형광 라벨링에 더 적합하고 이전 방법보다 더 효율적입니다 가장 적은 시간과 노력 비용으로 생식세포 스크리닝을 구현합니다. 여기에서는 배아 준비 및 제브라피시 사육 단계, sgRNA 설계, sgRNA의 체외 전사, Cas9 mRNA의 체외 전사, 제브라피시 배아 미세주입, 가장 높은 효율을 가진 sgRNA에 대한 생체 내 스크리닝, 공여자 플라스미드 설계 및 구성, KI 제브라피시 유전형 분석, KI 생식세포 스크리닝, KI 제브라피시 이미징 및 표현형 분석 단계를 포함하여 보고된 방법에 대한 자세한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 최첨단 형광 라벨링 방법을 제공하는 이 올인원 프로토콜은 의심할 여지 없이 다양한 과학 분야에서 제브라피시를 사용한 연구를 촉진하고 다양한 학문적 배경을 가진 독자에게 도움이 될 것입니다.

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프로토콜

모든 제브라피시 사육 및 실험은 샤먼대학교 실험실 동물 관리 및 윤리 위원회(Laboratory Animal Management and Ethics Committee)에 의해 검토 및 승인되었으며, 샤먼대학교 실험실 동물 센터(Xiamen University Laboratory Animal Center)에서 정의한 동물 모범 사례를 엄격히 준수했습니다. 이 연구는 동물 사용에 대한 모든 관련 윤리 규정을 준수했습니다.

참고: 모든 성체 및 애벌레 제브라피쉬는 샤먼 대학교의 제브라피시 수족관 시스템에서 13/11시간의 라이트/다크 사이클로 28.5°C에서 표준 프로토콜에 따라 유지되었습니다. 배아는 통제된 인큐베이터(온도, 28 ± 0.5°C; 밝음, 13시간 빛/11시간 어두운 주기)의 배아 완충액(표 1)에 보관되었습니다. 모든 제브라피쉬에 대한 먹이 주기 및 일반 모니터링은 하루에 두 번(오전 9시와 오후 4시) 수행되었습니다. 이 연구에 사용된 야생형(WT) 균주는 튀빙겐(Tü)이었습니다.

1. 관심 유전자 선택 및 가이드 RNA 설계

  1. 관심 유전자의 정보를 알고 있습니다. 데이터베이스(https://zfin.org/)를 검색하고 유전자 변이의 수를 알고 있는지 확인합니다. 조작할 변이체를 결정하고 Ensembl(https://www.ensembl.org/ 블)에서 게놈 염기서열, cDNA 염기서열 및 코딩 염기서열(CDS)을 포함한 표적 유전자 정보를 다운로드할 수 있습니다. 염기서열에서 엑손, 인트론, UTR, 시작 코돈 및 정지 코돈을 표시합니다.
  2. 타겟 유전자의 stop codon(TAA, TAG 또는 TGA) 업스트림에서 200 bp 이하의 CDS를 sgRNA 타겟 영역으로 선택합니다.
    참고: DNA 염기서열분석을 통해 이 영역에 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)이 없는지 확인하는 것이 좋습니다.
  3. CRISPRscan 웹사이트(https://www.crisprscan.org/)를 사용하여 선택한 타겟 영역 내에서 후보 sgRNA를 설계하고 sgRNA 효율성을 예측할 수 있습니다.
    1. DNA 염기서열을 디자인 프레임에 입력합니다.
    2. species, off-targets의 max mismatch(es), endonuclease 및 promoter를 포함한 해당 정보를 선택합니다. 이 경우 Zebrafish-Danio rerio, No mismatch, Cas9-NGG 및 in vitro T7 promoter를 선택합니다.
    3. sgRNA 가져오기를 클릭하여 일부 sgRNA를 얻습니다. in vivo screen에 대해 CRISPRscan 점수가 높고 off-target 점수가 낮은 5-7개의 sgRNA를 선택합니다.
  4. sgRNA/Cas9 미세주입 후 knockout 효율을 검증하기 위해 후속 PCR 증폭, 효소 분해 검사 및 염기서열분석을 위해 생성물이 약 500bp인 sgRNA 타겟 부위 측면에 PCR 프라이머를 설계합니다. 업스트림 및 다운스트림 영역에서 약 20bp의 염기서열을 선택하고 GC 함량이 약 50%이고 Tm 값 범위가 50-55°C인지 확인합니다.
    참고: 조합을 수행해야 하는 경우 두 개의 업스트림 프라이머와 두 개의 다운스트림 프라이머를 설계하십시오.

2. sgRNA의 준비

참고: 일반적인 sgRNA scaffold sequence(그림 1)는 plasmid(Table of Materials)로 클로닝되었습니다.

  1. PCR은 표 2 및 표 3에 각각 나타난 프라이머 및 PCR 혼합물을 사용하여 T7 promoter-sgRNA conjugate sequence를 증폭합니다. 표 4에서 PCR 프로그램을 실행합니다. 런 겔 전기영동(아가로스 겔, TAE 완충액 내 1.2% 아가로스; TAE 버퍼 [표 1]; 200 볼트; 약 5분)을 PCR 산물 2μL로 사용하여 산물이 올바른지 확인합니다(MW는 약 150bp).
  2. 정제 키트(Table of Materials) 또는 제조업체의 지침에 따라 기타 시판되는 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제합니다.
    참고: 이제부터 RNase가 없는 시약과 재료를 사용해야 하며, RNase 오염을 방지하기 위해 특별한 주의를 기울여 절차를 수행해야 합니다(토론 참조).
    1. 결합 완충액을 PCR 산물에 5:1 부피 비율로 추가하고 혼합합니다. 2mL 수집 튜브에 넣은 컬럼에 혼합물을 적용합니다. 17,900 × g 에서 25 °C에서 1분 동안 원심분리기. 플로우스루(flow-through)를 버리고 컬럼을 동일한 수집 튜브에 다시 넣습니다.
    2. 세척 완충액 750μL를 컬럼에 추가하고 17,900×g에서 25°C에서 1 분 동안 원 심분리합니다. 플로우스루(flow-through)를 버리고 컬럼을 동일한 수집 튜브에 다시 넣습니다. 17,900 × g 에서 25 °C에서 2분 동안 원심분리기. 깨끗한 1.5mL 튜브에 컬럼을 넣습니다.
    3. 컬럼에 뉴클레아제가 없는 물 20μL를 추가하고 25°C에서 2 분 동안 17,900×g에서 원심분리하여 DNA를 용리하고 분광 광도계를 사용하여 농도를 측정합니다.
  3. Table of Materials의 T7 RNA 생산 시스템 또는 이에 상응하는 키트를 사용하여 정제된 DNA 250ng을 in vitro에서 전사합니다. RNase가 없는 작업 및 조건이 필요합니다.
    1. 표 3에 따라 PCR 튜브(RNase-free)에서 반응을 준비하고, 부드럽게 혼합한다. 37 °C의 금속 수조에서 2 시간 동안 배양합니다.
    2. 0.5 μL의 DNase I(RNase-free)을 넣고 부드럽게 혼합합니다. 37 °C의 금속 수조에서 15-20 분 동안 배양합니다.
    3. 에탄올 침전
      1. 각 반응에 RNase-free 물을 추가하여 최종 부피가 20μL에 도달하도록 하고 샘플을 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
      2. 100% 에탄올 50μL(2.5V, RNase-free)를 넣고 잘 섞은 후 얼음에 10분 동안 넣고 4°C에서 15 분 동안 21,000×g으로 원심분리합니다.
      3. 상층액을 버리고 펠릿을 500μL의 75% 에탄올(RNase-free)로 세척한 후 4°C에서 5 분 동안 21,000×g으로 원심분리합니다.
      4. 상등액을 버리고 금속 수조에서 펠릿을 45°C에서 건조시킨 후 RNase가 없는 물 40μL로 용해시킵니다.
        참고: KI의 경우 sgRNA가 LiCl 침전되어야 하지만(아래 참조) KO의 경우 필요하지 않습니다.
    4. 아가로스 젤을 실행합니다(아가로스 겔: TAE 완충액에 1.2% 아가로스; TAE 버퍼 [표 1]; 200 볼트; 약 5분)을 1-2 μL의 RNA로 사용하여 품질을 추정한 다음 분광 광도계를 사용하여 농도를 측정합니다.
      참고: sgRNA는 추가 사용을 위해 -20 °C 또는 -80 °C에서 보관할 수 있습니다.

3. Cas9 mRNA의 준비

  1. 제조업체의 지침에 따라 XbaI을 사용하여 Cas9 플라스미드(Table of Materials)의 효소 분해를 1.5시간 이상 수행합니다(반응 혼합물에 대해서는 표 3 참조). 겔 전기영동에 의한 시험(아가로스 겔: TAE 완충액 내 1.2% 아가로스; TAE 버퍼 [표 1]; 200 볼트; 약 10분)을 1μL로 사용하여 분해가 철저한지 확인합니다.
  2. sgRNA PCR 산물과 동일한 방식으로 산물을 정제합니다(단계 2.2.1-2.2.3). 여기서부터 RNase-free 재료 및 작업이 필요합니다.
  3. Cas9 mRNA의 체외 전사를 위해 T3 transcription kit(Table of Materials) 또는 이에 상응하는 kit를 사용하십시오.
    1. RNase-free PCR 튜브에서 표 3 에 따라 반응을 준비하고 부드럽게 혼합합니다. 37°C에서 2.5시간 이상 배양합니다.
    2. RNase-free Turbo DNase 1 μL를 추가하고 37 °C에서 15-20 분 동안 배양합니다.
    3. LiCl 강수량
      1. 샘플을 1.5mL 튜브로 옮기고 30μL의 LiCl(1.5V)을 첨가한 후 부드럽게 혼합합니다.
      2. 혼합물을 -20°C에서 약 30분 동안 넣은 다음 21,000× g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다.
      3. 상층액을 버리고 펠릿을 500μL의 75% 에탄올(RNase-free)로 세척한 후 4°C에서 5분 동안 21,000× g 으로 원심분리합니다.
      4. 상등액을 버리고 펠릿을 45°C에서 건조시킨 후 40μL의 RNase-free 물에 용해시킵니다.
  4. 분광광도계를 사용하여 Cas9 mRNA의 농도를 측정합니다. 아가로스 젤을 실행합니다(아가로스 겔: TAE 완충액에 1.2% 아가로스; TAE 버퍼 [표 1]; 200 볼트; 약 10분)을 RNA 1-2μL로 주입하여 농도와 품질을 확인합니다.
    참고: OD 260/280은 2.0 이상이어야 하며 농도는 1000ng/μL 이상이어야 합니다. Cas9 mRNA는 -20°C 또는 -80°C에서 보관하여 나중에 사용할 수 있습니다.

4. 미세주입 준비

  1. 제브라피시 준비: 미세주입 전날 밤, 건강한 암컷 제브라피시 한 마리와 건강한 수컷 제브라피시 두 마리를 짝짓기 수조에 넣고 칸막이를 사용하여 수컷과 암컷을 분리하여 짝짓기를 준비합니다.
  2. 4% 아가로스, 용해 완충액 및 배아 완충액(pH 8.0)을 준비합니다(표 1).
  3. 미세 주입을 위한 모세관 유리 바늘을 준비합니다(재료 표).
  4. 미세주입판 준비: 녹인 4% 아가로스 35mL를 10cm 페트리 접시에 붓고 플라스틱 틀을 부드럽게 놓아 쐐기 모양의 홈통을 만듭니다. 곰팡이를 부드럽게 두드려 기포를 피하십시오. 굳은 후 이중 증류수(ddw)를 넣고 나중에 사용할 수 있도록 플레이트를 4°C에 놓습니다.

5. 미세주입을 통한 sgRNA 효율 시험

  1. 미세주입 당일, RNase-free 환경에서 얼음 위에 표 5 에 나열된 대로 미세주입 혼합물을 준비합니다.
  2. RNase-free 피펫 팁(Table of Materials)을 사용하여 미세주입 용액을 바늘에 로드합니다. 거품을 가져오지 않도록 주의하세요.
  3. 장전된 바늘을 마이크로인젝터에 부착된 마이크로매니퓰레이터에 넣습니다. 뾰족한 핀셋으로 현미경 아래의 주사 바늘 끝을 자르고 바늘 끝을 부드럽게 꼬집어 부러뜨립니다. 그런 다음 바늘이 스테이지 마이크로미터와 모세관을 사용하여 정량화되는 1-nL 방울을 지속적으로 배출할 때까지 주입 압력을 조정합니다.
  4. 칸막이를 제거하고 물고기가 약 6분 동안 번식하도록 합니다. 1세포 단계 배아를 수집하여 배아 완충액이 들어 있는 페트리 접시에 이식합니다.
    1. 광학 현미경으로 배아의 건강 상태를 검사하고 수정되지 않은 난자나 찌꺼기를 제거합니다. 20개의 건강한 배아를 주입되지 않은 대조군으로 별도의 페트리 접시와 라벨에 따로 보관합니다.
  5. 작은 브러시를 사용하여 실온(RT)으로 예열된 미세주입판의 홈에 건강한 1세포 단계 배아를 옮기고 부드럽게 정렬합니다. 초과 버퍼를 제거합니다.
  6. 모든 후속 작업을 실체 현미경으로 수행합니다. 바늘 끝을 사용하여 동물 기둥이 바늘을 향하도록 배아의 위치를 부드럽게 조정합니다. 혼합용액 1nL를 동물 기둥에 주입합니다.
  7. 대략 100개의 배아를 주입하면 하나의 sgRNA에 충분합니다. 주입 후, 배아 완충액이 있는 6웰 플레이트에 배아를 부드럽게 헹굽니다. 접시를 28.5 °C 항온 인큐베이터에 넣습니다. 수정 후 약 10시간(hpf)에 실체 현미경으로 배아 발달을 검사하고 죽은 배아를 제거합니다.
  8. 24 hpf에서 유전형 분석을 위해 1.5 mL 튜브에 배아를 수집합니다(sgRNA당 3개의 튜브, 튜브당 5개의 배아). 여분의 물을 피펫으로 조심스럽게 버리고 각 튜브에 Proteinase K(최종 농도 0.5mg/mL)가 포함된 용해 완충액 100μL를 첨가한 다음 56°C에서 1시간 동안 배양한 다음 95°C에서 15분 동안 배양합니다.
  9. 에탄올 200μL(2V)를 넣고 잘 섞은 후 19,000× g 의 상온에서 10분간 원심분리한다.
  10. 상등액을 버리고 펠릿을 500μL의 70% 에탄올로 세척한 후 상온에서 3 분 동안 19,000×g으로 원심분리합니다.
  11. 상등액을 버리고 펠릿을 RT에서 건조시킨 다음 50μL의 ddw로 용해시킵니다. 그런 다음, 추출물 1 μL를 사용하여 PCR(표 3)에 대한 반응 혼합물을 준비합니다(PCR 프라이머의 경우 1.4단계 참조).
  12. 아가로스 젤을 실행합니다(아가로스 겔: TAE 완충액에 1.2% 아가로스; TAE 버퍼 [표 1]; 200 볼트; 약 10분)을 2μL의 PCR 산물로 사용하여 PCR이 성공적임을 확인한 다음 효소 분해(표 3)를 수행하여 sgRNA의 효율성을 확인합니다. 효소 소화 믹스를 부드럽게 섞습니다. 제조업체가 제안한 기간 동안 온도에서 배양하십시오.
  13. 소화된 제품에 대해 아가로스 젤을 실행합니다(아가로스 겔: TAE 완충액에 있는 1.2% 아가로스; TAE 버퍼 [표 1]; 200 볼트; 약 10분) 소화되지 않은 PCR 산물을 대조군으로 사용하여 소화가 발생하는지 여부를 확인합니다.
    참고: Cas9 절단 부위는 PAM의 약 3bp 상류에 있으므로 제한 효소 인식 부위는 PAM의 6bp 업스트림을 커버하는 데 가장 적합합니다. sgRNA 효율이 높으면 절단 및 잘못된 복구로 인해 인델이 발생하므로 제한 효소가 더 이상 절단 부위를 인식하지 못할 가능성이 높습니다. sgRNA가 비효율적이고 제한 효소 인식 부위가 손상되지 않은 경우 효소 분해가 정상적으로 발생할 수 있습니다. 아가로스 젤 전기영동을 통해 효소 분해가 발생했는지 여부를 구별할 수 있습니다.
  14. 적절한 제한 효소 검출 부위가 없는 경우 PCR 산물을 염기서열분석하고 TIDE(https://tide.nki.nl/)에 의한 sgRNA 효율을 분석합니다. PCR을 수행하고 대조군으로 WT 게놈 DNA를 시퀀싱하는 것을 잊지 마십시오.
    1. 웹사이트를 열고 TIDE 시작을 클릭합니다. Guide sequence 아래의 프레임에 sgRNA의 guide sequence를 입력합니다.
    2. Control Sample Chromatogram (.ab1 또는 .scf)에서 Browse를 클릭하여 WT control에 대한 염기서열분석 결과를 입력하고, Test Sample Chromatogram (.ab1 또는 .scf) 아래에 있는 Browse를 클릭하여 편집된 샘플에 대한 염기서열분석 결과를 입력합니다.
    3. 보기 업데이트를 클릭합니다. 웹사이트는 두 시퀀스 간의 차이에 대한 백분율을 제공합니다. 백분율이 클수록 sgRNA 효율이 높다는 것을 나타냅니다. knockout 효율이 80% 이상인 sgRNA는 후속 KI 시술에 적합합니다.

6. 형광 단백질 태깅을 위한 공여체 플라스미드 구조

  1. 그림 2와 같이 먼저 플라스미드로 클로닝한 다음 물고기 게놈에 추가로 삽입되는 염기서열 설계: 예측된 Cas9 절단 부위의 업스트림에 있는 25-bp 염기서열은 좌측 상동성암으로 설계되고, 예측된 Cas9 절단 부위의 다운스트림에 있는 25-bp 염기서열은 우측 상동성암으로 설계됩니다. sgRNA 타겟 부위와 기증자의 stop codon 사이에 CDS를 도입하여 내인성 유전자의 무결성을 유지합니다.
    참고: 보완된 CDS( 그림 2의 요소 4)의 5'는 sgRNA/Cas9 복합체에 의한 재조합 게놈의 2차 절단을 피하기 위해 동의어로 돌연변이화되어야 합니다.
  2. 공여체 플라스미드 구축을 위해 엑소뉴클레아제 III(Table of Materials)을 사용하여 결찰 독립 클로닝(LIC)14을 사용합니다. Gibson 어셈블리와 같은 다른 방법도 가능합니다. 클로닝 프라이머는 그림 2에 설명되어 있습니다. 원소 "1", "2", "3" 및 "4"는 프라이머에 의해 전달됩니다.
    1. Design Primer F1은 벡터, 요소 "1" 및 요소 "2"의 일부와 겹치는 시퀀스로 구성됩니다.
    2. Design Primer R2는 요소 "1", 요소 "2" 및 요소 "3"의 일부로 구성됩니다.
    3. sgRNA 타겟 부위를 따르는 CDS의 원소 "3", "4" 및 5' 서열로 구성된 Design Primer F2.
    4. 유전자 CDS의 3' 염기서열과 벡터와의 중첩 염기서열로 구성된 설계 Primer R1.
    5. 제브라피시 cDNA를 주형으로 사용하고 프라이머를 사용하여 PCR을 수행합니다.
      참고: 프라이머 사이 또는 프라이머와 벡터 사이의 권장 겹치는 15-20bp입니다. 이러한 primer는 target-gene specific적이며, cx39.9 및 cx44.1 에 대한 primer의 예가 표 2에 나와 있습니다. 이 설계는 앞서 설명한 바와 같이 성공적으로 적용되었습니다13. 상세한 플라스미드 맵은 Supplementary File 1 및 Supplementary File 2에 제공되어 있습니다. cx39.9 및 cx44.1 의 설계된 DNA 및 단백질 서열은 보충 파일 3에 제공되어 있습니다.
    6. sgRNA PCR 산물과 동일한 방식으로 PCR 산물을 정제합니다(단계 2.2.1-2.2.3).
  3. donor 벡터(그림 3 및 표 6)를 적절한 제한 효소로 분해합니다. 이 예에서 효소는 PciI 및 Acc65I(Table of Materials)입니다. 제조업체의 지침에 따라 수행하십시오(표 3). sgRNA PCR 산물과 동일한 방식으로 분해된 donor 벡터를 정제합니다(단계 2.2.1-2.2.3).
  4. DNA 겔 전기영동(DNA 겔: TAE 완충액 내 1.2% 아가로스; TAE 버퍼 [표 1]; 200 볼트; 약 10분). 표 3에 따라 LIC에 대한 반응 혼합물을 준비한다.
    알림: 반응의 모든 튜브와 구성 요소는 얼음 위에 놓아야 하며 반응 및 모든 조작은 얼음 위에서 수행해야 합니다. 1 μL의 Exo III(20 단위)를 마지막 성분으로 반응에 첨가한 다음 즉시 위아래로 피펫팅하여 모든 성분을 잘 혼합합니다. 분해된 벡터의 자체 어닐링 가능성을 보여주기 위해 PCR 단편이 없는 하나의 반응 혼합물을 대조군으로 포함하는 것을 잊지 마십시오.
  5. 즉시 반응 혼합물을 얼음 위에 놓고 60분 동안 배양합니다.
  6. 0.5 M EDTA (pH 8.0) 1 μL를 첨가하여 반응을 중지하고 위아래로 피펫으로 잘 섞은 다음 60 °C에서 5 분 동안 배양 한 다음 얼음에서 5 분 동안 배양합니다.
  7. LIC 제품을 사용하여 DH5α와 같은 유능한 세포를 형질전환시키고 적절한 항생제(이 경우 암피실린)로 LB 플레이트(재료 표 및 표 1)에서 박테리아를 16시간 동안 성장시킵니다.
  8. PCR 단편 함유 플레이트의 콜로니 수와 제어 플레이트의 콜로니 수 사이에 큰 차이가 있는지 확인합니다. 효소 분해 분석 및 DNA 염기서열분석을 위해 LIC 플레이트에서 단일 콜로니를 골라냅니다.
  9. sgRNA PCR 산물과 동일한 방식으로 정제 키트로 올바른 donor plasmid를 추출하고 정제합니다(단계 2.2.1-2.2.3). 최종 농도가 300ng/μL 이상인지 확인합니다.

7. 유전자 KI를 위한 제브라피쉬 배아의 미세주입

  1. 표 7에 따라 미세주입 용액을 준비하는 것을 제외하고 위에서 설명한 모든 미세주입 조작을 수행합니다.

8. 형광 단백질 표지 자손의 스크리닝 및 식별

  1. microinjection 후 12-48시간 후에 실체 형광 현미경으로 형광을 관찰합니다.
  2. 새로 확립된 스크린 방법 적용13. 명백한 형광이 관찰되면 형광 유충을 골라서 기르십시오. 형광의 흔적만 관찰되거나 형광이 관찰되지 않으면 주입된 모든 유충을 후방화하십시오.
  3. 생후 1개월이 되면 0.02% 트리카인이 미세주입된 제브라피시를 마취합니다(표 1). 각 제브라피쉬에 대해 꼬리 지느러미의 작은 조각을 라벨이 부착된 PCR 튜브에 모으고 해당 마취된 제브라피시를 동일한 라벨의 UV 살균 여과수(pH 7.2)가 들어 있는 6웰 플레이트의 한 웰에 보관합니다.
  4. 게놈 DNA 추출을 위해 알칼리 용해 방법( 표 1의 용해 완충액)15 을 사용한 다음 5' 접합 PCR을 사용합니다. 왼쪽 상동성 암의 상류에 포워드 프라이머를 설계하고 인서트에 리버스 프라이머를 설계합니다(그림 4). PCR 산물의 크기는 약 500bp입니다. 프라이머의 예는 표 2를 참조하십시오.
    참고: 형광 제브라피쉬의 경우 이 PCR을 사용하여 KI의 정확도를 검증하므로 PCR 산물을 염기서열분석(sequencing)합니다. 형광이 없는 제브라피쉬의 경우 이 PCR을 사용하여 KI가 발생하는지 여부를 확인합니다. PCR 양성 물고기를 골라 F0로 성체로 키웁니다.
  5. GFP 발현 패턴에 대해 스크리닝된F0를 WT와 짝짓기하여 얻은F1 배아를 검사하고 접합 PCR에 의해 유전형을 분석합니다.
    참고:F1 에서 타겟 삽입이 발생하는 경우(완벽하든 그렇지 않든), 해당F0 는 유전성F0로 정의되며, 그 PCR 산물은 이어서 염기서열분석됩니다. 삽입이 정확하면 해당F0 는 원하는F0로 정의됩니다.
  6. 원하는F0 가 얻어지면 표적 단백질을 관찰하고 추적하기 위해 자손을 이미징에 사용합니다.

9. 이미징 및 데이터 처리

  1. 이미징할 발달 단계를 결정합니다. 물고기를 미리 준비하십시오. 희석된 1-페닐 2-티오우레아(PTU; 0.003%, 재료 표)를 물고기에 첨가하여 필요한 경우 색소를 제거합니다.
    참고: PTU는 24hpf 이후에 적용하면 효과가 떨어집니다. 이 예시에서, PTU는 24 hpf 이전에 배아 완충액에 추가되었고, 제브라피시 유충이 이미징을 위해 처리되었을 때 48 hpf까지 완충액에 보관되었습니다.
  2. 35mm 접시에 녹인 4% 아가로스 2mL(표 1)를 넣고 응고시키기 위해 따로 둡니다. 물고기를 0.02% 트리카인을 함유한 배아 완충액으로 옮깁니다(표 1).
  3. 용융된 4% 아가로스 200μL를 ddw 1mL에 희석합니다. 아가로스가 식었을 때 1mL 피펫을 사용하여 마취된 생선을 희석된 아가로스로 옮깁니다. 물고기 장착 아가로스를 부드럽게 혼합하여 9.2단계에서 준비한 응고된 4% 아가로스 젤이 들어 있는 접시에 옮깁니다.
  4. 관심 부분이 맨 위에 오도록 물고기를 배치합니다.
  5. 제조업체의 지침(Table of Materials)에 따라 이미징 및 데이터 처리를 위해 직립 컨포칼 형광 현미경을 사용하십시오.

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결과

커넥신(connexin)이라고 하는 고분자 단백질로 구성된 간극연접(gap junction)은 접촉 세포 간의 저분자량 대사 산물과 이온의 교환에 필수적입니다. 위에서 설명한 형광 단백질 태깅 방법을 사용하여 각각 커넥신 39.9 (그림 5A) 및 커넥신 44.1 (그림 5B)을 라벨링했습니다. 올바른 KI는 접합 PCR에 의해 검증되었습니다(그림 6). 발표된 데이터16에 따라 모든 F1 자손의 근육에서 유전 가능한 특정 형광이 관찰되었으며, 이는 커넥신 39.9 의 성공적인 GFP 라벨링을 나타냅니다(그림 5A). 이전 보고서와 일치하게17, 모든F2

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토론

이 실험을 원활하고 성공적으로 수행하려면 몇 가지 중요한 측면에 더 많은 주의를 기울여야 합니다. 주사를 위한 최적의 제브라피시 발달 단계는 단세포 단계여야 합니다. 이 단계에서 주입을 완료하면 후속 분열을 통해 생성된 모든 세포에 KI에 필요한 성분이 포함되어 있음을 확인할 수 있으므로 모든 세포에서 동시 KI 발생 확률을 높이고 전반적인 KI 성공률을 높일 수 있습니다. 주변 온도를 낮추면 제브라피시 배아 발달이 느려질 수 있다18. 그러나 배아를 낮은 온도에 장기간 노출시키면 폐사율이 증가합니다. 따라서 배아를 얼음이나 차가운 홀더에 직접 올려 놓아서는 안 되며 저온에서 너무 오래 보관해서도 안 된다는 점을 강조합니다. 대신, 배아 발달을 약간 늦추기 위해 상대적으로 낮은 주변 온도(16°C)를 유지하여 가능한 한 빨리 주입을 위한 충분한 시간을 확보합니다. 일반적으로 약 100개의 배아에 대한 주사는 30분 이내에 완료...

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공개 사항

모든 저자는 이 논문에 대해 어떠한 경쟁 이해관계도 선언하지 않습니다.

감사의 글

이 원고를 교정하고 편집해 주신 Lu Zhou(Xiamen University)에게 감사드립니다. 이 연구는 중국 국가자연과학재단(National Natural Science Foundation of China, J.H.에 82388201 31801158 보조금), 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2020YFA0803500 to J.H.), CAMS Innovation Fund for Medical Sciences(CIFMS) (2019-I2M-5-062 to J.H.), 푸젠성 중앙 지역 과학 및 기술 개발 특별 프로그램(2022L3079 to J.H.), 및 FuXia-Quan Zi-Chuang 지구 협력 프로그램(3502ZCQXT2022003에서 J.H.로). 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1000 &마이크로; 엘  팁모든 브랜드N/A모든 조작용
1.5 mL 튜브모든 브랜드N/A다양한 용액의 보관 및 원심분리용
1.5 mL 튜브(RNase-free)모든 브랜드N/ARNase-free 용액의 저장 및 원심분리용
10 µ L 팁모든 브랜드N/A모든 조작에 대해
10 &마이크로; L 팁 (RNase-free)모든 브랜드N/ARNase-free 조작용
1000 µ 엘  팁 (RNase-free)모든 브랜드N/ARNase-free 조작용
1-페닐 2-티오우레아 (PTU)시그마P7629멜라닌 형성을 억제하고 유충을 투명하게 유지하기 위해
200 &마이크로; L 팁모든 브랜드N/A모든 조작에 대해
200 &마이크로; L tips (RNase-free)Any brandN/ARNase-free manipulations
2x Taq Plus Master Mix II (Dye Plus)VazymeP213-03PCR sgRNA 효율 테스트용
35mm dishCorning430165
6-well platesAny brandN/A제브라피쉬를 개별적으로 또는 임시로 사육하기 위해
Acc65INEBR0599S 효소 분해
아세트산시그마695092TAE 완충액 준비용
AgarBiofroxx8211GR500LB 플레이트용
암피실린, 나트륨 염SangonA610028LB 플레이트용
CaCl2SigmaC5080배아 완충액 준비용
모세관Harvard Apparatus30-0016주입용 바늘 생성용
캐필러리 튜브모든 브랜드ID (내경) = 0.1 mm1-nL 드롭릿 정량화용
CRISPRscanCRISPRscan  http://www.crisprscan.org/sgRNA 디자인
DH5&alpha를 위해;TIANGENCB101변형용
EDTA시그마E6758용해 완충액 및 TAE 완충액 준비용
EnsemblEnsembl  https://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index유전자 정보를 찾으려면
에탄올HUSHI64-17-5DNA 정제 및 추출용
엑소뉴클레아제 IIITakara2170A
LIC 가스 구동 마이크로 주입기워너 인스트루먼트PLI-100A마이크로 주입
용 젤 전기영동 시스템WIXWIX-EP3000젤용 전기 영동
장갑모든 브랜드N / A모든 조작 포도
당sgdbio10010518LB 플레이트 용
글리세롤SangonA501745LB 플레이트
용 gRNA-pMD19-T중국 제브라 피쉬 자원 센터 (CZRC)CZP3sgRNA 플라스미드 함유 sgRNA 스캐폴드
KClSigmaP5405배아 용 완충액 준비
염화리튬 침전 용액ThermofisherAM9480sgRNA의 침전, RNase-free
저 융점 아가로 스SangonA6000154 % 아가 로스 겔 제조
용 황산 마그네슘sgdbio20025118LB 플레이트 용
금속 목욕모든 브랜드N / A항온 배양 용
메틸렌 블루시그마M9140배아 완충액 준비용
Microinection 금형수제N/A마이크로주입 중 배아를 보관하기 위한 홈을 생성하기 위해
Microloader, Femtotips 및 기타 유리 마이크로캐필러리를 채우기 위한 팁, 멸균, 0.5 – 20 &마이크로; L, 100mm, 라이트 그레이, 192개 (2 랙 &횟수; 96 개)Eppendorf5242956003RNase-free
마이크로피펫 풀러Sutter InstrumentP-97주입용 바늘 생성용
마이크로피펫EppendorfN/A모든 조작용
MicrowaveAny brandN/A주입판 및 아가로스 겔 주조용
MinElute PCR 정제 키트 (50)QIAGEN28004PCR 산물 및 분해 산물을 정제하기 위해, RNase-free
mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription KitInvitrogenAM1348In-vitro transcription of Cas9 mRNA, RNase-free
N2Any brandN/A미세주입용
NaClSigmaS5886배아 완충액 및 용해 완충액 준비용
NaHCO3sub>SigmaS5761배아 완충액 제제용
NaOHSangonA100173TAE 완충액 제제용
뉴클레아제가 없는 물ThermofisherR0581RNA 관련 조작, RNase-free
PciINEBR0655S효소 분해
PCR 기계Any brandN/APCR 증폭
PCR 스트립 튜브모든 브랜드N/APCR의
경우 PCR 튜브FEITONGKANGblp-200PCR
페트리 접시경우 모든 브랜드N/A제브라피시 유충 사육용 등
페놀 레드시그마P0290미세주입용, RNase-free
피펫 홀더Warner InstrumentsPLI-PH1미세주입용
PrimeStar (Premix)TakaraDR040A분자 복제용
Proteinase KMerck539480게놈 DNA 추출용
pT3TS (T3:zCas9-UTRglobin)중국 제브라피시 자원 센터(CZRC)CZP11Cas9 플라스미드 템플릿
냉장 원심 분리기모든 브랜드N / ARNA 관련 원심 분리
스케일SartoriusBCE124-1CCN주조 주입 플레이트 및 아가 로즈 젤
가위모든 브랜드N / A성인 물고기 꼬리 자르기 용
SDSSangonA600485용해 완충액 준비
작은 브러시모든 브랜드N/A미세주입판에서 부드럽게 움직이는 배아용
분광광도계ThermofisherNanoDrop 2000DNA/RNA 농도 측정용
스테이지 마이크로미터모든 브랜드DIV (Division) = 0.01 mm1-nL 액적 정량화용
실체 형광 현미경OlympusSZX16유전자 발현 관찰용
실체 현미경MoticSMZ-168관찰 및 미세 주입용
T7 RiboMAX Express 대규모 RNA 생산 시스템PromegaP1320sgRNA의 체외 전사, RNase-free
온도 제어 인큐베이터모든 브랜드N/A배아 배양
TIDETIDEhttps://tide.nki.nl/sgRNA 효율 분석용 
트리카인 메탄 설포 네이시그마A5040트리카인 용액 제제
TrisSangonA600194트리카인 용액, 용해 완충액 및 TAE 완충 제
톤OXOIDLP0042LB 플레이트 용
핀셋모든 브랜드N / A주사 바늘 절단 용
XbaINEBR0145S효소 용 소화
효모 추출물OXOIDLP0021LB 플레이트용
제브라피쉬 수족관 시스템ESENESEN-AW-S1성체 물고기 사육용
제브라피쉬 짝짓기 탱크(칸막이 포함)모든 브랜드N/A물고기 짝짓기용
Zeiss LSM 900+Airyscan2ZEISSLSM900형광 표지 물고기의 컨포칼 이미징 및 데이터 분석용
ZFIN 웹 사이트ZFINhttp://zfin.org/유전자 정보를 찾으려면
이미징용 용 의 트 트립

참고문헌

  1. Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53 (5-6), 835-850 (2009).
  2. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
  3. Haraoka, Y., Miyake, M., Ishitani, T. Zebrafish imaging reveals hidden oncogenic-normal cell communication during primary tumorigenesis. Cell Struct Funct. 48 (1), 113-121 (2023).
  4. Gomes, M. C., Mostowy, S. The case for modeling human infection in zebrafish. Trends Microbiol. 28 (1), 10-18 (2020).
  5. Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).
  6. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Mar Biotechnol (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  7. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  8. Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Sci Rep. 6, 29490(2016).
  9. He, M. D., et al. Efficient ligase 3-dependent microhomology-mediated end joining repair of DNA double-strand breaks in zebrafish embryos. Mutat Res. 780, 86-96 (2015).
  10. Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Sci Rep. 5, 8841(2015).
  11. Luo, J. J., et al. CRISPR/Cas9-based genome engineering of zebrafish using a seamless integration strategy. FASEB J. 32 (9), 5132-5142 (2018).
  12. Wierson, W. A., et al. Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells. Elife. 9, e53968(2020).
  13. Liu, J., et al. Optimal tagging strategies for illuminating expression profiles of genes with different abundance in zebrafish. Commun Biol. 6 (1), 1300(2023).
  14. Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Res. 25 (20), 4165-4166 (1997).
  15. Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR based protocol for detecting indel mutations induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in zebrafish. PLoS One. 9 (6), e98282(2014).
  16. Hirata, H., et al. Connexin 39.9 protein is necessary for coordinated activation of slow-twitch muscle and normal behavior in zebrafish. J Biol Chem. 287 (2), 1080-1089 (2012).
  17. Cason, N., White, T. W., Cheng, S., Goodenough, D. A., Valdimarsson, G. Molecular cloning, expression analysis, and functional characterization of connexin44.1: a zebrafish lens gap junction protein. Dev Dyn. 221 (2), 238-247 (2001).
  18. Urushibata, H., et al. Control of developmental speed in zebrafish embryos using different incubation temperatures. Zebrafish. 18 (5), 316-325 (2021).
  19. Yu, D., et al. Cyclic digestion and ligation-mediated PCR used for flanking sequence walking. Sci Rep. 10 (1), 3434(2020).

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