반복적 표백은 핵심 시설에 염색 자동화를 사용하여 다양성을 확장합니다.

요약

여기에서는 상업적으로 이용 가능한 자동 조직 염색기를 활용하는 IBEX(Iterative Bleaching Extends Multiplicity) 방법의 적용과 티라마이드 신호 증폭 기반 시약 사용에 대한 최적화 고려 사항을 설명합니다.

초록

IBEX(Iterative Bleaching Extends Multiplicity)는 고감도 티라마이드 신호 증폭(TSA) 기반 다라운드 형광 이미징 기술로, 반복적인 표백, 재염색 및 이미지 공동 등록을 통해 단일 조직 샘플에서 수많은 단백질 생체 분자를 자세히 검사할 수 있습니다. 고도로 다중화된 면역염색을 생성하기 위한 채택이 증가하고 있음에도 불구하고 핵심 시설에 배치하여 자동화된 방식으로 IBEX를 구현하면 처리량 증가, 재현성 및 실험실 직원의 전반적인 효율성 등 다양한 이점을 얻을 수 있습니다. 여기에서는 널리 활용되는 두 가지 자동 염색기 플랫폼에서 IBEX의 성공적인 적용을 시연하고 포르말린 고정, 파라핀 포매(FFPE) 조직 샘플에 대한 TSA 기반 반응을 사용하는 패널 설계에 대한 중요한 최적화 고려 사항에 대해 논의합니다. 여기에는 항체 개발 순서를 결정할 때 IBEX 패널 설계에 중요한 고려 사항인 항체-항원 회수 민감도를 테스트하는 방법론이 포함됩니다. 또한 시중에서 판매되는 전체 슬라이드 스캐너를 활용하는 다운스트림 이미징 접근법을 선보이고 상업적으로 이용 가능한 세포 표현형 분석을 사용하여 품질 정렬 및 분석을 보여줍니다. 이러한 방법론에 대한 자세한 설명과 함께 제공되는 비디오를 통해 우리는 IBEX의 다양성과 용이성을 강조하고 핵심 병리학 시설이 IBEX를 기존 자동 염색 플랫폼에 통합할 수 있는 실용적인 지침을 제공하는 것을 목표로 합니다.

서론

IBEX(Iterative Bleaching Extends Multiplicity)는 고감도 TSA 기반 다라운드 형광 면역조직화학의 중요한 발전으로, 단일 조직 샘플 내에서 수많은 생체 분자를 상세하게 시각화하고 정량화할 수 있습니다. IBEX는 표백 및 재염색의 반복 주기를 사용함으로써 비교할 수 없는 깊이와 선명도로 복잡한 세포 환경을 검사할 수 있어 면역염색 및 다중화 이미징 분야에서 강력한 도구가 됩니다 ^1,2.

많은 학계, 정부 및 산업 기관은 정성적 및 정량적 형태분자 데이터 세트 생성을 목표로 하는 다양한 조직 기반 연구 방법론을 지원하는 데 전념하는 핵심 병리학 시설을 호스팅합니다. 이러한 코어는 연구실이 복잡하고 노동 집약적인 분자 병리학 프로세스를 아웃소싱하고 연구 설계, 분석 개발 및 데이터 해석에서 병리학자와 직접 상담할 수 있도록 하는 전문 조직 기반 서비스를 제공하는 중요한 리소스입니다. 일관성을 보장하고 실험 전반에 걸쳐 변동성을 줄이기 위해 이러한 핵심 시설은 높은 재현성과 효율성으로 표준화된 염색 프로토콜을 수행하도록 설계된 상업적으로 이용 가능한 자동 염색기 자동화 기기에 일상적으로 의존합니다³.

자동 염색기는 핵심 시설에서 면역염색의 중추가 되어 높은 처리량과 일관된 결과를 가능하게 했지만 아직 IBEX와 같은 최신 발전을 수용하도록 조정되지 않았습니다. 또한, 특히 티라마이드 신호 증폭(TSA) 기반 시약^을 사용할 때 패널 설계에 대한 전문 지식의 필요성4은 복잡성을 추가하여 일상적인 연구 워크플로에서 IBEX의 광범위한 채택을 제한합니다. 결과적으로 IBEX의 고해상도 다중화 이미징 기능을 활용하려는 연구원은 핵심 시설의 기존 장비로 인해 제한되는 경우가 많습니다. 혁신적인 이미징 기술과 핵심 시설 운영의 실제 현실 사이의 이러한 격차는 학술 연구에서 IBEX를 광범위하게 채택하는 데 장벽을 강조합니다. 이 연구는 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직을 사용하는 TSA 기반 시약의 사용에 초점을 맞춰 일반적인 자동 염색기 플랫폼에서 IBEX의 성공적인 적용을 시연함으로써 이러한 장벽을 해결하는 것을 목표로 합니다. 먼저 TSA 기반 염료를 사용하여 IBEX 패널을 구축하는 데 필요한 단계와 이러한 패널을 상업적으로 이용 가능한 두 가지 다른 자동 염색기에 적용하는 방법에 대해 설명합니다. 이는 항체-항원 검색 민감도 테스트에 대한 실용적인 지침을 제공하고, 패널 설계 최적화를 위한 주요 고려 사항에 대해 논의하고, 핵심 병리학 실험실을 통해 사용 가능한 상용 소프트웨어를 사용하여 패널 정렬을 위한 대체 방법을 제공합니다.

프로토콜

1. TSA 기반 염료를 사용한 IBEX 패널 구축

참고: 항상 항체 및 염료의 신선한 제제를 사용하고 사용하지 않을 때는 4°C에서 보관하십시오.

1. 항원 회수 민감도 검사
   1. 슬라이드 준비
      1. 마이크로톰을 사용하여 각 항체에 대해 3개의 연속 섹션을 수집하여 동일한 FFPE 포매 조직에서 3개의 별도 양전하를 띤 슬라이드로 테스트합니다.
      2. 테스트할 항원 회수 주기 수(1주기, 3주기 및 6주기)와 함께 테스트할 항체가 포함된 라벨 슬라이드.
      3. 슬라이드를 실온에서 밤새 건조시킵니다. 표면 마커로만 작업하는 경우 슬라이드를 60 ^°C에서최소 20분 동안 굽어 왁스를 부드럽게 합니다. 핵 마커로 작업하는 경우 슬라이드를 60 ^°C에서밤새 굽습니다.
   2. 다양한 주기 수에 대해 자동 염색기의 프로그램을 준비하고 각 단계 사이에 세 가지 세탁 단계가 있는지 확인합니다. 1, 3 및 6 사이클 테스트에 대한 프로토콜의 예는 표 1 을 참조하십시오.
      참고: 각 개별 항체에 대해 항체 단계 및 TSA 염료 적용에 대한 일관된 시간을 보장합니다.
      TSA 기반 염료 적용의 경우, 염료를 실온에서 3-10분 동안 방치시키는 대신 염료를 37°C에서 20분 동안 배양하는 것입니다.
   3. 샘플을 자동 염색기에 로드하고 관련 사이클 수에 대해 프로토콜을 실행합니다.
   4. 검증 및 테스트할 각 개별 항체에 대해 1.1.1단계부터 1.1.3단계까지 이 과정을 반복합니다.
   5. 자동 염색기에서 슬라이드를 제거하고 PBS에 넣습니다.
   6. 최적의 이미징을 위해 수성 마운팅 매체(IBEX 라운드와 동일)와 #1.5 커버슬립으로 슬라이드를 장착합니다.
   7. 낙산화형광 현미경을 사용하여 TSA 염료 및 DAPI에 대한 1주기 슬라이드를 이미지화하고 신호를 시각화하는 데 필요한 노출 시간을 기록해 둡니다.
   8. 3주기 및 6주기 슬라이드에 대해 이 작업을 반복하고 TSA 염료를 시각화하는 데 필요한 노출 시간을 기록합니다.
   9. 다양한 사이클 번호의 노출 시간을 비교합니다. 예제는 그림 1 을 참조하십시오. 모든 단계 사이에 세 번의 세탁 주기를 확인하십시오.
      1. 주기가 증가함에 따라 노출 시간이 감소하면 이 항체를 배치하고 나중에 염색합니다.
      2. 주기가 증가함에 따라 노출 시간이 증가하면 이 항체를 이전 단계에 배치합니다.
      3. 노출 시간에 큰 변화가 없으면 이 항체를 임의의 단계에 배치하십시오.
      4. IBEX 패널에서 초기 통과를 위한 주기 요구 사항에 따라 항체를 그룹화합니다.
         참고: 최상의 결과를 얻으려면 지정된 IBEX 패널에 대해 원하는 모든 마커에 대해 이 유효성 검사를 수행합니다. 조직 유형이 변경될 때마다 또는 고유한 로트 번호를 가진 다클론 1차 항체로 작업할 때 이 검증을 수행합니다.
2. 신호 강도 평가를 통해 스펙트럼적으로 가까운 염료에서 나오는 신호의 블리드스루를 해결합니다.
   1. 항체를 위에서 결정한 바와 같이 최적의 검색 주기 수에 따라 잠재적인 IBEX 패널로 그룹화하여 1, 3 또는 6 주기 그룹으로 그룹화합니다.
   2. 슬라이드 준비
      1. 마이크로톰을 사용하여 FFPE 샘플에서 단일 IBEX 패널에서 사용할 각 항체에 대해 하나씩 연속 절편을 만듭니다.
      2. IBEX 패널에서 사용할 항체 중 하나로 각 슬라이드에 라벨을 붙입니다.
      3. 슬라이드를 실온에서 밤새 건조시키십시오. 표면 마커로만 작업하는 경우 슬라이드를 60 ^에서굽습니다 o C 왁스를 부드럽게 하기 위해 최소 20분 동안 굽습니다. 핵 마커로 작업하는 경우 슬라이드를 60 ^°C에서밤새 굽습니다.
   3. 1, 3 및 6 사이클 그룹의 경우 표 1의 1사이클 설정을 사용합니다. 모든 단계 사이에 세 번 세탁하십시오.
      1. 최적의 염색 시간으로 사용할 각 항체에 대한 프로토콜을 수정합니다.
      2. 모든 항체에 대해 동일한 TSA 시간을 사용합니다.
   4. 자동 염색기에 샘플을 염색합니다.
   5. 샘플을 제거하고 슬라이드를 PBS에 넣습니다.
   6. 최적의 이미징을 위해 수성 마운팅 매체(IBEX 라운드와 동일)와 #1.5 커버슬립으로 슬라이드를 장착합니다.
   7. 각 이미지에 대한 최적의 노출 시간을 사용하여 낙산화형광 현미경에서 슬라이드를 이미지화합니다.
   8. 신호 강도를 결정합니다. 노출 시간이 짧은 슬라이드는 신호 강도가 매우 높은 반면, 노출 시간이 긴 슬라이드는 신호 강도가 낮습니다.
   9. 사이클 번호와 함께 신호 강도를 사용하여 IBEX 패널을 개발합니다.
      1. 주기 번호를 기준으로 항체를 그룹화합니다.
      2. 특정 주기 번호를 가진 주어진 항체 그룹의 경우 신호 유출을 최소화하기 위해 강한 신호가 약한 신호에 광학적으로 가깝지 않은지 확인하십시오.
3. 개별 IBEX 패널의 유효성을 검사하여 각 패널이 원하는 결과를 생성할 수 있는지 확인합니다.
   1. 슬라이드를 준비합니다.
      1. 마이크로톰을 사용하여 각 멀티플렉스 IBEX 패널에 대해 하나씩 직렬 섹션을 만들고 사용할 IBEX 패널 순서로 레이블을 지정합니다.
      2. 슬라이드를 실온에서 밤새 건조시키십시오. 표면 마커로만 작업하는 경우 슬라이드를 60 ^에서굽습니다 o C 왁스를 부드럽게 하기 위해 최소 20분 동안 굽습니다. 핵 마커로 작업하는 경우 슬라이드를 60 ^°C에서밤새 굽습니다.
   2. 자동 염색기를 설정합니다.
      1. 첫 번째 패널의 경우 추가 항원 검색 단계 없이 자동 염색 프로그램을 설정합니다.
      2. 두 번째 패널의 경우, 첫 번째 항체 앞에 첫 번째 패널의 변성 단계 수와 동일한 추가 변성 단계를 도입합니다. 5개의 항체를 갖는 예시적 패널 1에 대해서는 표 2 를 참조하고, 4개의 항체를 갖는 예시적 패널 2에 대해서는 표 3 을 참조한다. 모든 단계 사이에 세 가지 세탁 단계를 확인하십시오.
      3. 추가 IBEX 패널에 대해 필요에 따라 반복하여 더 많은 변성 단계를 추가합니다.
   3. 자동 염색기에서 슬라이드를 제거하고 장착할 준비가 될 때까지 PBS에 넣습니다.
   4. 최적의 이미징을 위해 수성 마운팅 매체(IBEX 라운드와 동일)와 #1.5 커버슬립으로 슬라이드를 장착합니다.
   5. 각 이미지와 각 TSA 염료에 대한 최적의 노출 시간을 사용하여 낙산화 형광 현미경에서 슬라이드를 이미지화합니다.
   6. 모든 패널이 제대로 표시되는지 평가합니다. 그렇다면 IBEX 이미징으로 이동하십시오. 그렇지 않은 경우 신호 밸런싱 및 검색 주기를 다시 지정합니다.
      알림: 신호를 최적화하고 "우산 효과"를 방지하기 위해 단일 패널 내에서 일부 조정을 수행할 수 있습니다. 일부 매우 풍부한 신호는 다운스트림 신호의 염색을 차단할 수 있습니다. 주어진 패널 내부를 살펴보면 먼저 더 드물게 존재하는 염색을 사용합니다( 그림 2 참조).

2. TSA 시약 및 전체 슬라이드 이미징 플랫폼을 사용하는 자동 염색기를 사용한 IBEX 적응(그림 3)

참고: 이 프로토콜에서 사용 및 논의된 두 가지 검증된 자동 염색제의 비교는 표 4를 참조하십시오.

1. IBEX 실행을 위한 모든 슬라이드를 준비합니다.
   1. 마이크로톰을 사용하여 양전하를 띤 슬라이드에 FFPE 섹션을 만듭니다. 각 실험 샘플에 대해 하나의 슬라이드, 이미징할 항원을 포함하는 것으로 알려진 조직 절편의 양성 대조군 슬라이드, 모든 1차 항체 대신 PBS를 사용하는 음성 대조군 슬라이드를 포함해야 합니다.
      참고: 배치로 작업하는 경우 배치 대조군 샘플을 포함하십시오. 배치 대조군 샘플은 염색 샘플 배치 간의 실험 변동을 정규화 및 제어하는 데 사용하기 위해 절편되어 실험 샘플의 각 배치에 포함된 단일 FFPE 조직 블록입니다. 이는 모든 샘플이 함께 처리되지 않는 경우에만 필요합니다.
   2. 슬라이드를 실온에서 밤새 건조시키십시오. 표면 마커로만 작업하는 경우 슬라이드를 60 ^에서굽습니다 o C 왁스를 부드럽게 하기 위해 최소 20분 동안 굽습니다. 핵 마커로 작업하는 경우 슬라이드를 60 ^°C에서밤새 굽습니다.
2. 이미징할 첫 번째 IBEX 패널을 위한 항체와 염료를 준비합니다.
3. 자동 염색 프로그램을 설정합니다. 5마커 패널의 예는 표 2 를 참조하십시오. 각 단계 사이에 세 번 세탁하십시오.
4. 샘플과 항체를 자동 염색기에 로드하고 프로그램을 실행하여 샘플을 염색합니다.
5. 자동 염색기에서 슬라이드를 제거하고 다중 스펙트럼 이미징에 적합한 수성 마운팅 매체와 #1.5 커버슬립을 사용하여 커버슬립을 도포합니다.
6. 염색 후 2일 이내에 슬라이드를 이미지화합니다.
7. epifluorescence 또는 형광 슬라이드 스캐너의 형광 이미징
   1. 잘 제어된 양성 대조군 샘플부터 시작하여 양성 대조군 샘플을 현미경에 넣습니다.
      1. 이미징할 각각의 다른 항원에 대해 샘플에서 양성 신호를 찾습니다.
      2. 노출 시간을 설정하여 낮은 노출에서 시작하여 신호가 나타날 때까지 노출 시간을 점차적으로 늘려 배경을 최소화하면서 얼룩의 다이내믹 레인지를 캡처할 수 있습니다. 각 염료에 대해 개별적으로 이 작업을 수행합니다.
         알림: 전체 동적 범위를 캡처하기 위해 마커의 높은 발현과 낮은 발현이 모두 존재하는지 테스트합니다.
   2. 양성 대조군 샘플에 사용된 설정을 저장하고 모든 추가 이미징 단계에 사용합니다.
   3. 양성 대조군 샘플에 의해 결정된 설정을 사용하여 음성 대조군 샘플과 모든 실험 샘플을 로드하고 이미지화합니다.
   4. 후속 단계를 진행하기 전에 이미지의 품질이 최적인지 확인하세요.
8. 커버슬립 제거
   1. DI 물과 함께 Coplin 용기에 슬라이드를 담그십시오. 커버슬립을 자연스럽게 제거할 수 있도록 Coplin 용기를 65°C로 설정된 수조에 15-20분 동안 넣습니다. 또는 수성 기반 마운팅 매체를 사용하거나 마운팅 매체가 완전히 경화된 경우 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 DI 물에 밤새 담가 커버슬립을 제거하여 커버슬립이 자연적으로 떨어지도록 합니다.
9. LiBH₄로 표백
   1. 흄 후드에서 DI 물에 1mg/mL 농도의 LiBH₄ 신선한 용액을 준비합니다. 각 샘플을 3배 이상 덮을 수 있을 만큼 충분히 만듭니다.
      참고: LiBH₄ 와 물의 반응으로 인해 한 번에 10mL 이상을 준비하지 마십시오. 최적의 표백 활성을 위해 밀리포어/나노순수가 아닌 DI 물을 사용하십시오.
   2. 용액을 20분 동안 그대로 둡니다. 거품이 형성됩니다.
   3. 1mL의 LiBH₄ 용액을 퓨므 후드의 염색 챔버에 있는 각 슬라이드에 피펫팅합니다. 용액을 슬라이드 위에 10-15분 동안 그대로 두십시오.
   4. 슬라이드에서 피펫팅하여 LiBH₄ 를 제거하고 새 LiBH 4 1mL로 교체합니다_. 용액을 10-15분 동안 그대로 둡니다.
   5. 슬라이드에서 피펫팅하여 LiBH₄ 를 제거하고 새 LiBH 4 1mL로 교체합니다_. 용액을 10-15분 동안 그대로 둡니다.
   6. 피펫팅을 통해 슬라이드에서 LiBH₄ 를 제거하고 단기 보관(1일 이내)을 위해 슬라이드를 DI 물 또는 PBS에 담그십시오.
   7. 하루 안에 다음 IBEX 염색 라운드로 넘어갑니다.
   8. 옵션: 습식 마운트 슬라이드를 사용하고 epifluorescence 스코프에서 빠른 시각화를 수행하여 표백 성공을 확인합니다.
10. 자동 염색기에 슬라이드를 습식 장착하고 두 번째 IBEX 염색 실행
    1. 자동 염색기를 위한 모든 항체 및 TSA 염료 용액을 준비합니다.
    2. Ventana 자동 염색기의 경우:
       1. 자동 염색을 시작할 준비가 되면 약 1mL의 자동 염색기 세척 완충액을 슬라이드에 피펫팅하여 젖은 마운트에서 건조되는 것을 방지합니다.
       2. 습식 장착 슬라이드를 자동 염색기에 넣습니다.
    3. 본드 Rx의 경우:
       1. 슬라이드에 커버 타일을 놓습니다.
       2. 커버타일 상단에서 300μL의 세척 완충액을 피펫팅하여 용액이 샘플과 커버타일 사이의 공간으로 흐르도록 합니다.
       3. 샘플을 자동 염색기에 로드합니다.
    4. 표 2의 예에 따라 N을 패널의 항체 수로 설정하여 자동 염색기 프로그램을 설정합니다.
    5. 자동 염색기에서 슬라이드를 제거하고 다중 스펙트럼 이미징에 적합한 수성 마운팅 매체와 #1.5 커버슬립을 사용하여 커버슬립을 도포합니다.
    6. 이미징 세션 설정 및 이미지 수집을 위한 2.7단계에 설명된 샘플 절차에 따라 염색 후 2일 이내에 슬라이드를 이미지화합니다.
    7. 이미징 후 표백 샘플 2.8-2.9단계에 설명된 대로 샘플을 표백합니다.
11. 원하는 모든 IBEX 패널에 대해 반복합니다.

3. 시중에서 판매되는 소프트웨어를 사용한 샘플 분석

1. 정렬을 진행하기 전에 염색된 슬라이드의 전체 슬라이드 스캔을 완료합니다.
2. 소프트웨어가 허용하는 경우 자가형광 스펙트럼 제거를 포함하여 스캐닝 기능에 내장된 자동 혼합 해제 기능을 통해 스펙트럼 혼합 해제를 수행합니다. 이것이 사용 중인 소프트웨어의 기능인 경우 언믹싱 옵션을 선택하고 표준 설정 및 사전 설정된 염료를 사용하여 실행합니다
   참고: 사용자 정의 언믹싱은 언믹싱을 허용하는 대부분의 소프트웨어에서 생성할 수 있습니다. 라이브러리를 생성하기 위해 단일 형광단으로 염색된 개별 조직 절편이 소프트웨어의 측정값에 추가됩니다. 염색되지 않았거나 자가형광 조직의 영역도 자가형광 스펙트럼을 특성화하기 위해 스캔되며, 이는 자가형광 도구로 선택됩니다. 이러한 스펙트럼은 "이미지 준비"를 눌러 프로그램 내에서 컴파일된 다음 프로젝트별 언믹싱 라이브러리로 내보냅니다. 그런 다음 이 라이브러리는 unmixing 옵션에서 unmixing 라이브러리로 선택됩니다.
3. 정렬을 위해 스캔한 슬라이드를 시중에서 판매되는 이미지 분석 소프트웨어로 가져옵니다.
4. 여러 IBEX 라운드의 슬라이드 등록
   1. 등록할 IBEX 라운드의 두 가지 반복을 선택합니다.
   2. 두 가지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 등록 옵션을 선택합니다.
   3. 초기 등록 시도를 위해 Default Registration with High-resolution Registration을 선택합니다 .
   4. 또는 옵션에서 단일 채널 등록 을 선택하고 모든 IBEX 실행에서 일관된 단일 채널을 선택합니다.
      참고: 이 옵션은 표백에 강한 염료에 유용합니다(염료가 표백되지 않는 재료 참조).
5. 이미지 정렬
   1. 등록된 이미지 중 하나를 엽니다.
   2. 도구 탭의 이미지 등록에서 등록 도구를 선택하여 등록된 모든 이미지를 엽니다.
   3. 등록 도구 탭에서 랜드마크 기능을 선택합니다.
   4. 랜드마크 기능을 사용하여 전체 슬라이드의 정렬을 미세 조정할 수 있습니다.
      1. 하나의 슬라이드 이미지에 랜드마크를 수동으로 표시합니다.
      2. 다른 IBEX 이미지에서 동일한 랜드마크를 표시합니다. 프로그램은 식별된 랜드마크를 사용하여 정렬을 구체화합니다. 정렬을 미세 조정하려면 반복합니다.
   5. 정렬이 만족스러우면 Fuse | 직렬 얼룩 기능.
   6. 모든 이미지의 최종 합성이 완료될 때까지 추가 IBEX 이미징 라운드로 이 프로세스를 반복합니다.
6. 이미지 분석
   1. 세포 분할
      1. 분석 탭에서 HighPlex 모듈을 선택하여 연 다음 세포 식별을 위한 표현형 모듈을 선택합니다.
         1. 모든 마커를 로드하고 Highplex 모듈의 핵 검출 탭을 사용하여 모든 핵을 찾는 것으로 시작합니다. 염료 선택 탭에서 마커를 로드합니다. DAPI 염색을 사용하여 세포를 식별합니다.
         2. 분석 탭에서 다음 주요 매개변수를 사용하여 실시간 튜닝 도구를 켭니다. 배경 신호를 필터링하도록 설정된 최소 핵 강도; 전체 신호 가시성을 제어하기 위해 설정된 최대 이미지 밝기; 핵 분할 검출된 핵의 경계를 미세화하기 위해 설정된 공격성.
         3. 정확한 세분화를 위해 각 매개변수를 신중하게 조정하십시오.
   2. 세포질 및 막 마커를 검출합니다.
      1. Membrane and Cytoplasm Detection 탭으로 이동합니다.
      2. 최소 세포질 반경을 세포의 예상 크기에 대해 샘플에 적합한 값으로 설정합니다.
      3. 멤 브레인 염료 옵션에서 멤브레인 마커인 채널을 지정합니다.
         참고: 이렇게 하면 추가 분석을 위해 개별 세포를 더 잘 분할할 수 있습니다.
   3. 마커 임계값 및 표현형 할당
      1. 각 마커에 대해 양수 신호와 음수 신호에 대한 임계값을 설정합니다. 각 마커에 대해 생성된 탭 아래에서 이 작업을 수행합니다.
      2. 각 마커에 대해 수동 임계값을 수행하여 모집단을 식별합니다.
      3. 또는 임계값에 대한 생물정보학 기반 자동화된 접근 방식을 사용하십시오. 고급 | 개체(셀) 데이터 저장, 옵션을 True로 전환합니다. 내보내기 중 | 개체 데이터, 데이터 세트를 내보내 식별된 각 셀에 대한 마커 표현식 정보를 가져옵니다.
      4. 추가 맞춤형 분석을 위해 이러한 데이터를 추가 소프트웨어로 가져옵니다. 추가 분석을 위한 소프트웨어 옵션은 표 5에 나와 있습니다.

결과

Autostainer 2에서 TSA 기반 시약을 사용하는 IBEX 패널의 예를 제공합니다(그림 4). 각 마커는 명확하게 묘사할 수 있으며 마커 사이의 출혈이 최소화됩니다. 이미지는 두 차례의 염색을 통해 수집되었습니다. 샘플은 결핵균 감염 후 폐 조직입니다. 두 개의 IBEX 염색 패널은 시중에서 판매되는 예제 소프트웨어를 사용하여 정렬되었습니다. 최적화된 TSA 시약(여기에 설명된 대로)과 함께 IBEX 접근법을 사용하면 면역 세포, 염증 표지자 및 특수 폐 세포의 공간 조직을 보고 감상할 수 있습니다. 적절한 최적화를 통해 최소한의 배경으로 마커를 쉽게 나타낼 수 있습니다.

그림 1: 두 가지 다른 항원의 520nm 방출을 가진 형광단을 사용한 항원 검색 테스트. RAGE 및 CD3e는 보존된 노출 시간을 사용하여 이미지화되었습니다. 이 RAGE 항체의 에피토프는 매우 민감하고 반복적인 항원 회수에 취약하며 후속 항원 회수로 분석 민감도가 급격히 떨어집니다. 반대로, CD3e 분석 감도는 여러 차례의 항원 회수로 향상됩니다. 스케일 바 = 50 μm. 약어: RAGE = 진행성 당화 최종 산물에 대한 수용체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 우산 효과와 관련하여 서열 개발의 중요성에 대한 예. RAGE는 AT1 세포에서 고도로 발현되는 마커이며 CD31과 함께 SARS-CoV-2 면역 반응성을 효과적으로 차단합니다. 그러나 SARS-CoV-2 IHC를 먼저 수행하면 신호를 모두 시각화할 수 있습니다. 스케일 바 = 25μm. 약어: RAGE = 진행성 당화 최종 산물에 대한 수용체; AT1 = 폐포 유형 1; SARS-CoV-2 = 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2; IHC = 면역조직화학. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: IBEX 프로토콜에 자동 염색 장비를 사용한 프로세스 개요. 조직이 건조되는 것을 방지하기 위해 염색 공정의 라운드 2 이상을 위한 습식 마운팅. 약어: IBEX = 반복적 표백은 다중성을 확장합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 결핵균에 감염된 폐에 대한 자가염색제 2의 TSA 기반 염료를 사용한 IBEX의 예. 패널 1에는 모든 염료가 포함되어 있고 패널 2에는 표백이 가능한 염료가 포함되어 있습니다. 폐 이미지의 전체 IBEX에 걸쳐 모든 채널의 병합된 이미지가 표시됩니다. 스케일 바 = 200μm. 약어: IBEX = 반복 표백은 다중성을 확장합니다. TSA = 티라마이드 신호 증폭. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 1, 3 및 6 사이클 테스트를 위해 항체에 대한 사이클 번호의 효과를 검증하기 위한 예제 프로토콜. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 패널 검증을 위한 IBEX 자가염색기에 대한 5개의 항체가 있는 예 패널 1. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 3: 패널 검증을 위한 IBEX 자가염색기에 대한 4개의 항체가 있는 예제 패널 2. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 4: 두 자동 염색기의 비교. Ventana Autostainer와 Bond Rx의 장단점을 요약한 표입니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 5: 이미지 분석을 위한 소프트웨어 요약. 분할 후 이미지 분석에 사용할 수 있는 일부 분석 접근 방식 및 소프트웨어 도구를 요약한 표입니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

여기에서는 자동 염색 장비를 적용하고 IBEX 프로토콜에서 TSA 기반 시약을 최적화하여 IBEX 프로토콜을 핵심 병리학 시설에 적용하기 위한 고려 사항을 제공합니다. 반복되는 항원 회수 라운드와 자동화 장비에 대한 2라운드 이상의 적절한 로딩을 가장 잘 최적화하는 방법을 보여줍니다. 또한 핵심 시설에서 사용할 수 있는 Halo 소프트웨어를 사용하여 정렬을 수행하는 추가 방법을 보여줍니다. 이러한 접근법은 SARS-CoV-2 감염 후 비인간 영장류 조직의 폐 환경 차이를 결정하는 데 유용한 것으로 입증되었습니다⁵.

이 작업의 핵심 구성 요소는 실험 조직을 염색하기 전에 IBEX 패널 설계의 광범위한 최적화가 필요하다는 점을 강조하는 것입니다. 특히, TSA 기반 시약을 사용할 때 기본 IBEX 방법에서는 볼 수 없는 몇 가지 고려 사항을 고려해야 합니다. 첫 번째는 항체 민감도에 대한 여러 차례의 항원 회수가 미치는 영향입니다. TSA 기반 시약을 사용하면 각각의 새로운 항체 개발 전에 항체 변성이 선행됩니다. 일부 항체/항원 쌍은 추가 항원 회수에 취약하고 분석 감도를 감소시키는 반면, 일부는 반복적인 변성/항원 회수로 향상된 감도를 얻습니다. 패널을 설계하기 전에 표적 조직의 각 항체를 주의 깊게 테스트하는 것은 최상의 염색 방법을 보장하고 항체와 형광 염료 모두의 서열 순서를 알리는 데 중요합니다. 구연산염 기반(pH 6.0) 및 Tris-EDTA 기반(pH 9.0)을 포함한 완충액은 최적의 항원 회수 조건을 결정하기 위해 모든 항체에 대해 테스트됩니다. 여기에는 각 완충액을 체계적으로 평가하여 주어진 항체에 대한 항원 노출을 최대화하는 완충액을 식별하는 것이 포함됩니다. 또한 온도(예: 20-37°C), 배양 시간(일반적으로 30-60분) 및 차단 조건은 비특이적 배경 염색을 줄이고 필요한 경우 1차 및 2차 항체의 특이적 결합을 보장하기 위해 최적화됩니다. 1차 및 2차 항체 이전의 차단은 조직 특이적 자가형광 또는 비특이적 상호작용을 설명하기 위해 상업적으로 이용 가능한 차단 시약의 사용을 포함할 수 있다. IBEX 패널을 마무리하기 전에 최적화해야 하는 다른 중요한 고려 사항에는 주문이 특정 연구 질문에 맞지 않는 경우 에피토프의 차폐가 발생할 수 있는 우산 효과가 포함됩니다⁶. 형광 출혈을 피하기 위해 발현 항원 표적을 480-520nm 범위에서 출혈이 가장 적고 마커가 약한 원적색 채널에 넣는 것이 일반적이며, 이러한 형광 염료가 가장 밝다는 점을 감안할 때 신호 대 잡음비가 가장 좋습니다⁷. 그러나 이 범위에서 가장 밝을 수 있는 고도로 자가형광 조직 샘플에 주의를 기울여야 합니다. 잠재적인 수준의 자가형광을 해결하기 위해 염료 없이 조직을 이미징하여 이 문제를 해결하는 것이 좋습니다. 일반적으로 IBEX에서 수행되는 모든 일반적인 최적화 및 제어와 함께 수행되는 이러한 최적화 단계는 TSA 시약을 사용하는 IBEX에 대한 적절한 패널 설계를 알릴 수 있습니다.

이 방법에서는 두 가지 일반적인 자동 염색제의 사용을 시연했습니다. 그러나 이러한 접근 방식은 다른 자동 염색 방법에도 적용될 수 있습니다. 여기서 핵심 부분은 커버슬립의 최적 제거와 추가 염색 라운드를 위한 습식 하중입니다. 또한 특정 현미경 설정을 지정하지 않습니다. 키트에서는 최적의 슬라이드 스캐닝을 위해 특정 이미징 시스템과 함께 사용할 것을 권장할 수 있지만 모든 현미경 설정, 특히 호환 가능한 필터 큐브와 광범위한 스펙트럼 LED 광원이 있는 낙산화 형광 현미경이 작동해야 합니다. 일부 염료에는 다중 스펙트럼 검출기 또는 특수 필터 큐브가 필요한데, 이는 모든 실험실에서 사용할 수 없을 수 있으며 스펙트럼 중복으로 인해 표준 필터 큐브와 함께 사용할 때 문제가 발생할 수 있습니다. 이러한 염료는 다중 스펙트럼 이미징 시스템이나 고도로 특이적인 필터를 사용하여 더 잘 분리됩니다. 일부 형광단은 기존의 원적외선 필터(일반적으로 ~700nm)의 범위를 벗어나며 근적외선 신호를 포착할 수 있는 특수 필터 큐브 또는 검출기가 필요합니다. 특수 현미경은 이러한 필터로 제작되지만 대안을 사용할 수 있습니다. 이를 위해서는 주어진 현미경 구성에서 염료가 어떻게 작동하는지 결정하기 위해 추가적인 최적화가 필요합니다.

다중 스펙트럼 언믹싱은 다중 형광 IHC, 특히 자가형광이 발생하기 쉬운 조직으로 작업할 때 실제 신호와 배경 노이즈를 효과적으로 분리하기 때문에 적극 권장됩니다. 일반적으로 사용되는 형광단(특히 더 높은 에너지 파장 채널)의 방출 스펙트럼과 종종 겹치는 자가형광은 특정 신호를 가리거나 간섭하여 정확도를 떨어뜨릴 수 있습니다. 스펙트럼 언믹싱은 겹치는 방출 스펙트럼을 수학적으로 풀어 실제 형광 신호를 분리하는 동시에 원치 않는 자가형광을 "정리"합니다. 스펙트럼 언믹싱은 염색 및 이미징 프로세스의 반복적인 특성으로 인해 가능한 가장 깨끗한 신호를 얻는 것이 중요한 IBEX 워크플로에서 특히 유용합니다. IBEX에서는 여러 라운드의 염색에서 나온 신호를 이미지화하고, 표백하고, 서로 겹쳐서 합성 이미지를 만듭니다. 한 라운드에서 해결되지 않은 자가형광 또는 블리드스루는 스택 이미지를 통해 전파되어 다운스트림 분석을 복잡하게 만들고 마커 위치 파악에 대한 신뢰도를 떨어뜨릴 수 있습니다. 스펙트럼 언믹싱은 배경 자가형광으로부터 진정한 형광 신호를 효과적으로 분리하여 각 개별 라운드에서 보다 깨끗하고 정확한 신호 감지를 보장합니다. 이러한 신호 선명도는 여러 마커가 라운드에 걸쳐 함께 분석되어 자신감 있는 표현형 및 공간 분석을 가능하게 하는 신뢰할 수 있는 합성 이미지를 생성하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜에 사용되는 이미징 플랫폼에는 온보드 언믹싱 기능이 있지만, 다른 형광 전체 슬라이드 이미징 플랫폼과의 호환성을 위해서는 더 많은 언믹싱 옵션이 필요합니다.

또한 이 작업의 한계는 관련 시약 및 세척 완충액이 이러한 시스템에 최적화되어 있기 때문에 자동 염색기의 독점적 특성이지만 특정 제형은 공개되지 않았습니다. 또한 우리는 전체 슬라이드 이미지 분석을 위해 상업적으로 이용 가능한 하나의 이미지 분석 소프트웨어에만 초점을 맞추었으며 소프트웨어 라이선스 비용이 일부 실험실에 재정적 장벽이 될 수 있음을 인정합니다. 추가 분석 소프트웨어 ^8,9 및 R의 옵션은 유망해 보입니다. 특히, IMCDataAnalysis¹⁰이 R의 다중화된 이미지 다운스트림 분석에 대한 재현 가능한 워크플로를 위한 것이라는 점에서 코어에 최적으로 보이는 패키지 세트를 만든 Bodenmiller Group¹¹. 그러나 자원이 제한된 환경에서 더 광범위한 채택을 보장하기 위해 전체 슬라이드 IBEX 분석을 위한 접근 가능하고 비용 효율적인 대안을 개발하고 특성화하기 위한 향후 노력이 필요합니다. 또한, IBEX용 자동 염색기를 사용하는 이 접근법은 형광 접합 1차 항체 또는 조직이 충분한 품질과 최적의 고정 시간인 경우 TSA 기반 염료가 없는 표준 2차 항체를 포함하여 IBEX에서 보다 전통적인 염색에 적용될 수 있습니다.

전반적으로, 우리는 이 작업이 일상적으로 활용되는 병리학 핵심 시설 장비를 사용하여 TSA 기반 다중 형광 IHC를 적용하여 IBEX를 이러한 환경에 보다 광범위하게 적용하는 데 도움이 되기를 바랍니다. 이러한 유형의 응용 프로그램은 IBEX 프로토콜의 다양성을 진정으로 강조하고 어려운 조직 샘플이나 대규모 배치 접근 방식에서도 유용성을 보여줍니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
염색 시약 Alexa TSA 키트	서모피셔		오팔 현미경 필터가 없으면 대체 TSA 염료를 사용할 수 있습니다. 여기에는 Alexa Fluor 488(청록색 채널), Alexa Fluor 555 또는 568(빨간 채널), Alexa Fluor 647(원적색 채널), Alexa Fluor 750(적절한 필터가 장착된 경우 근적외선)이 포함됩니다.
항체< br/> Arg1	세포 신호 전달	93668	그림 4 1:100에서 사용
재료< > 블레이드	라이카 바이오시스템		또는 유사하게 조직 유형에 따라 높거나 낮은 프로필이 달라집니다
항체 CD11b	앱캠	ab133357	그림 4 1:2000에서 사용
항체 CD163	앱캠	AB182422	그림 4 1:500에서 사용
항체 CD31	세포 신호 전달	77699S	그림 2 1:100에서 사용
항체 CD3e	다코	A045201-2	그림 1 1:100에서 사용
도구 코플린 병	피셔 사이언티브	01-816-21	혹은 비슷한 경우도 있습니다
재료 커버슬립	VWR	V48393-026	혹은 비슷한 경우도 있습니다
항체 CX3CR1	앱캠	AB308613	그림 4 1:450에서 사용
스테인 DAPI	아코야	FP1490
소프트웨어< bri/> FIJI			신호 강도 측정에 사용됨
슬라이드<브래/> 피셔 슈퍼프론트 슬라이드	피셔 사이언티브	22-037-246	혹은 비슷한 경우도 있습니다
소프트웨어 HALO	인디카 연구소		시판 중인 이미지 분석 소프트웨어 예시. 이미지를 정렬하고 분석하는 데 사용되었습니다.
항체 Iba1	세포 신호 전달	17191	그림 4 1:800에서 사용됨
Software inForm	아코야		신호 강도 측정에 사용됨
항체 iNOS	앱캠	AB283655	그림 4 1:400에서 사용
기기 라이카 본드 Rx (또는 RXm)	라이카 바이오시스템	21.2201	본문에서는 "오토스테이너 1"로 언급됩니다. 염색 상자와 대량 정액을 포함한 모든 관련 시약도 준비되어 있는지 확인하세요.
시약 LiBH4	시그마-올드리치	62460-5G-F	무수물 환경에서 보관하세요
악기 만트라 스냅	아코야		염료를 분리하기 위해서는 다중 분광 플로러센트 현미경이 필요합니다. 오팔 염료를 감지하는 데 사용할 수 있는 현미경 예시입니다.
도구 미크토임	라이카 바이오시스템		또는 브러시 같은 선호하는 액세서리로 비슷한 것도 가능합니다
염색 시약 Opal IHC 480 키트	아코야	FP1500001KT	그림 4에서 사용됨
스테인닝 시약 Opal IHC 6-plex Plex 키트	아코야	NEL821001KT	520과 620은 표백하지 않으며, 그림 1, 2, 4에서 사용된다
염색 시약 오팔 IHC 780 키트	아코야	FP1501001KT	그림 4에서 사용됨
툴<브러/> 오븐	밀리포어 시그마	Z683329	또는 비슷한 방식으로, 오토스테이너에서도 가능합니다
항체 판사이토케라틴	앱캠	AB9377	그림 4 1:50에서 사용
시약 PBS (선택 사항)	피셔 사이언티브	AAJ61196AP
인스<브르/> 페노이미저	아코야		소프트웨어에 포함된 온보드 스펙트럼 언믹싱을 포함한 다중 스펙트럼 전체 슬라이드 영상
시약 프로롱 골드 안티페이드	피셔 사이언티브	P36961	또는 유사한 수성 매체
항체 ProSP-C n-말단 (ProSPC)	세븐 힐스 바이오리시약	WRAB-9337	그림 4 1:250에서 사용
항체< > 분노	R& D	MAB1179	그림 1과 2에서 1:50에서 사용
시약< br/> 반응 버퍼	로슈	NC1895692	벤타나 오토스테이너와 함께 사용하기
항체 SARS-CoV-2-N	세포 신호 전달	68344	그림 2 1:1000에서 사용
슬라이드 TOMO 부착 CC 현미경 슬라이드-WH	아반틱	SKUSL6519-1	조직 부착이 걱정된다면
인스트루먼트 벤타나 디스커버리 울트라	로슈		본문에서는 "오토스테이너 2"라고 불립니다. 염색 상자와 대량 정액을 포함한 모든 관련 시약도 준비되어 있는지 확인하세요.
시약 세척 버퍼	라이카 바이오시스템	AR9590	라이카 본드 오토스테이너와 함께 사용하기
시약 물	피셔 사이언티브	15-230-147	DI가 가장 좋고, 밀리포어가 아닙니다
툴<브르/> 워터 배스	라이카 바이오시스템	140607020C1	혹은 비슷한 경우도 있습니다