Acinetobacter baumannii에서 형광 기반 T6SS 활성 검출 방법의 확립 및 비교

Summary

여기에서는 임상 균주의 고처리량 분석에 적합한 박테리아 T6SS의 활성을 효율적이고 정확하게 평가하기 위해 형광 표지(특히 Luciferase)를 기반으로 하는 정량적 검출 방법을 제안합니다.

Abstract

VI형 분비 시스템(T6SS)은 그람 음성 박테리아, 특히 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii )와 같은 병원성 종에서 세포 간 상호 작용을 매개하는 중요한 메커니즘입니다. 이전 연구에서는 A. baumannii ATCC 17978 균주의 대형 플라스미드 pAB3가 핵심 T6SS 유전자의 발현을 억제하는 TetR 유사 단백질을 암호화하는 것으로 나타났습니다. 대조적으로, pAB3가 결핍된 WT^R- 균주는 T6SS effector protein Hcp를 안정적으로 발현하고 분비할 수 있으며 E. coli를 사멸시키는 능력을 나타냅니다. T6SS의 핵심 유전자 중 하나인 tssM 유전자는 그 활동에 필수적입니다. 삭제는 T6SS의 비활성화로 직접 이어집니다. 그러나 killing assay와 같은 기존의 T6SS 활성 검출 방법은 처리량이 낮고 감도가 충분하지 않습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 당사는 형광 표지를 기반으로 하는 정량적 검출 방법을 개발했습니다.

T6SS 활성 검출을 개선하기 위해 세 가지 형광 라벨링 방법을 개발했습니다: (1) 높은 특이성, 민감도 및 재현성을 특징으로 하는 Luciferase 라벨링을 기반으로 하는 정량적 검출 방법으로 고처리량 분석에 적합합니다. (2) 녹색 형광 단백질(GFP) 라벨링을 기반으로 하는 검출 방법은 환경 간섭에 취약함에도 불구하고 높은 처리량의 이점을 제공합니다. (3) 유세포 분석 검출은 박테리아 생존력을 정량적으로 평가할 수 있지만 운영이 복잡하고 비용이 많이 듭니다. 종합적인 비교 결과, Luciferase 기반 라벨링 방법이 가장 정확하고 민감하며 사용자 친화적인 것으로 입증되었습니다. A. baumannii의 임상 분리 20건에 적용했을 때, 이 방법은 T6SS 활성을 빠르고 정확하게 평가할 수 있는 것으로 확인되었습니다.

Introduction

유형 VI 분비 체계 (T6SS)는 그람 음성 박테리아에 있는 중요한 단백질 분비 체계, 세균 경쟁, 진핵 생물 숙주에 대한 길항작용, 및 숙주 면역 반응의 규칙 ^1,2. T6SS는 독성 effector 단백질을 이웃 박테리아 또는 진핵 세포에 주입함으로써 박테리아가 복잡한 환경에서 경쟁 우위를 유지하도록 돕습니다. 최근 몇 년 동안 박테리아 적응성, 병원성 및 미생물 상호 작용에서 T6SS의 중요한 역할로 인해 특히 다제내성 병원체에서 연구 핫스팟이 되었으며, 그 기능은 새로운 항균 전략 개발을 위한 잠재적 표적을 제공합니다 ^3,4,5.

아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii, Ab)는 병원 환경에 널리 분포하는 그람 음성 기회감염 병원체입니다. 높은 약물 내성과 강한 적응성으로 인해 전 세계적으로 중요한 병원 병원체가 되었습니다 ^6,7,8. 복잡한 미생물 환경에서 A. baumannii의 생존은 여러 분비 시스템에 의존하며, 그 중 T6SS는 다른 미생물과의 경쟁 및 숙주와의 상호 작용에서 중요한 역할을 합니다. 고도로 보존된 T6SS 유전자 클러스터와 잘 정의된 기능을 갖춘 A. baumannii는 T6SS 메커니즘을 연구하기 위한 이상적인 모델이 되었습니다. 또한, A. baumannii에서 T6SS의 독특한 구조는 T6SS의 다양성과 기능을 더욱 밝힐 수 있는 독특한 관점을 제공합니다.

A. baumannii의 T6SS 유전자 클러스터는 12개의 핵심 단백질 유전자(예: tssJ가 없는 tssA-tssM)와 기능을 알 수 없는 여러 유전자(예: tagX, tagN, tagF 등)를 포함합니다.^2,9,10입니다. 그 중 용혈 공동 조절 단백질(Hcp)은 T6SS의 중요한 구성 요소이며, 그 분비는 기능적 T6SS의 특징으로 간주됩니다. 연구에 따르면 A. baumannii의 대형 플라스미드 pAB3는 TetR과 유사한 조절 단백질을 암호화하여 T6SS 발현을 억제합니다. 대조적으로, pAB3를 상실한 균주(예: WT^R-)는 Hcp를 안정적으로 발현하고 분비할 수 있어 상당한 T6SS 활성을 나타낼 수 있습니다¹¹. tssM 유전자는 T6SS의 핵심 유전자 중 하나이며, 이 유전자의 결실은 T6SS의 비활성화로 직접 이어집니다.

그러나 기존의 T6SS 활성 검출 방법(예: killing assay)은 낮은 처리량, 낮은 재현성 및 불충분한 민감도와 같은 한계가 있어 T6SS의 심층 연구와 광범위한 적용을 심각하게 제한합니다⁵. 따라서 효율적이고 정확한 T6SS 활동 감지 방법의 개발은 현재 연구에서 시급한 요구가 되었습니다. 본 연구는 기존 방법의 단점을 극복하기 위해 형광 표지를 기반으로 T6SS 활성 검출 방법을 수립하고 비교하는 것을 목표로 합니다. 형광 라벨링 기술을 통해 T6SS 활성에 대한 실시간 정량적 모니터링을 달성하여 박테리아 상호 작용 연구를 위한 보다 정확하고 신뢰할 수 있는 도구를 제공합니다. 이 연구는 형광 표지 방법의 효과를 검증했으며, 다양한 형광 표지 전략의 장단점을 비교함으로써 향후 연구를 위한 새로운 관점과 방법론적 지원을 제공했습니다. 이는 T6SS 연구를 위한 새로운 기술적 수단을 제공할 뿐만 아니라 박테리아 상호 작용의 복잡한 메커니즘을 이해하고 새로운 항균 치료 전략을 개발하기 위한 과학적 기반을 마련합니다.

Protocol

1. 균주 및 플라스미드의 공급원

1. A . baumannii 표준 균주 ATCC 17978, E. coli(pZY01) 및 길림대학교 제1병원 진단검사의학과에서 분리한 A. baumannii 의 임상 균주를 사용합니다.
2. 실험실에서 변형 및 보존된 플라스미드 pZY01-GFP( A. baumannii에서 안정적으로 발현할 수 있는 카나마이신 내성 유전자 보유)와 시판된 플라스미드 pGEN-luxCDABE(암피실린 내성 유전자 보유)를 사용합니다.
3. 50 mM 인산칼륨 완충액 (pH 7.4), 15 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0.2% (w/v) 숙신산 나트륨을 유일한 탄소원으로 하고, 0.01% (w/v) 효모 추출물을 포함하는 Luria-Bertani (LB) 배지 또는 최소 배지에서 A. baumannii 및 E. coli를 배양하십시오¹². 필요한 경우 다음 농도의 항생제를 추가하십시오 : 대장균 : 암피실린 (100 μg / mL) 및 카나 마이신 (50 μg / mL); A. baumannii: 스트렙토마이신(100μg/mL).
   참고: 대장균 (pZY01) 및 대장 균(pZY01-GFP)은 카나마이신 내성을 나타냅니다. 대장균 (pZY01)에는 형광 표지자가 없으므로 다음 텍스트에서 대장 균이라고 할 수 있습니다.

2. 실험 전 박테리아 균주의 준비

1. 실험 2일 전에 -80°C 냉동고에서 박테리아 균주를 회수합니다. 해당 항생제가 포함된 LB 한천 플레이트에 박테리아 균주를 접종합니다. 플레이트를 37 ° C에서 밤새 배양하십시오.
   참고: 실험 시작 시 모든 세포가 플라스미드를 유지하는지 확인하십시오.
2. 실험 1일 전에 각 박테리아 균주의 두 개의 독립적인 단일 콜로니를 선택합니다. 각 콜로니를 5mL의 LB 액체 배지를 포함하는 두 개의 개별 튜브에 개별적으로 접종합니다. 200rpm으로 진탕하면서 37°C에서 밤새 배양물을 배양합니다. 후속 실험에 이러한 배양을 사용합니다.
   참고: 적절한 양의 박테리아 바이오매스를 얻을 수 있도록 박테리아 성장 속도에 따라 배양 시간을 최적화합니다.

3. 대장균 (GFP)/ 대장균 (루시페라제) 균주의 제조

1. 변형
   1. 50ng의 플라스미드 DNA(pZY01-GFP 또는 pGEN-luxCDABE, A260/A280에서 NanoDrop을 통해 정량화)를 각각 100μL의 E. coli DH5α 수용 세포에 넣고 부드럽게 혼합합니다.
   2. 얼음 위에서 30분 동안 배양하고 42°C에서 60초 동안 열 충격을 가한 다음 즉시 얼음 위에 30초 동안 놓습니다.
   3. 700μL의 무항생제 LB 육수를 넣고 37°C에서 180rpm으로 2시간 동안 진탕하면서 배양합니다.
2. 도금 및 배양
   1. 420 × g 에서 2분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고 세포 펠릿을 100μL의 무항생제 LB 육수에 재현탁합니다.
   2. pZY01(GFP) 형질전환 산물을 50μg/mL 카나마이신이 함유된 LB 한천 플레이트에 펴 바릅니다.
   3. pGEN-luxCDABE 형질전환 산물을 100μg/mL 암피실린이 함유된 LB 한천 플레이트에 펴 바릅니다. 37 °C에서 밤새 배양합니다.
3. 양성 클론 확인
   1. 단일 콜로니를 선택하고 다음날 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR) 템플릿으로 추출합니다. PCR 증폭을 수행하고 아가로스 겔 전기영동으로 확인합니다.
   2. 양성 균주를 확인하고 E. coli (GFP) 및 E. coli (Luciferase)로 표시합니다.
      참고: 효율적인 형질전환을 위해 유능한 세포의 품질이 높은지 확인하십시오. 단일 콜로니 격리에 대한 간섭을 방지하기 위해 도금 중 과도한 박테리아 액체를 피하십시오.

4. 웨스턴 블로팅

1. 시료 전처리
   1. 박테리아 배양물과 원심분리기(1500 × g, 10분, 4 °C)를 수집하여 세포 펠릿과 상층액을 분리합니다.
   2. 세포 펠릿과 상층액 모두에 적절한 양의 로딩 버퍼를 추가합니다. 금속 수조에서 100°C로 10분 동안 끓입니다. 원심분리기(1500g, 10분, 4°C)를 사용하여 상층액을 단백질 샘플로 수집합니다.
   3. 비신초닌산(BCA) 또는 브래드포드 방법을 사용하여 단백질 농도를 측정하고 동일한 농도로 조정합니다.
2. 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)
   1. 적절한 농도의 SDS-PAGE 젤을 준비합니다(예: 12% 분리 젤, 5% 스태킹 젤)¹³.
   2. 20μg의 단백질 샘플을 1-2μL의 사전 염색된 단백질 마커와 함께 겔 웰에 로드합니다. 브로모페놀 블루 지시약이 겔 바닥에 도달할 때까지 100-120V에서 전기영동을 수행합니다.
      참고: 러닝 버퍼: Tris 25mM, 글리신 192mM, SDS 0.1%(w/v), 증류수에서 1L까지.
3. 전송(웨스턴 블로팅)
   1. 유리판에서 젤을 제거하고 전사 완충액에 담그십시오. 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 또는 니트로 셀룰로오스(NC) 멤브레인을 준비하고 메탄올로 PVDF 멤브레인을 활성화한 다음 전사 버퍼에 담급니다.
      참고: 전송 버퍼: 25mM 트리스, 192mM 글리신, 20% 메탄올
   2. 전사 장치를 "샌드위치" 구조(여과지-겔-멤브레인-여과지)로 조립합니다. 100V에서 60-90분 동안 전송합니다(단백질 분자량에 따라 시간 조정; 숙주 세포 단백질(HCP)의 분자량은 약 17kDa)입니다.
      알림: 이송 탱크를 얼음물에 넣고 얼음 팩을 넣어 낮은 온도를 유지하십시오. 이송 시간이 길면 중간에 얼음 팩을 교체하십시오.
4. 블로킹
   1. 옮긴 후, 멤브레인을 5% 탈지 우유 차단 용액에 넣습니다. 셰이커에서 실온(RT)에서 1시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 블록합니다.
5. 1차 항체 배양
   1. 0.1% Tween 20(TBST) 완충액을 함유한 Tris-buffered saline(TBS)으로 멤브레인을 매번 5분씩 3회 세척합니다. 희석된 1차 항체(마우스 anti-Hcp 항체, 1:1000 희석, 마우스 anti-isocitrate dehydrogenase(ICDH) 항체, 1:1000 희석)으로 멤브레인을 4°C에서 하룻밤 또는 2시간 동안 RT로 배양합니다.
6. 2차 항체 배양
   1. TBST 버퍼로 멤브레인을 각각 5분씩 3회 세척합니다. RT에서 2시간 동안 희석된 2차 항체(Horseradish peroxidase[HRP]-conjugated anti-mouse IgG, 1:3000 dilution)로 멤브레인을 배양합니다.
7. 탐지
   1. TBST 버퍼로 멤브레인을 각각 5분씩 3회 세척합니다. ECL 화학발광 기질을 준비하고 멤브레인에 고르게 도포합니다.
   2. 화학발광 이미징 시스템을 사용하여 신호를 감지하고 이미지를 캡처합니다(HCP 단백질의 분자량은 약 17kDa, ICDH는 A. baumannii에서 예상 분자량이 약 45kDa인 세포질 대사 효소).
      참고: ICDH는 상층액 분획(분비된 단백질 포함)이 아닌 세포 펠릿 분획(온전한 박테리아 포함)에서만 검출할 수 있는 중요한 품질 관리 마커로, 샘플 준비 중에 세포 용해가 발생하지 않았음을 입증합니다. Hcp 분비(17kDa)는 T6SS 활성 균주의 상층액에서만 볼 수 있어야 합니다.

5. LB 한천 배지를 사용한 96웰 플레이트의 준비

1. 예열된 오토클레이브 무항생제 LB 한천 배지를 웰당 50μL의 멸균 96웰 플레이트에 빠르게 첨가합니다. 매체의 완전한 응고를 보장하기 위해 플레이트를 최소 1시간 동안 RT에 놓으십시오.
2. GFP 형광을 검출하기 위해 바닥이 투명한 검은색 벽의 플레이트를 사용하십시오.
3. Luciferase 형광을 검출하기 위해 내광성 96웰 플레이트를 사용하여 cross-well 형광 간섭을 방지할 수 있습니다.
   참고: 최적의 박테리아 접촉 및 성장을 촉진하는 균일한 겔 두께를 보장하기 위해 매체를 추가할 때 기포를 생성하지 마십시오.

6. A. baumannii 살해 분석

1. 표준 사멸 분석
   1. 배양 WT^R- 및 ΔtssM 돌연변이 균주를 37°C에서 하룻밤 동안 100μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 LB 배지에서 진탕하고 동일한 조건에서 50μg/mL 카나마이신을 함유하는 LB 배지에서 E. coli 를 별도로 성장시킵니다.
   2. 박테리아 배양액을 멸균 PBS로 두 번 세척하고 새로운 무항생제 LB 배지에 재현탁합니다. 표준화를 위해 OD₆₀₀ 을 1.0으로 조정합니다.
   3. WT^R- 및 ΔtssM 돌연변이 균주를 E. coli 와 1:1 비율로 혼합합니다.
   4. 10μL의 혼합 박테리아 현탁액을 항생제가 없는 LB 한천 플레이트에 배치하고 37°C에서 6시간 동안 배양합니다.
   5. 박테리아 반점을 긁어내고 PBS 1mL에 재현탁합니다. 10배 연속 희석을 5회 수행합니다.
   6. 카나마이신을 함유한 LB 플레이트에 희석된 박테리아 현탁액 10μL를 발견하고 37°C에서 밤새 배양합니다.
   7. 콜로니 카운팅을 통해 WT^R- 및 ΔtssM 돌연변이 균주의 T6SS 의존성 항균 활성을 분석합니다.
      알림: 실험 오류를 방지하기 위해 박테리아 현탁액을 철저히 혼합하십시오. 데이터 신뢰성을 보장하기 위해 각 샘플에 대해 최소 3번의 독립적인 반복실험을 수행합니다.
2. 루시페라제 라벨링을 사용한 T6SS 활성의 정량적 검출
   1. E. coli(Luciferase), WT^R-, ΔtssM 돌연변이 및 기타 균주(예: ATCC 17978, E. coli, Ab#40, Ab#170, Ab#180)의 OD₆₀₀을 1.0으로 표준화합니다. 항생제가 없는 LB 한천이 들어 있는 96웰 플레이트에 5μL의 박테리아 현탁액을 추가합니다. 어두운 곳에서 자연 건조한 후 루시페라아제 기반 생물 발광을 측정하여 E. coli(Luciferase)의 발광 특이성을 확인합니다.
   2. E. coli(Luciferase)의 5배 연속 희석을 수행합니다. 10μL의 희석된 박테리아 현탁액을 LB 한천이 있는 96웰 플레이트와 빈 96웰 플레이트(둘 다 내광)가 있는 플레이트에 스폿합니다. 루시퍼라제 기반 생물 발광을 측정하여 루시페라제 기반 검출 방법의 감도를 평가하고 LB 한천이 발광 신호를 방해하는지 여부를 확인합니다.
   3. E. coli(Luciferase)를 WT^R-, ΔtssM 돌연변이 및 20개의 임상 균주(OD₆₀₀은 1.0으로 표준화)와 1:1 비율로 혼합합니다. 10배로 희석하고 96웰 플레이트에 5μL를 첨가한 다음 3개의 기술 반복을 설정합니다.
   4. 어둠 속에서 자연 건조시킨 후 생물 발광을 측정합니다. 37 ° C의 어두운 곳에서 4-6 시간 동안 배양 한 다음 생물 발광을 다시 측정합니다 (방출 파장 : 562 nm).
   5. 공동 배양 전과 후의 생물 발광 값을 비교하여 T6SS 의존성 항균 활성을 정량적으로 평가합니다.
      알림: 실험 오류를 방지하기 위해 박테리아 현탁액을 철저히 혼합하십시오. 데이터 신뢰성을 보장하기 위해 각 샘플에 대해 최소 3번의 독립적인 반복실험을 수행합니다. 통계 분석을 위해 스튜던트의 t-검정을 사용합니다.
3. GFP 라벨링을 사용한 T6SS 활성 검출
   1. Luciferase 라벨링 실험과 동일한 절차를 따릅니다(여기 파장: 480nm, 방출 파장: 509nm).
   2. 대장균(GFP)과 WT^R- 및 ΔtssM 돌연변이체(OD₆₀₀, 1.0으로 표준화)를 1:1 비율로 혼합합니다. 10μL를 항생제가 없는 LB 한천 플레이트에 부착합니다. RT에서 공기 건조 후 다기능 이미징 시스템의 GFP 형광 채널(Alex488 프로그램, 여기: 488nm, 방출: 509nm)을 사용하여 이미지를 캡처합니다.
   3. 37°C의 어둠 속에서 4-6시간 동안 배양한 다음 이미지를 다시 캡처합니다. 박테리아 반점의 형광 강도 변화를 기반으로 T6SS 활성을 평가합니다.
      알림: 형광 신호의 간섭을 피하기 위해 어둠 속에서 모든 단계를 수행하십시오. 실험 오류를 방지하기 위해 박테리아 현탁액의 철저한 혼합을 보장합니다. 데이터 신뢰성을 보장하기 위해 각 샘플에 대해 최소 3번의 독립적인 반복실험을 수행합니다.
4. 유세포 분석 검출
   1. WT^R- 과 대장균 (GFP) 및 ΔtssM 돌연변이체와 대장 균(GFP)을 1:1 비율로 혼합합니다. 적당량의 혼합 박테리아 현탁액을 취하여 멸균 PBS 또는 1× 완충액을 사용하여 적절한 농도(일반적으로 0.1-0.5의 OD₆₀₀ )로 희석합니다.
      참고: 1× buffer는 유세포 분석 염색 완충액(1×)을 의미하며, 성분은 다음과 같습니다: 1× PBS(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na₂HPO₄, 1.8mM KH_2PO4, pH 7.4), 보충: 2-5%(v/v) 열 불활성화 FBS(또는 대안으로 1% BSA), 2mM EDTA.
   2. 희석된 혼합 박테리아 현탁액을 300 x g 에서 2분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 펠릿을 1mL의 멸균 PBS 또는 1× 완충액에 재현탁하고 부드럽게 혼합합니다. 35μm 세포 스트레이너를 통해 재현탁 용액을 여과하여 응집체를 제거하고 단일 세포 현탁액을 보장합니다.
   3. 유세포 분석기를 켜고 레이저를 예열하고 기기를 보정합니다.
      1. 검출 매개변수 설정: 488nm 레이저를 사용하여 GFP를 자극합니다. 검출 채널: FL1(일반적으로 GFP 형광 검출을 위한 530/30nm 필터). 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC) 매개변수를 설정하여 박테리아 세포를 구별합니다.
      2. 표지되지 않은 대장균 을 음성 대조군으로 사용하고, 전압과 이득을 조정하고, GFP 음성 집단이 형광 신호의 기준선에 있는지 확인합니다.
   4. 여과된 샘플을 부드럽게 혼합하고 100μL를 유세포 분석 튜브로 옮깁니다.
      1. 다음 기기 설정을 사용하여 샘플을 분석합니다. 파편을 제외하려면 FSC-H 임계값을 19,000으로 설정하고 게인 값은 100(FSC), 110(SSC) 및 80(FITC)입니다.
      2. 게이팅의 경우, 먼저 FSC-A 대 SSC-A 산점도에서 파편 및 비표적 신호를 제외한 다음 FITC 채널에서 모집단 분석을 수행합니다. 각 샘플에 대해 대상 모집단(FSC/SSC 특성에 의해 정의됨)에서 최소 10,000개의 이벤트를 획득합니다.
   5. 유세포 분석 소프트웨어(예: FlowJo, BD FACSDiva)를 사용하여 데이터를 분석합니다.
      1. FSC 대 SSC 산점도를 플롯하여 대상 박테리아 집단을 게이트합니다. FL1 형광 히스토그램을 플로팅하여 GFP 양성 및 GFP 음성 집단을 구별합니다.
      2. GFP 양성 세포의 비율과 평균 형광 강도(MFI)를 계산합니다.
   6. 남은 혼합 박테리아 현탁액을 300g에서 2분 동안 원 심분리하고 상층액을 버립니다. 펠릿을 10μL의 멸균수에 재현탁시키고 항생제가 없는 LB 한천 플레이트에 놓습니다.
   7. 37 ° C에서 5 시간 동안 어둠 속에서 배양 한 다음 박테리아 반점을 긁어 내고 500 μL의 1× PBS에 재현탁시킵니다. 재현탁액 100μL를 취하여 적절하게 희석한 후 6.4.4-6.4.5 단계를 반복하여 유세포 분석 검출을 수행합니다.
   8. 공동 배양 전과 후의 GFP 양성 세포와 형광 강도의 비율을 비교합니다. 대장균(GFP)에 대한 WT^R- 및 ΔtssM 돌연변이의 사멸 효과를 평가합니다.
      알림: 검출 결과에 영향을 미치는 세포 응집을 방지하기 위해 단일 세포 현탁액을 확인하십시오. 형광 신호의 정확성과 재현성을 보장하기 위해 검출 전에 기기를 보정하십시오. GFP 형광 소멸을 방지하기 위해 실험 중 샘플을 강한 빛에 노출시키지 마십시오. 데이터 신뢰성을 보장하기 위해 각 샘플에 대해 최소 3번의 반복을 수행합니다.

Results

T6SS 활성을 검출하는 전통적인 방법은 일반적으로 항생제가 없는 LB 한천 플레이트에서 포식자와 표적 균주를 5시간 동안 공동 배양한 다음 박테리아 반점을 긁어내고 재현탁시킨 다음 연속 희석을 수행하는 것입니다. 그런 다음 희석된 박테리아 현탁액을 선택적 한천 플레이트에 검출합니다. 다음날 플레이트에서 대상 균주의 콜로니를 계수하여 T6SS 활성을 정성적으로 평가할 수 있습니다. 그러나 이 방법은 번거로운 절차, 수동 콜로니 계수에 대한 의존도, 정량 분석의 어려움 등 한계가 있습니다. 이러한 단점을 해결하기 위해 본 연구는 형광 기반의 정량 검출 방법을 혁신적으로 도입합니다. 구체적으로, 표적 균주(예: E. coli)를 형광 단백질(GFP 또는 루시페라제)로 라벨링하고 포식자와 표적 균주를 1:1 비율로 혼합한 후 희석했습니다. 공동 배양 전과 후, 혼합된 박테리아 현탁액의 형광 값을 측정하고, 그림 1과 같이 형광 값의 변화를 기반으로 T6SS 활성을 ...

Discussion

Type VI 분비 시스템(T6SS)은 주로 effector 단백질의 분비를 통해 기능이 실현되는 복잡한 다중 단백질 기계입니다. 이러한 효과기 단백질은 다른 박테리아 종을 죽이거나 억제함으로써 박테리아 간 경쟁을 중재함으로써 숙주 박테리아가 미생물 군집에서 경쟁 우위를 갖도록 합니다¹⁵. 연구에 따르면 T6SS는 경쟁에서의 역할 외에도 박테리아 집락화, 환경 적응, 생물막 형성, 접착 변형 및 면역 회피를 포함한 다양한 세포 과정에 관여하는 것으로 나타났습니다¹⁶. 특히, T6SS 기능의 조절은 전사 수준, 전사 후 수준, 번역 후 수준에서 복잡한 메커니즘을 포함하는 다층적입니다¹⁷.

T6SS 연구 분야에서는 Acinetobacter calcoaceticus 와 Aci...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10%, 15% SDS-PAGE 젤 준비 키트	Epizyme	PG112-20
° C 냉장고	Haier	HYCD-290
37 ° C 인큐베이터	Bluepard	181254254
4 ° C 냉장고	Haier	HYC390-80
° C Freezer	Haier	DW-86L726G(726L)
96-well plate	JET	TCP010096
Agar	Biofrox	8211KG001
과황산암모늄 (APS)	Thermo	7727-54-0
생물 안전 캐비닛	ESCO	AC2-4S1
Electronic Balance	Sartorius AG	BSA124S-CW
전기영동 장치	BIO-RAD	POWER
Flake Ice Machine	GRANT	XB70
유세포분석기	BECKMAN COULTER	AW38143
유세포 분석 염색 버퍼	proteintech	PF00018
Gel Imaging System	BIO-RAD	Gel Doc 2000
Glycine	Zike	ZK-L2577
고속 원심분리기	Eppendorf	5405IN106358
HRP-conjugated Rabbit/Mouse Secondary Antibody	proteintech	SA00001-2
LB Broth	Solarbio	L8291
저온 고속 원심분리기	Thermo	17R
메탄올	온도	R40121
마이크로 UV-Vis 분광 광도계	열	Nanodrop 하나의
마이크로 원심분리기	allsheng	Mini-6k
마이크로플레이트 리더	Bio-Tek	H1M
NuPAGE LDS 샘플 버퍼	Thermo	NP0007
인산염 버퍼 용액(PBS)	Zike	ZK-L1649
정밀 플러스 단백질 이중 색상 표준	Bio-Rad	1610374
SDS 샘플 로딩 버퍼	Beyotime	poo15L
탈지 분유	온도	LP0033B
도데실황산나트륨(SDS)	Zike	zk6885
온도 조절 수조	JingHong	DK-420S
전송 장치	Bio-Rad	PowerPac HC
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	Zike	ZK-L2557
수직 전기영동 장치	Bio-Rad	Mii-PROTEAN Tetra