이 문서에서는 다양한 세포 밀도에서 검증된 오픈 소스 실행 프로그램을 사용하여 이미지 기반 핵 정량화를 자동화하는 단계별 방법을 설명합니다. 이 프로그램은 비용, 제한된 기술 역량을 가진 사용자의 접근성 및 기존 기술의 유용성을 제한할 수 있는 애플리케이션별 검증과 관련된 장벽을 해결하는 대안을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
라이브 셀 분석 및 이미지 기반 세포 분석에는 정확한 해석을 위해 데이터 정규화가 필요합니다. 일반적으로 사용되는 방법은 핵을 염색하고 정량화한 다음 핵 수에 대한 데이터 정규화입니다. 이 핵 수는 종종 단핵 세포의 세포 수로 표현됩니다. 수동 정량화는 힘들고 시간이 많이 소요될 수 있지만, 사용 가능한 자동화 방법은 모든 사용자가 선호하지 않을 수 있으며, 이 특정 응용 분야에 대한 검증이 부족하거나 비용이 많이 들 수 있습니다. 여기에서는 형광 DNA 염색으로 염색된 핵의 정량화 가능한 이미지를 캡처한 후 Python 컴퓨터 비전 라이브러리를 사용하여 개발된 자동 객체 계수 소프트웨어 프로그램을 사용하여 핵을 정량화하기 위한 단계별 지침을 제공합니다. 또한 다양한 세포 밀도에서 이 프로그램을 검증합니다. 프로그램 실행의 정확한 시간은 이미지 수와 컴퓨터 하드웨어에 따라 다르지만 이 프로그램은 프로그램 실행을 위해 핵을 초 단위로 계산하는 작업 시간을 통합합니다. 이 프로토콜은 고정된 염색된 세포의 이미지를 사용하여 개발되었지만, 살아있는 세포 및 면역 형광 응용 분야에서 염색된 핵의 이미지도 이 프로그램을 사용하여 정량화할 수 있습니다. 궁극적으로 이 프로그램은 높은 수준의 기술력을 필요로 하지 않는 옵션을 제공하며, 세포 및 분자 생물학자가 워크플로우를 간소화하고 지루하고 시간이 많이 소요되는 핵 정량 작업을 자동화하는 데 도움이 되는 검증된 오픈 소스 대안입니다.
서론
기능 및 이미지 기반 실험은 실험적 치료가 전세포 생화학 및 생리학에 미치는 영향을 이해하는 데 매우 중요합니다. 세포 생물학 실험 데이터의 유효한 해석은 데이터 정규화를 포함한 실험 프로토콜의 정확성과 재현성에 달려 있습니다. 예를 들어, 기준선에서 그리고 특정 약물 처리 후 살아있는 세포의 산소 소비량 및 세포 외 산성화 속도를 분석하면 에너지 대사의 다양한 측면을 평가할 수 있습니다 1,2. 세포 배양의 상층액에서 젖산 탈수소효소와 같은 효소의 활성을 측정하면 세포막 무결성을 정량화하는 데 도움이 될 수 있습니다3. 고정 전에 배양된 세포를 Annexin V 및 propidium iodide로 염색하면 세포사멸 및 괴사 세포를 평가할 수 있습니다4. 그러나 웰 간의 세포 밀도 차이는 이러한 각 분석의 결과에 영향을 미칩니다. 시딩 밀도에만 전적으로 의존하면 파종을 위한 세포 계수 오류, 플레이팅 중 배지의 세포 밀도 변화 또는 실험 전반에 걸쳐 샘플 또는 처리 간의 세포 성장 속도 차이로 인해 잘못된 결과를 제공할 수 있습니다. 따라서 실험 결과의 정규화가 필요합니다.
기능 및 이미지 기반 세포 데이터에 대한 현재 정규화 방법에는 단백질 농도5 또는 핵 또는 세포 수6가 포함됩니다. 데이터를 단백질 농도로 정규화하려면 분석을 실행한 후 프로테아제 억제제와 동일한 부피의 용해 완충액에서 세포를 추출해야 하며, 단백질 정량화를 위해 추가 분석(예: bicinchoninic acid assay, Bradford assay 등)을 수행해야 합니다. 이 방법의 정확도는 완전한 세포 추출에 달려 있습니다. 단백질을 남기면 정량 분석의 오류가 발생합니다. 핵 또는 세포를 계수하는 것은 세포가 자라는 표면에서 세포를 제거할 필요가 없는 대안을 제공합니다. 대신, 살아 있거나 고정된 세포는 비색 또는 형광 염색을 사용하여 염색 또는 역염색되며, 전체 세포 또는 핵의 이미지를 기반으로 계수를 수행할 수 있습니다. 핵 정량화는 형광 현미경 검사 응용 분야를 위해 전체 세포보다 선호되며 융합 세포(예: 근관) 또는 조직의 데이터를 정규화합니다. 형광 접근법을 사용한 핵 정량화를 위해 형광 DNA 염료(예: 4',6-diamidino-2-phenylindole dichloride(DAPI), Hoechst 33342, Hoechst 33358, DRAQ5 등)를 살아 있거나 고정된 세포에 적용하고 형광 현미경을 사용하여 이미지화합니다. DAPI, Hoechst 및 DRAQ5는 DNA 7,8,9의 아데닌-티민이 풍부한 영역에 우선적으로 결합하여 핵을 검출하는 수단을 제공합니다. 염료 농도의 최적화는 off-target 결합(즉, 미토콘드리아 DNA에 대한 반점 세포질 형광 유발)을 방지합니다10. 최적화 프로세스는 고정 세포에 대한 DAPI(예: DAPI를 사용한 VECTASHIELD Antifade Mounting Medium)를 포함하는 상업적으로 이용 가능한 마운팅 미디어와 라이브 셀에 대한 공개된 염색 농도(예: Hoechst)를 사용하여 간소화할 수 있습니다6,11,12. 염색이 완료되면 적절한 여기 필터(예: 자외선[DAPI 및 Hoechst] 또는 원적외[DRAQ5])를 사용하여 살아 있거나 고정된 세포의 핵을 시각화합니다. DAPI, Hoechst 및 DRAQ5의 여기 최대값은 형광 현미경 검사의 경우 스펙트럼의 양쪽 끝에 있습니다. 이러한 특성과 함께 이러한 염료의 DNA 특이성 및 최적 농도에서의 사용은 off-target 형광을 최소화합니다. 결과 이미지는 검은색 배경에 밝은 핵을 보여주며, 이러한 핵은 단핵 세포의 세포 수를 측정하기 위해 정량화됩니다. 조직학적 염색 및 명시야 현미경13을 사용하여 핵을 정량화하는 다른 정확한 염색 기반 방법이 존재하지만, 이러한 접근 방식을 사용하는 자동화는 가능하더라도, 더 어렵습니다.
여전히 황금 표준으로 남아 있지만, 수동 핵 정량화는 힘들고 시간이 많이 걸리며 장시간 계수로 인해 잠재적인 인적 오류에 취약합니다. 자동화된 세포 계수 프로그램이 존재하지만 모든 사용자가 선호하지 않고 비용이 많이 들 수 있으며 특정 응용 프로그램에 대한 검증이 최소화될 수 있습니다. Python은 최근 몇 년 동안 생물학자들에게 유용하고 접근하기 쉬운 리소스가 되었습니다. Python 컴퓨터 비전 라이브러리는 이미지 분석에 특히 유용합니다14. 여기에서는 Python 코드를 사용하여 개발된 실행 프로그램을 사용하여 형광 염료로 염색되고 형광 현미경을 사용하여 이미지화된 핵을 정량화하는 데 대한 단계별 지침을 제공합니다. 여기에 설명된 프로그램을 사용하는 데 코딩 기술이 필요하지 않습니다. 이 워크플로우는 형광 DNA 염료가 적용된 세포 또는 조직에 특이적입니다. 명시야 이미지에는 사용할 수 없습니다. 섹션 1에서는 이 워크플로우와 호환되는 방식으로 형광 현미경 검사를 사용하여 수집된 이미지를 캡처하고 저장하는 방법을 설명합니다. 섹션 2에서는 핵 정량화 프로그램을 실행 파일로 실행하고 출력을 가져오는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 실행 프로그램은 제공된 .exe 파일에서 직접 실행할 수 있으며 고품질 이미지에서 핵을 정량화하기 위해 수정할 필요가 없습니다. 이 실행 파일을 사용하려면 Windows 기반 PC가 필요합니다. 섹션 3에서는 프로그램을 실행 파일이 아닌 Python 스크립트로 실행하는 방법에 대한 지침을 제공하며(Mac 또는 Linux 기반 시스템의 경우 필수, Windows 기반 시스템의 경우 선택 사항) 원하는 경우 코드를 조정할 수 있습니다. 섹션 4에서는 정규화에 결과를 사용하는 방법을 설명합니다. 이러한 프로토콜 다음에는 당사 실험실의 검증 데이터를 포함한 대표적인 결과가 나옵니다.
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프로토콜
참고: 추가 파일은 다음 링크에서 찾을 수 있습니다 https://osf.io/a2s4d/?view_only=2d1042eb8f7c4c4a84579fe4e84fb03c
1. 형광 현미경을 사용한 이미지 캡처 및 저장
- 원하는 DNA 염료로 염색하는 것을 포함하여 이미징할 세포 또는 조직 샘플을 준비합니다. 여기에 사용된 이미지를 얻기 위해, C2C12 근아세포(CRL-1772, American Type Culture Collection)를 50mMEtOH6의 유무에 관계없이 표준 배양 조건(5%CO2, 37°C, 가습)하에서 48-72시간 동안 6-웰 플레이트에서 성장시키고, 앞서 설명한 바와 같이 얼음-차가운 메탄올에 고정시켰다13. 고정 세포는 DAPI-함유 장착 매체(15)를 사용하여 장착하고 이미징 전에 암흑 속에서 건조시켰습니다.
- 확립된 표준 작동 절차에 따라 형광 현미경과 컴퓨터의 모든 구성 요소를 켭니다. 현미경과 연결된 소프트웨어를 엽니다.
- 현미경을 설정하여 s를 시각화합니다.amp접안렌즈를 통해 les. 목표를 확인합니다. 필요한 경우 노즈피스를 원하는 목표로 돌립니다. 이미지 영역을 정확하게 표시하기 위해 소프트웨어 프로그램이 원하는 대물렌즈를 선택했는지 확인하십시오. 여기에서 이미지는 10x 대물렌즈를 사용하여 캡처되었습니다.
- 불을 끈 상태에서 샘플(슬라이드, 접시 또는 접시)을 무대에 놓습니다. 적절한 필터로 라이브 이미징을 켜고 노출 시간을 미리 결정된 지속 시간 또는 자동 노출로 설정합니다. 여기에서는 61-62ms의 DAPI 필터와 노출 시간을 사용했습니다. 특히 세포 밀도가 높은 이미지의 경우 노출 시간 설정에 대한 지침은 문제 해결 표를 참조하십시오.
- 접안렌즈를 사용하여 얼룩진 핵이 보일 때까지 총 조정 손잡이를 사용하여 초점을 천천히 조정한 다음 미세 조정 손잡이를 사용하여 핵이 깨끗하고 선명하게 나타날 때까지 초점을 천천히 조정합니다.
참고: 적절한 이미지의 예가 그림 1에 나와 있습니다.- 과도한 배경 염색이 나타나거나 핵이 매우 어둡게 나타나면 노출 시간을 수동으로 조정하십시오. 단일 이미지에서 일부 핵에 대한 신호 강도에 눈에 띄는 차이가 있을 수 있습니다. 그러나 둥근 모양은 신호 간섭을 최소화하면서 모든 핵에서 볼 수 있어야 합니다.
참고: 다운스트림 응용 프로그램에 사용되는 프로그램은 다양한 강도에 강합니다. 핵 정량화 프로그램의 개발 및 검증에 사용되는 원시 이미지에는 다양한 신호 강도를 가진 이미지가 포함되며 Open Science Framework 리포지토리를 통해 사용할 수 있습니다(위에서 언급한 링크 참조).
- 과도한 배경 염색이 나타나거나 핵이 매우 어둡게 나타나면 노출 시간을 수동으로 조정하십시오. 단일 이미지에서 일부 핵에 대한 신호 강도에 눈에 띄는 차이가 있을 수 있습니다. 그러나 둥근 모양은 신호 간섭을 최소화하면서 모든 핵에서 볼 수 있어야 합니다.
그림 1: DAPI 염색 핵의 예시 이미지. 이 이미지는 최소한의 배경으로 (A) 낮음, (B) 중간 또는 (C) 높은 세포 밀도의 핵을 묘사합니다. 이미지 C에서 핵의 신호 강도가 다양하다는 점에 주목하십시오. 이것은 정량화를 방해하지 않았습니다. 눈금 막대 (C)는 100 μm를 나타냅니다. 핵 정량화에 사용되는 이미지에서 스케일 바는 생략해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 접안렌즈를 통해 핵에 초점이 맞춰지면 감지 모드를 카메라로 전환합니다. 미세 조정 손잡이를 사용하여 초점을 조정합니다.
- 필요한 경우 노출 시간을 조정합니다. 후속 샘플 및 이미지에 사용할 최종 노출 시간을 기록해 둡니다.
참고: 모든 이미지에서 동일한 노출 시간을 사용하는 것이 이상적이지만, 형광 강도가 샘플 간에 정량화되거나 비교되지 않기 때문에 이 응용 분야에서는 노출 시간의 변동이 허용됩니다. - 소프트웨어의 적절한 이미지 캡처 버튼을 사용하여 이미지를 캡처합니다. 샘플에 여러 염색이 적용된 경우 필터를 전환하고(예: FITC, TRITC 또는 Cy5로) 병합을 위해 동일한 영역을 이미지화합니다.
- 빛에 대한 샘플 노출을 최소화하기 위해 셔터를 적용합니다. 축척 막대에서 굽지 않고 전용 폴더에 범용 그림 파일 형식(.tif, .png 또는 .jpg)으로 이미지를 저장합니다. 각 이미지 파일 이름에 적절한 설명이 포함되어 있는지 또는 파일 이름에 사용되는 모든 코딩에 적절한 링크 설명서가 있는지 확인합니다.
참고: 이것은 수량화 프로그램의 이미지 디렉토리가 됩니다. 멀티컬러 이미징을 사용한 경우 핵 이미지만 별도의 전용 폴더에 복사합니다. 이 작업은 이미징 세션이 끝날 때도 수행할 수 있습니다. 대부분의 이미징 소프트웨어에서 기본 내보내기 설정을 사용하여 내보낸 이미지는 고품질 이미지가 캡처된 경우 일반적으로 이 프로그램에서 사용하기에 충분한 해상도입니다. 그러나 핵의 형태가 명확한지 확인하기 위해 내보내기 후 이미지를 육안으로 확인해야 합니다. 이미지를 .jpg 형식으로 저장하는 경우 이미지가 과도하게 압축되지 않고 품질이 유지되도록 주의해야 합니다. - 셔터를 열고 라이브 이미징으로 돌아간 다음 이미징을 위해 샘플을 다른 위치로 스캔합니다. 필요에 따라 1.8-1.9단계를 반복합니다. 10배 배율로 캡처한 6-well plate에 seeded 세포 이미지의 경우 well당 10-15개의 이미지를 캡처합니다(샘플 영역 전체의 세포 밀도 일관성에 따라 다름).
- 단일 샘플에 대한 모든 이미지를 획득한 후 다음 옵션 중 하나를 수행합니다.
- 다음 샘플로 이동하여 1.4-1.10단계를 반복합니다.
- 프로토콜을 일시 중지하고 다른 시간에 다시 반환합니다. 샘플은 빛으로부터 보호되어야 합니다. 이 옵션은 라이브 셀로 작업하는 경우에는 권장되지 않습니다.
- 이미징이 완료되면 실내 조명을 켜기 전에 모든 샘플이 빛으로부터 보호되어 있는지 확인하십시오. 이미지가 포함된 폴더가 로컬에 저장된 경우 썸 드라이브, 클라우드 스토리지 위치 또는 정량화 프로그램이 실행될 컴퓨터에서 액세스할 수 있는 기타 네트워크 드라이브로 파일을 전송합니다. 전용 폴더에 저장합니다.
- 확립된 표준 작동 절차에 따라 현미경과 컴퓨터의 모든 부품을 차단하십시오.
- 이제 이미징이 완료되었습니다. 섹션 2에 설명된 대로 자동화된 수량화 프로그램을 사용하거나 섹션 3에 설명된 대로 프로그램을 Python 스크립트로 실행하여 파일을 분석합니다.
2. 자동화된 핵 정량화 프로그램을 실행 파일로 실행 가능
참고: 프로그램을 실행 파일로 실행하는 이 방법은 Windows 기반 PC와 호환되며 Windows OS 사용자에게 권장되는 방법입니다. Mac OS 또는 기타 비 Windows 사용자는 프로그램을 Python 스크립트로 실행해야 합니다(섹션 3 참조).
- Python이 컴퓨터에 설치되어 있는지 확인합니다. 필요한 경우 python.org/downloads(선호)에서 Python을 설치하거나 Anaconda 또는 Miniconda를 사용하여 Python을 설치합니다. 발행일 현재 이 프로그램은 Python 버전 3.10-3.12에서 테스트되었습니다.
- 브라우저를 열고 https://github.com/rbudnar/nuclei_counter/releases 로 이동합니다. count_nuclei.zip라는 파일의 최신 버전을 다운로드합니다.
- Downloads(다운로드) 폴더에서 Zip 파일을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 로컬 컴퓨터의 원하는 위치에 모든 파일의 압축을 풉니다( 그림 2A 참조). 이 파일 위치를 열어 두십시오. 이 파일 경로는 2.5단계에서 사용됩니다( 그림 2B 참조).
참고: 이제 Count_nuclei 응용 프로그램 파일로 나타납니다. 이것은 실행 파일입니다. - 검색 창에서 CMD 또는 명령 프롬프트를 검색하여 명령 프롬프트를 엽니다. cd 명령을 사용하여 디렉토리를 실행 파일의 파일 경로로 변경하고( 그림 2C 참조) Enter 키를 누릅니다. 예제 명령 줄: C:\Users\janedoe>cd [cd 뒤에 공백을 둔 다음 파일 경로 복사/붙여넣기]
- 다음 명령줄에서 다음을 입력하고 Enter 키를 누릅니다.
count_nuclei.exe --img_dir "경로/대상/이미지" --output_dir "경로/대상/출력" --save_images --output_count_filename "results.csv"
여기서 path/to/images는 분석할 이미지가 포함된 폴더의 파일 경로입니다(1.14단계 참조). path/to/output은 .csv 파일을 저장해야 하는 폴더의 파일 경로입니다(제공되지 않은 경우 기본값은 현재 작업 디렉토리입니다). results.csv는 결과 카운트가 저장될 파일 이름입니다(제공되지 않은 경우 출력 파일 이름은 기본적으로 count_results.csv로 설정됨).
참고: 명령줄에는 따옴표가 필요합니다. 파일 경로 앞에 따옴표 뒤에 공백이 없는지 확인합니다( 그림 2C 참조). - 다음 명령줄이 나타나면 처리가 완료된 것입니다. 이제 등고선 및 결과 스프레드시트를 2.5단계에서 출력 디렉터리로 지정된 위치(즉, path/to/output, 그림 2C 참조)에서 사용할 수 있습니다.
- 윤곽을 육안으로 검사하여 계수 품질을 확인합니다. 이제 섹션 4에 설명된 대로 결과를 사용하여 데이터를 정규화할 수 있습니다.
참고: 윤곽이 핵을 놓친 것으로 보이거나(예: 핵이 너무 희미하게 보임) 핵 그룹을 단일 항목으로 군집화하는 경우(예: 과다 노출된 이미지, 너무 많은 배경, 아티팩트) 사용자는 문제 해결 표를 참조해야 하며 섹션 4로 이동하기 전에 이미지 획득을 최적화하기 위해 섹션 1로 돌아가야 할 수 있습니다.
그림 2: 섹션 2에 대한 워크플로우의 주요 부분의 예. (A) 다운로드 폴더에서 파일을 추출하고, 화살표로 표시된 대로 올바른 폴더를 클릭하도록 주의하여 2.3단계에서 원하는 대상으로 추출(B)을 활성화합니다. (C) 2.4단계 및 2.5단계에 대한 명령의 예와 2.6단계의 완료를 나타내는 다음 명령줄. 2.4단계(C)의 파일 경로는 2.3단계(B)의 추출 위치와 일치합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 자동화된 핵 정량화 프로그램을 Python 스크립트로 실행
- Python이 컴퓨터에 설치되어 있는지 확인합니다. 필요한 경우 python.org/downloads(선호)에서 Python을 설치하거나 Anaconda 또는 Miniconda를 사용하여 Python을 설치합니다. 발행일 현재 이 프로그램은 Python 버전 3.10-3.12에서 테스트되었습니다.
- 브라우저를 열고 https://github.com/rbudnar/nuclei_counter 로 이동합니다. Green Code 버튼을 클릭한 다음 Download ZIP 을 클릭하여 코드 저장소를 다운로드합니다( 그림 3A 참조).
- Windows OS에 대한 다음 지침을 사용합니다. Mac OS 기반 컴퓨터의 경우 3.4단계를 참조하십시오.
- Downloads(다운로드) 폴더에서 File(파일)을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Extract All(모두 추출)을 선택하여 로컬 컴퓨터에 파일 압축을 풉니다(그림 3B-C 참조).
- 추출된 파일 위치에서 nuclei_counter-main이라는 폴더를 엽니다. 이것은 코드 저장소입니다.
참고: 이 프로그램을 처음 사용할 때만 다운로드하면 됩니다. 압축을 푼 파일을 액세스 가능한 네트워크 위치로 이동하고 해당 위치를 기록해 두기만 하면 됩니다. - 검색 창에서 CMD 또는 명령 프롬프트를 검색하여 명령 프롬프트를 엽니다. Python이 Anaconda 또는 Miniconda에 의해 설치된 경우 표준 명령 프롬프트 대신 Anaconda 프롬프트를 엽니다. 검색 창에 Anaconda Prompt를 입력하여 찾을 수 있습니다.
- cd 명령을 사용하여 디렉터리를 코드 저장소로 변경하고 Enter 키를 누릅니다. 대/소문자를 구분하는 아래 코드 줄을 참조하십시오. 파일 경로를 복사할 때 nuclei_counter-main이라는 폴더가 열려 있는지 확인합니다. pyproject 또는 pyproject.toml이라는 파일이 표시되어야 합니다( 그림 3D 참조). 예제 명령 줄: C:\Users\janedoe>cd [cd 뒤에 공백을 둔 다음 파일 경로 복사/붙여넣기]
- 다음 명령줄에서 공백과 마침표를 포함하여 다음을 입력합니다( 그림 3D 참조).
pip install -e 입니다.
참고: 3.3.5 및 3.3.6 단계는 이 프로그램을 컴퓨터에서 처음 실행할 때만 완료하면 됩니다. 이 작업이 이미 완료된 경우 3.3.7단계로 진행합니다. 설치 프로세스를 초기화하는 데 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. - 엔터 키를 치시오. 이 명령을 실행하면 이 스크립트를 실행하는 데 필요한 라이브러리가 설치되고 코드 조정이 필요한 이벤트에서 편집 가능한 모드로 리포지토리를 설치합니다(그림 3D 참조).
- 다음 명령줄에 다음을 입력하여 디렉터리를 기본 소스 코드 디렉터리로 변경합니다( 그림 3E 참조).
CD "nuclei_counter" - 다음 명령줄에서 다음을 입력하고 Enter 키를 누릅니다( 그림 3E 참조).
python count_nuclei.py --img_dir "경로/to/이미지" --output_dir "경로/to/output" --save_images --output_count_filename "results.csv"
여기서 path/to/images는 분석할 이미지가 포함된 폴더의 파일 경로입니다(1.14단계). path/to/output은 .csv 파일을 저장해야 하는 폴더의 파일 경로입니다(제공되지 않은 경우 기본값은 현재 작업 디렉토리입니다). results.csv는 결과 카운트가 저장될 파일 이름입니다(제공되지 않은 경우 출력 파일 이름은 기본적으로 count_results.csv로 설정됨).
참고: 명령줄에는 따옴표가 필요합니다. 파일 경로 앞에 따옴표 뒤에 공백이 없는지 확인합니다. python 스크립트는 제공된 파일 경로의 파일을 읽고 디렉토리의 모든 이미지에 대해 핵 계수 프로그램을 실행합니다( 그림 3E 참조). 결과 개수는 지정된 위치의 결과 .csv 파일에 저장됩니다. - 다음 명령줄이 나타나면 처리가 완료된 것입니다( 그림 3E 참조). 이제 윤곽선 및 결과 스프레드시트를 3.3.8단계에서 출력 디렉터리로 지정된 위치(즉, path/to/output)에서 사용할 수 있습니다.
그림 3: Windows OS를 사용하는 섹션 3에 대한 워크플로의 주요 부분의 예. 코드에 액세스하려면 코드 라고 표시된 녹색 버튼을 클릭하고 (A) Zip 파일(화살표로 표시)을 다운로드합니다. (B) Zip 파일(파란색으로 표시)을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 (C) 원하는 대상을 설정하여 압축을 풉니다. (D) 명령 프롬프트를 연 후 3.3.4 및 3.3.5 단계에 대한 명령의 예. 3.3.5 단계의 명령은 모두 한 줄에 있습니다. 다음 줄에서 "Obtaining file"로 시작하는 텍스트는 Enter 키를 누른 후에 나타납니다(3.3.6단계, 즉, 명령 실행). (E) 3.3.7 및 3.3.8 단계에 대한 명령의 예, 3.3.8 단계 실행 후 진행 표시줄 및 3.3.9 단계의 완료를 보여주는 명령 줄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- Mac OS의 경우 다음 지침을 사용하십시오.
- Downloads(다운로드) 폴더에서 File(파일 ) 메뉴를 클릭하고 Open( 열기 )을 선택하여 로컬 컴퓨터에 파일의 압축을 풉니다( 그림 4A 참조).
- 추출된 파일 위치에서 nuclei_counter-main이라는 폴더를 엽니다. 이것은 코드 저장소입니다.
참고: 이 프로그램을 처음 사용할 때만 다운로드하면 됩니다. 압축을 푼 파일을 액세스 가능한 네트워크 위치로 이동하고 해당 위치를 기록해 두기만 하면 됩니다. - 스포트라이트를 여는 command+스페이스 바 를 눌러 터미널을 엽니다. 그런 다음 "터미널"을 검색합니다.
- cd 명령을 사용하여 디렉터리를 코드 저장소로 변경하고 Enter 키를 누릅니다. 대/소문자를 구분하는 아래 코드 줄을 참조하십시오. 텍스트 문서에 파일 경로를 입력하고 터미널에 복사합니다. 파일 경로가 cd 바로 앞의 텍스트로 시작하는지 확인합니다(예: 그림 4B의 /Users/userid). 예제 명령 줄: /Users/janedoe›cd /Users/janedoe/Desktop/nuclei_counter-main
- 다음 명령줄에서 사용자 ID 뒤에 달러 기호가 나타납니다( 그림 4B 참조). 달러 기호 뒤에 공백이 있는지 확인하고 명령 끝에 공백과 마침표를 포함하여 다음을 입력합니다. 공백 없이 pip 바로 뒤에 적절한 Python 버전을 포함합니다(예: pip3 install -e ).
참고: 3.4.5 및 3.4.6 단계는 컴퓨터에서 이 프로그램을 처음 실행할 때만 완료하면 됩니다. 이 작업이 이미 완료된 경우 3.4.7단계로 진행합니다. 설치 프로세스를 초기화하는 데 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. - 엔터 키를 치시오. 이 명령을 실행하면 이 스크립트를 실행하는 데 필요한 라이브러리가 설치되고 코드 조정이 필요한 이벤트에서 편집 가능한 모드로 리포지토리를 설치합니다.
- 다음 명령줄에서 달러 기호 뒤에 공백이 있는지 확인한 후 다음을 입력하여 디렉토리를 기본 소스 코드 디렉토리로 변경합니다( 그림 4C 참조).
CD "nuclei_counter" - 다음 명령줄에서 아래 명령줄을 입력합니다. 3 이외의 버전을 사용하는 경우 Python 뒤의 숫자를 올바른 버전 번호로 바꿉니다. 그런 다음 Enter 키를 누릅니다( 그림 4C 참조).
python3 count_nuclei.py --img_dir "경로/대상/이미지" --output_dir "경로/대상/출력" --save_images --output_count_filename "results.csv"
여기서 path/to/images는 분석할 이미지가 포함된 폴더의 파일 경로입니다(1.14단계). path/to/output은 .csv 파일을 저장해야 하는 폴더의 파일 경로입니다(제공되지 않은 경우 기본값은 현재 작업 디렉토리입니다). results.csv는 결과 카운트가 저장될 파일 이름입니다(제공되지 않은 경우 출력 파일 이름은 기본적으로 count_results.csv로 설정됨).
참고: 명령줄에는 따옴표가 필요합니다. 파일 경로 앞에 따옴표 뒤에 공백이 없는지 확인합니다. Python 스크립트는 제공된 파일 경로의 파일을 읽고 디렉토리의 모든 이미지에 대해 핵 계수 프로그램을 실행합니다( 그림 4C 참조). 결과 개수는 지정된 위치의 결과 .csv 파일에 저장됩니다. - 다음 명령줄이 나타나면 처리가 완료된 것입니다( 그림 4C 참조). 이제 윤곽선 및 결과 스프레드시트를 3.4.8단계에서 출력 디렉터리로 지정된 위치(즉, path/to/output)에서 사용할 수 있습니다.
- 윤곽을 육안으로 검사하여 계수 품질을 확인합니다. 이제 섹션 4에 설명된 대로 결과를 사용하여 데이터를 정규화할 수 있습니다.
참고: 윤곽이 핵을 놓친 것으로 보이거나(예: 핵이 너무 희미하게 보임) 핵 그룹을 단일 항목(예: 과다 노출된 이미지, 너무 많은 배경, 아티팩트)으로 클러스터링하는 경우, 사용자는 표 1 을 참조해야 하며 섹션 4로 이동하기 전에 이미지 획득을 최적화하기 위해 섹션 1로 돌아가야 할 수 있습니다.
그림 4: Mac OS를 사용하는 섹션 3에 대한 워크플로우의 주요 부분의 예. 코드를 다운로드한 후( 그림 3A 참조) (A) Zip 파일(파란색으로 표시)을 클릭하고 원하는 대상을 설정하여 압축을 풉니다. (B) 터미널을 연 후 3.4.4단계(디렉토리를 코드 저장소로 변경) 및 3.4.5단계(pip 설치)에 대한 명령의 예. (C) 3.4.7 및 3.4.8 단계에 대한 명령의 예, 3.4.8 단계 실행 후 진행 표시줄 및 3.4.9 단계의 완료를 보여주는 명령 줄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 카운트를 사용하여 실험 데이터 정규화
- 자동화된 프로그램을 사용하여 결정된 핵 정량화와 각 이미지를 연결하는 results.csv 파일을 엽니다.
- 정규화 방법을 결정합니다: 1) 이미지별 기준(예: 다색 형광 현미경 검사의 경우), 2) 참조 샘플(또는 조건)에 대한 샘플당 평균 핵 수의 비율로 데이터 정규화, 3) 샘플당 핵 수로 정규화(예: 총 핵 수를 샘플 면적에 외삽). 정규화 방법에 대한 권장 사항은 토론 섹션에 있습니다.
- 정규화가 이미지별로 수행되는 경우 각 이미지에 대한 실험 데이터를 해당 이미지의 핵 수로 나누기만 하면 됩니다.
- 데이터를 비율로 정규화하려면 아래 설명된 단계를 수행합니다.
- 단일 복제에 대해 여러 이미지가 수집된 샘플(예: 6-웰 플레이트의 단일 웰에서 캡처된 10-15개의 이미지)의 경우 이미지당 평균 핵 수를 계산합니다. 이러한 핵 수는 단핵 세포 또는 다핵 세포(예: 근관)에서 함께 융합된 여러 세포를 가정하는 세포 수로 간주됩니다.
- 기준 표본 또는 기준 조건(예: 제어 조건의 모든 표본에 대한 평균 개수)을 선택하고 개수를 기록합니다.
- 모든 샘플에 대한 개수를 해당 참조 개수로 나누어 정규화 값을 생성합니다. 참조 샘플이 사용된 경우 참조 샘플의 정규화 값을 1로 사용합니다.
참고: 참조 조건이 사용된 경우 조건 전체의 평균 정규화 값은 이제 1이 됩니다. 기준보다 핵이 적은 샘플(즉, 밀도가 낮음)은 정규화 값이 1보다 작고, 참조보다 핵이 많은 샘플(즉, 밀도가 낮음)은 정규화 값이 1보다 큽니다. - 각 웰에 대한 실험 데이터를 해당 계산된 정규화 값으로 나눕니다.
- 데이터를 샘플당 핵 수로 정규화하려면 아래에 설명된 단계를 따르십시오.
- 단일 복제에 대해 여러 이미지가 수집된 샘플(예: 6-웰 플레이트의 단일 웰에서 캡처된 10-15개의 이미지)의 경우 이미지당 평균 핵 수를 계산합니다. 이러한 핵 수는 단핵 세포 또는 다핵 세포(예: 근관)에서 함께 융합된 세포의 수를 가정하는 세포 수로 간주됩니다.
- 슬라이드(커버슬립), 웰 또는 데이터가 파생된 접시의 표면적을 결정합니다. 이 정보는 제품 웹 사이트의 사양 섹션에서 찾을 수 있습니다.
- 캡처된 각 이미지의 영역을 결정합니다. 이 정보는 이미징 또는 분석 소프트웨어에서 메타데이터로 사용할 수 있는 경우가 많습니다.
- 샘플 표면적과 이미지 영역이 동일한 단위(예: mm2)로 표현되는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 원하는 단위로 변환하십시오.
- 다음 방정식을 사용하여 각 샘플의 총 개수를 계산합니다.
TC = AC • (SA/IA)
여기서 TC는 총 수, AC는 평균 수, SA는 표면적, IA는 이미지 영역입니다. - 표본에 해당하는 TC로 실험 데이터를 나눕니다.
- 실험 데이터를 정규화하고 적절하게 통계 분석에 사용합니다.
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결과
각 배치 이미지 실행은 1) 식별된 핵의 윤곽을 보여주는 윤곽이 적용된 이미지 파일 세트(그림 5) 및 2) 이미지 파일 이름과 관련 개수를 연결하는 .csv 파일(스프레드시트)을 생성합니다. 윤곽을 보면 사용자가 계수 품질을 시각적으로 평가할 수 있습니다. 구체적으로, 섹션 1에 따라 얻어진 이미지는 핵이 프로그램에 의해 계수되었음을 나타내는 실선 녹색 선으로 둘러싸인 모든(또는 거의 모든) 핵을 가져야 합니다. 이 윤곽선은 여기에서 프로그램을 조정하는 데 사용되었습니다.
그림 5: 원본 이미...
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토론
당사의 핵 정량화 프로그램은 기존 옵션에 비해 몇 가지 장점이 있습니다: 최소한의 기술만 필요하고, 핵 정량화의 특정 작업에 대해 검증되었으며, 오픈 소스입니다. 후자는 비용 관련 장벽을 극복합니다. 궁극적으로 이 프로그램은 세포 및 분자 생물학자에게 형광 현미경을 사용하여 캡처한 이미지에서 핵을 빠르고 정확하게 정량화할 수 있는 추가 옵션을 제공합니다. 현재 사용 가능한 자동 핵 또는 세포 계수 프로그램은 모든 사용자가 선호하지 않으며, 일부는 비용이 많이 들고, 특정 응용 분야에 대한 검증이 최소한이거나 아예 없을 수 있습니다. BioTek Cytation 라인과 같은 특수 장비에는 다양한 추가 응용 분야 외에도 핵 염색20을 사용하여 현장 세포 계수를 검증하는 기술 게시판이 함께 제공됩니다. 검증 데이터가 존재하고 Cytation 제품 라인이 널리 사용되지만, 특히 살아있는 세포 데이터를 쉽고 효율적으로 정규화하기 위해 ...
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구를 위한 자금은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)/국립노화연구소(National Institute on Aging, R01AG084597; DEL 및 HYL) 및 텍사스 공과 대학(DEL)의 창업 자금으로 지원되었습니다. 저자는 이 작업에 기여한 학부 연구자(REH, MRD, CJM, AKW)에게 재정적 지원을 제공한 Texas Tech University Undergraduate Research Scholars 및 TrUE Scholars 프로그램에 감사를 표합니다. 또한 실험실 공간과 장비를 친절하게 공유해 주신 Lauren S. Gollahon 박사와 Michael P. Massett 박사에게도 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 방법 2 또는 3의 결과 파일에 액세스할 수 있는 컴퓨터 | - | 2.6단계(방법 2) 또는 3.3.9 또는 3.4.9단계(방법 3)를 참조하십시오인터넷 | |
| 에 액세스할 수 있는 컴퓨터, 최신 브라우저 | ( | 예: Google Chrome | |
| ) 인터넷에 액세스할 수 있는 컴퓨터, 최신 브라우저 및 Windows OS | 는 다양합니다 | Mac, Linux 또는 기타 OS의 경우 방법 3 이미지 | |
| 캡처용 소프트웨어가 있는 컴퓨터를 사용합니다. | Zeiss | AxioVision | 기타 소프트웨어는 허용됩니다. 형광 현미경과 호환되어야 합니다 |
| 출력을 위한 파일 위치(결과 스프레드시트 및 이미지 윤곽) | - | - | 빈 새 폴더일 수 있습니다 |
| 광 현미경 | Zeiss | Axiovert 200M | 다른 형광 현미경은 허용됩니다. 적절한 필터 큐브, 원하는 대물렌즈 및 카메라가 장착되어 있어야 합니다. |
| 정량화할 모든 이미지가 포함된 폴더 | - | - | 1.12단계 참조 |
| Python 버전 3.10 이상 | Python-https://www.python.org/downloads/ | 에서 무료로 다운로드 및 설치할 수 있습니다. | |
| 이미징할 샘플 | - | - | 형광 DNA 염료로 고정 또는 살아, 염색 또는 대조염 |
| 프레드시트 소프트웨어 | Microsoft | Excel | 유사한 스프레드시트 소프트웨어도 허용됩니다 |
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