Method Article

Computer Vision 라이브러리를 사용하여 핵 정량 분석 간소화

DOI:

10.3791/67945

⸱

June 6th, 2025

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1Metabolic Health & Muscle Physiology Laboratory, Department of Kinesiology and Sport Management, Texas Tech University, 2Applied Exercise Physiology Laboratory, Department of Kinesiology and Sport Management, Texas Tech University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 문서에서는 다양한 세포 밀도에서 검증된 오픈 소스 실행 프로그램을 사용하여 이미지 기반 핵 정량화를 자동화하는 단계별 방법을 설명합니다. 이 프로그램은 비용, 제한된 기술 역량을 가진 사용자의 접근성 및 기존 기술의 유용성을 제한할 수 있는 애플리케이션별 검증과 관련된 장벽을 해결하는 대안을 제공합니다.

Abstract

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라이브 셀 분석 및 이미지 기반 세포 분석에는 정확한 해석을 위해 데이터 정규화가 필요합니다. 일반적으로 사용되는 방법은 핵을 염색하고 정량화한 다음 핵 수에 대한 데이터 정규화입니다. 이 핵 수는 종종 단핵 세포의 세포 수로 표현됩니다. 수동 정량화는 힘들고 시간이 많이 소요될 수 있지만, 사용 가능한 자동화 방법은 모든 사용자가 선호하지 않을 수 있으며, 이 특정 응용 분야에 대한 검증이 부족하거나 비용이 많이 들 수 있습니다. 여기에서는 형광 DNA 염색으로 염색된 핵의 정량화 가능한 이미지를 캡처한 후 Python 컴퓨터 비전 라이브러리를 사용하여 개발된 자동 객체 계수 소프트웨어 프로그램을 사용하여 핵을 정량화하기 위한 단계별 지침을 제공합니다. 또한 다양한 세포 밀도에서 이 프로그램을 검증합니다. 프로그램 실행의 정확한 시간은 이미지 수와 컴퓨터 하드웨어에 따라 다르지만 이 프로그램은 프로그램 실행을 위해 핵을 초 단위로 계산하는 작업 시간을 통합합니다. 이 프로토콜은 고정된 염색된 세포의 이미지를 사용하여 개발되었지만, 살아있는 세포 및 면역 형광 응용 분야에서 염색된 핵의 이미지도 이 프로그램을 사용하여 정량화할 수 있습니다. 궁극적으로 이 프로그램은 높은 수준의 기술력을 필요로 하지 않는 옵션을 제공하며, 세포 및 분자 생물학자가 워크플로우를 간소화하고 지루하고 시간이 많이 소요되는 핵 정량 작업을 자동화하는 데 도움이 되는 검증된 오픈 소스 대안입니다.

Introduction

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기능 및 이미지 기반 실험은 실험적 치료가 전세포 생화학 및 생리학에 미치는 영향을 이해하는 데 매우 중요합니다. 세포 생물학 실험 데이터의 유효한 해석은 데이터 정규화를 포함한 실험 프로토콜의 정확성과 재현성에 달려 있습니다. 예를 들어, 기준선에서 그리고 특정 약물 처리 후 살아있는 세포의 산소 소비량 및 세포 외 산성화 속도를 분석하면 에너지 대사의 다양한 측면을 평가할 수 있습니다 1,2. 세포 배양의 상층액에서 젖산 탈수소효소와 같은 효소의 활성을 측정하면 세포막 무결성을 정량화하는 데 도움이 될 수 있습니다3. 고정 전에 배양된 세포를 Annexin V 및 propidium iodide로 염색하면 세포사멸 및 괴사 세포를 평가할 수 있습니다4. 그러나 웰 간의 세포 밀도 차이는 이러한 각 분석의 결과에 영향을 미칩니다. 시딩 밀도에만 전적으로 의존하면 파종을 위한 세포 계수 오류, 플레이팅 중 배지의 세포 밀도 변화 또는 실험 전반에 걸쳐 샘플 또는 처리 간의 세포 성장 속도 차이로 인해 잘못된 결과를 제공할 수 있습니다. 따라서 실....

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Protocol

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참고: 추가 파일은 다음 링크에서 찾을 수 있습니다 https://osf.io/a2s4d/?view_only=2d1042eb8f7c4c4a84579fe4e84fb03c

1. 형광 현미경을 사용한 이미지 캡처 및 저장

  1. 원하는 DNA 염료로 염색하는 것을 포함하여 이미징할 세포 또는 조직 샘플을 준비합니다. 여기에 사용된 이미지를 얻기 위해, C2C12 근아세포(CRL-1772, American Type Culture Collection)를 50mMEtOH6의 유무에 관계없이 표준 배양 조건(5%CO2, 37°C, 가습)하에서 48-72시간 동안 6-웰 플레이트에서 성장시키고, 앞서 설명한 바와 같이 얼음-차가운 메탄올에 고정시켰다13. 고정 세포는 DAPI-함유 장착 매체(15)를 사용하여 장착하고 이미징 전에 암흑 속에서 건조시켰습니다.
  2. 확립된 표준 작동 절차에 따라 형광 현미경과 컴퓨터의 모든 구성 요소를 켭니다. 현미경과 연결된 소프트웨어를 엽니다.
  3. 현미경을 설정하여 s를 시각화합니다.amp접안렌즈를 통해 les. 목표를 확인합니....

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Results

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각 배치 이미지 실행은 1) 식별된 핵의 윤곽을 보여주는 윤곽이 적용된 이미지 파일 세트(그림 5) 및 2) 이미지 파일 이름과 관련 개수를 연결하는 .csv 파일(스프레드시트)을 생성합니다. 윤곽을 보면 사용자가 계수 품질을 시각적으로 평가할 수 있습니다. 구체적으로, 섹션 1에 따라 얻어진 이미지는 핵이 프로그램에 의해 계수되었음을 나타내는 실선 녹색 선으로 둘러싸인 모든(또는 거의 모든) 핵을 가져야 합니다. 이 윤곽선은 여기에서 프로그램을 조정하는 데 사용되었습니다.

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그림 5: 원본 이미.......

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Discussion

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당사의 핵 정량화 프로그램은 기존 옵션에 비해 몇 가지 장점이 있습니다: 최소한의 기술만 필요하고, 핵 정량화의 특정 작업에 대해 검증되었으며, 오픈 소스입니다. 후자는 비용 관련 장벽을 극복합니다. 궁극적으로 이 프로그램은 세포 및 분자 생물학자에게 형광 현미경을 사용하여 캡처한 이미지에서 핵을 빠르고 정확하게 정량화할 수 있는 추가 옵션을 제공합니다. 현재 사용 가능한 자동 핵 또는 세포 계수 프로그램은 모든 사용자가 선호하지 않으며, 일부는 비용이 많이 들고, 특정 응용 분야에 대한 검증이 최소한이거나 아예 없을 수 있습니다. BioTek Cytation 라인과 같은 특수 장비에는 다양한 추가 응용 분야 외에도 핵 염색20을 사용하여 현장 세포 계수를 검증하는 기술 게시판이 함께 제공됩니다. 검증 데이터가 존재하고 Cytation 제품 라인이 널리 사용되지만, 특히 살아있는 세포 데이터를 쉽고 효율적으로 정규화하기 위해 .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

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이 연구를 위한 자금은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)/국립노화연구소(National Institute on Aging, R01AG084597; DEL 및 HYL) 및 텍사스 공과 대학(DEL)의 창업 자금으로 지원되었습니다. 저자는 이 작업에 기여한 학부 연구자(REH, MRD, CJM, AKW)에게 재정적 지원을 제공한 Texas Tech University Undergraduate Research Scholars 및 TrUE Scholars 프로그램에 감사를 표합니다. 또한 실험실 공간과 장비를 친절하게 공유해 주신 Lauren S. Gollahon 박사와 Michael P. Massett 박사에게도 감사드립니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
방법 2 또는 3의 결과 파일에 액세스할 수 있는 컴퓨터-2.6단계(방법 2) 또는 3.3.9 또는 3.4.9단계(방법 3)를 참조하십시오인터넷
에 액세스할 수 있는 컴퓨터, 최신 브라우저(예: Google Chrome
) 인터넷에 액세스할 수 있는 컴퓨터, 최신 브라우저 및 Windows OS는 다양합니다Mac, Linux 또는 기타 OS의 경우 방법 3 이미지
캡처용 소프트웨어가 있는 컴퓨터를 사용합니다.ZeissAxioVision기타 소프트웨어는 허용됩니다. 형광 현미경과 호환되어야 합니다
출력을 위한 파일 위치(결과 스프레드시트 및 이미지 윤곽)--빈 새 폴더일 수 있습니다
광 현미경ZeissAxiovert 200M다른 형광 현미경은 허용됩니다. 적절한 필터 큐브, 원하는 대물렌즈 및 카메라가 장착되어 있어야 합니다.
정량화할 모든 이미지가 포함된 폴더--1.12단계 참조
Python 버전 3.10 이상Python-https://www.python.org/downloads/ 에서 무료로 다운로드 및 설치할 수 있습니다.
이미징할 샘플--형광 DNA 염료로 고정 또는 살아, 염색 또는 대조염
프레드시트 소프트웨어MicrosoftExcel유사한 스프레드시트 소프트웨어도 허용됩니다
. 형색 스.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chacko, B. K., et al. The bioenergetic health index: A new concept in mitochondrial translational research. Clin Sci. 127 (6), 367-373 (2014).
  2. Desousa, B. R., et al. Calculation of ATP production rates using the Seahorse XF Analyzer. EMBO Rep....

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