시험관 내 및 생체 내 골수 세포와 CAR T 세포 간의 상호 작용 연구

자가 키메라 항원 수용체 T(CART) 세포 요법은 재발성 또는 불응성 혈액 악성 종양 치료에서 임상적 성공을 거두었으며, 이로 인해 미국 FDA는 CD19 또는 B 세포 성숙 항원(BCMA⁾¹을 표적으로 하는 6개의 CART 제품을 승인했습니다. CART 세포 요법의 인상적인 초기 활동에도 불구하고 대부분의 환자는 치료 후 처음 1-2년 이내에 재발합니다². 최적이 아닌 T 세포 적합성, 항원 탈출, 열악한 CART 지속성, 면역억제 종양 미세환경(TME^)에 의해 매개되는 억제를 포함하여 CART 내성의 여러 메커니즘이 확인되었습니다^2,3. 단핵구 및 대식세포와 같은 골수 세포는 종종 TME의 상당 부분을 구성하며 T 세포를 포함한 다른 면역 세포의 주요 억제제인 것으로 입증되었습니다 ^4,5. CART 세포 치료 효능의 맥락에서 골수 세포의 해로운 영향은 전임상 모델과 혈액 및 고형 종양 모두의 임상 시험에서 보고되었습니다 ^3,6. 골수 매개 억제는 CART 제조 공정의 시작부터 발생할 수 있으며, 시작 성분채집 제품의 단핵구가 생체 외 CART 확장을 억제하는 것으로 입증되었습니다 ^7,8. 골수 매개 CART 억제에 대한 축적된 증거를 감안할 때, 많은 연구에서 더 나은 면역 반응을 위해 TME에서 면역억제 대식세포를 표적으로 삼고 제거하도록 CART 세포를 조작하는 것을 목표로 했습니다⁵. 그러나 CART 세포와 면역억제 대식세포 사이의 상호 작용 메커니즘은 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 또한 이러한 상호 작용에 대해 공개적으로 사용 가능한 이종이식 모델이 제한되어 있습니다. 따라서 시험관 내 및 마우스 모델 모두에서 인간 대식세포와 CART 세포 간의 상호 작용을 연구하는 모델이 시급히 필요합니다.

여기에서는 인간 CD19 표적 CART(CART19) 세포를 CD19⁺ 종양 세포 및 생체 외 분극 M2 유사 대식세포와 공동 배양하는 방법을 설명합니다. 또한, 우리는 면역결핍 마우스가 표적 세포와 인간 대식세포를 모두 피하에 생착하여 면역억제 대식세포가 있는 환경에서 관심 있는 면역 요법을 평가할 수 있는 이종이식 마우스 모델을 보고합니다. 구체적으로, 우리는 시험관 내에서 면역억제성 대식세포의 존재 또는 부재 상태에서 CART 항원 특이적 증식을 분석했으며, 트랜스웰 및 직접 공동 배양 플레이트 모두에서 T 세포 확장에 상당한 억제를 보여주었습니다. 우리의 이종이식 모델에서 NSG 마우스는 치료 스크리닝을 위해 마트리겔에 현탁된 종양 세포와 인간 대식세포를 피하 생착했습니다. 이 동물 모델은 생체 외 분화 면역억제 인간 대식세포가 NSG 마우스에서 종양 진행을 촉진할 수 있음을 성공적으로 보여주었습니다. 이 프로토콜을 따르면 소분자 약물, 생물학적 제제 및 기타 세포 기반 치료법을 포함하여 면역억제 대식세포 표적 치료제의 효능을 테스트할 수 있습니다. 그러나 인간 TME를 연구하기 위해 면역결핍 마우스를 사용하는 것의 한계로 인해 제안된 모델은 개념 증명 연구에 가장 적합합니다.

아래 프로토콜은 Mayo Clinic의 IRB(Institutional Review Board), IBC(Institutional Biosafety Committee) 및 Institutional Animal Care and Use Committee 프로토콜 A00001767에 따른 비교 의학과의 지침을 따릅니다.

1. 시험관 내 연구를 위한 인간 고전적 단핵구의 준비

1. 이전에 설명한 대로 건강한 헌혈자로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리합니다⁹. 간단히 말해서, 전혈을 PBS에 2% FBS로 1:1의 부피비로 희석한 다음 밀도 구배 배지에서 PBMC를 분리합니다.
2. 제조업체의 지침에 따라 음성 마그네틱 비드 선택을 통해 수확된 PBMC에서 인간 고전적 단핵구(CD14⁺CD16^-)를 분리합니다( 재료 표). 간단히 말해서, 적절한 수의 PBMC를 분리 완충액으로 세척하고 제조업체의 지침에 따라 표시된 부피로 세포를 재현탁합니다. 항체 칵테일과 자성 마이크로비드로 고전적인 단핵구를 제외한 세포를 라벨링합니다. 플로우 스루에서 고전적인 단핵구를 수집하고 컬럼에 비단핵구를 유지합니다.
   참고: 전체 PBMC의 5%가 고전적 단핵구라고 가정하고 그에 따라 PBMC의 시작 세포 수를 조정합니다. 1.7단계에서 단핵구 집단의 순도 확인을 위해 나머지 PBMC를 저장합니다. 고전적 단핵구는 사전 냉동 보존 없이 항상 신선한 PBMC에서 분리되어야 합니다.
3. 세포 계수기(Table of Materials)를 사용하여 분리된 단핵구의 수를 계산하고 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 세포를 스핀다운합니다. 세포를 세포 분리 완충액에 재현탁하여 최종 농도로 1 x 10⁶ cells/mL에 도달합니다. 100μL의 세포 현탁액을 취하여 바닥이 평평한 96웰 플레이트로 옮깁니다.
4. 1 x 10⁵ PBMC를 음성 게이팅 대조군과 동일한 플레이트로 옮겨 유세포 분석법으로 고전적인 단핵구 집단 순도를 확인합니다. 세포를 4°C에서 300 x g 에서 3분 동안 스핀다운합니다. 1.5-1.12단계 동안 분리된 단핵구를 얼음 위에 보관합니다.
5. 200μL의 FACS 완충액으로 세포를 재현탁하여 세척하고 4°C에서 3분 동안 300 x g 으로 세포를 스핀다운합니다. 상청액을 조심스럽게 디캔팅하십시오.
6. 각 샘플에 대해 0.3 μL의 생/사체 시약(405 nm에서 여기), 0.5 μL의 APC 접합 항인간 CD14¹⁰ (1 ng/μL) 및 0.5 μL의 PE 접합 항인간 CD16¹¹ (1 ng/μL; 재료 표).
   참고: 염색을 일관되게 유지하려면 총 샘플 수에 따라 여러 샘플에 대한 마스터 믹스를 만드십시오. 50μL의 염색 용액을 각 웰에 옮깁니다.
7. 각 웰에 50μL의 염색 용액을 첨가하고 기포가 생기지 않도록 세포를 부드럽게 혼합합니다. 실온에서 15분 동안 어두운 곳에서 세포를 배양합니다.
8. 각 웰에 200μL의 FACS 완충액을 첨가하고 4°C에서 3분 동안 300 x g 에서 세포를 스핀다운합니다. 상청액을 조심스럽게 디캔팅하십시오.
9. 각 웰에 200μL의 FACS 완충액을 첨가하여 세척하고 4°C에서 3분 동안 300 x g 으로 세포를 스핀다운합니다. 상청액을 조심스럽게 디캔팅하고 세포를 200μL의 FACS 완충액에 재현탁합니다. 유세포 분석기에서 샘플을 실행합니다(재료표).
10. 게이트 CD14⁺CD16^- 모집단. 이상적인 순도를 위해 CD14⁺CD16^- 집단이 살아있는 세포의 90% 이상인지 확인하십시오. 게이트 CD14⁺CD16^- 살아있는 일중항의 집단.
    참고: 사용자가 유세포 분석 분석에 익숙하다고 가정합니다.

2. 인간 고전적 단핵구에서 M0 대식세포 분화

참고: 인간 고전적 단핵구로부터의 M2 유사 대식세포 분화는 이전 간행물¹²에서 채택되었습니다.

1. 분리된 단핵구를 4°C에서 300 x g 로 5분 동안 회전시키고 상청액을 흡인합니다. 세포 배양 배지에 세포를 재현탁하여 1 x 10⁶ cells/mL의 최종 농도에 도달합니다.
2. 인간 재조합 GM-CSF를 첨가하여 최종 농도 10ng/mL(재료 표)에 도달하고 잘 혼합합니다. 100μL의 세포를 조직 배양 처리된 48웰 플레이트로 옮기고 50μL의 세포 배양 배지를 추가로 추가합니다. 각 조건에 11일째의 최종 판독값을 위해 3개의 반복이 있는지 확인하십시오.
   참고: 사용자는 그에 따라 더 많은 실험 그룹을 추가할 수 있습니다. 이 프로토콜은 M2 유사 대식세포가 있거나 없는 종양 세포 및 T 세포의 실험적 공동 배양만을 포함합니다(표 1).
3. 100μL의 세포를 다른 48웰 플레이트로 옮기고 대식세포 표현형 분석을 위해 50μL의 세포 배양 배지를 추가합니다. M0 대식세포의 표현형 분석을 위한 웰 1개와 M2 유사 대식세포의 표현형 분석을 위한 웰을 포함해야 합니다.
4. 세포 배양 증발을 방지하기 위해 주변 웰에 200μL의 PBS를 추가합니다. 단핵구를 37°C에서 7일 동안 배양하여 세포를 M0 대식세포로 분화시킵니다.
5. 분화된 대식세포와 기증자 일치 CART19 세포 사이의 상호작용을 연구하기 위해, 동일한 기증자의 PBMC로부터 1 x 10⁷ T 세포를 분리하고 이전에 기술한 바와 같이 8일 CART 생산 절차에 따라 CART19 세포를 생성한다 ^9,13,14.
   참고: CD28 신호 전달 도메인으로 공동자극된 CART 세포는 이전에 기술된 바와 같이 5 x 10⁶ T 세포로부터 생성된다 ^9,13,14. 병행하여, 형질도입되지 않은(UTD) T 세포는 동일한 과정 ^9,13,14에 따라 생성된다. UTD T 세포는 동종 증식을 제어하기 위해 T 세포 증식에서 음성 대조군으로 사용됩니다.

3. 표적 세포와의 공동 배양을 통한 M0 대식세포로부터의 M2 유사 대식세포 분화

1. 7일째에 M0 대식세포가 있는 48웰 플레이트를 가져와 얼음 위에서 최소 30분 동안 배양합니다. 플레이트를 얼음 위에 유지하면서 지속적으로 세포를 세게 피펫팅합니다.
   참고: 얼음 배양 기간은 대식세포의 부착 방식에 따라 달라지며, 이는 기증자 차이로 인해 다를 수 있습니다. 첫 번째 혼합은 느슨하게 부착된 대식세포를 수집하는 것이므로 5분 피펫팅으로 충분합니다.
2. 분리된 세포를 얼음 위에서 미리 냉각된 신선한 15mL 원뿔형 튜브(재료 표)로 옮깁니다. 얼음처럼 차가운 PBS 200μL를 48웰 플레이트의 웰에 추가하고 대부분의 대식세포가 바닥에서 분리될 때까지 10분마다 나머지 세포를 세게 피펫팅합니다. 각 피펫팅 후 현미경으로 세포를 확인하고 필요에 따라 얼음 배양 시간을 조정하여 부착 세포가 더 많은 경우 배양 시간을 연장합니다.
3. 나머지 분리된 M0 대식세포를 얼음 위의 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 세포를 조심스럽게 혼합하고 세포 계수기에서 세포를 계산합니다.
4. 세포를 4°C에서 300 x g 로 5분 동안 스핀다운하고 상청액을 흡인합니다. 얼음처럼 차가운 PBS에 재현탁하여 1 x 10⁶ cells/mL의 최종 농도에 도달합니다.
5. 200μL의 세포를 바닥이 평평한 96웰 플레이트(재료표)로 옮깁니다. 세포를 4°C에서 300 x g 에서 3분 동안 스핀다운합니다. 상청액을 조심스럽게 디캔팅하십시오. 음성 게이팅 대조군으로 부모 모집단의 마커로만 염색된 추가 웰을 추가합니다.
6. 1μL의 Fc 수용체 차단 용액이 보충된 100μL의 FACS 완충액을 각 샘플에 추가합니다. 실온에서 10분 동안 세포를 배양합니다. 세포를 4°C에서 300 x g 에서 3분 동안 스핀다운합니다. 상청액을 조심스럽게 디캔팅하십시오.
   참고: 위양성 결과를 방지하기 위해 실제 마커 염색 전에 대식세포를 Fc 수용체 차단 완충액과 함께 사전 배양하는 것이 중요합니다.
7. 샘플 웰의 경우, 0.3 μL의 생/사체 시약(405 nm에서 여기), 0.5 μL의 APC 접합 항인간 CD14^{10 (} 1 ng/μL), 0.5 μL의 APC/Cy7 접합 항인간 CD206¹⁵ (2 ng/μL) 및 0.5 μL의 PerCP 접합 항인간 CD163¹⁶ (2 ng/μL; 재료 표). 음성 게이팅 대조군의 경우, 0.3 μL의 생/사체 시약 및 0.5 μL의 APC 접합 항인간 CD14를 포함하는 50 μL의 FACS 완충액을 준비합니다.
8. 각 웰에 50μL의 염색 용액을 첨가하고 기포가 생기지 않도록 세포를 부드럽게 혼합합니다. 실온에서 15분 동안 어두운 곳에서 세포를 배양합니다.
9. 각 웰에 200μL의 FACS 완충액을 추가합니다. 세포를 4°C에서 300 x g 에서 3분 동안 스핀다운합니다. 상청액을 조심스럽게 디캔팅하십시오.
10. 200μL의 FACS 완충액을 첨가하여 세척합니다. 세포를 4°C에서 300 x g 에서 3분 동안 스핀다운합니다. 상청액을 조심스럽게 디캔팅하고 세포를 200μL의 FACS 완충액에 재현탁합니다.
11. 유세포 분석기에서 샘플을 실행하고 CD14⁺CD206⁺CD163⁺ 세포 집단을 게이트합니다. M0 대식세포에서 CD163 및 CD206의 발현을 M2 유사 표현형의 기준선으로 사용합니다. M2 유사 대식세포에서는 CD163^낮은CD206^낮은 CD163^높 음 또는 CD206^높 음으로의 인구 이동이 예상됩니다. 인구 이동의 규모는 기증자에 따라 달라질 수 있습니다.
12. 관심 있는 종양 세포주를 준비하고 세포 계수기에서 계산합니다.
    참고: 이 프로토콜은 비부착 CD19⁺ 맨틀 세포 림프종 세포주인 JeKo-1을 표적으로 사용합니다. 다른 종양 세포주 및 M0에서 M2 유사 대식세포를 분화하는 능력을 필요에 따라 테스트할 수 있습니다.
    1. 공급업체가 제안한 배양 배지(재료 표)를 사용하여 조직 배양 플라스크에서 1 x 10⁶ cells/mL로 JeKo-1 세포를 유지합니다. 플라스크에 종양 세포를 섞고 세포 계수기로 계산합니다.
13. 표적 세포를 4°C에서 300 x g 로 3분 동안 스핀다운하고 상청액을 흡인합니다. 표적 세포를 세포 배양 배지로 재현탁하여 최종 농도인 2 x 10⁶ cells/mL에 도달합니다.
    참고: 실험군의 수에 따라 적절한 수의 종양 세포를 준비합니다. M2 표현형 플레이트를 포함하여 각 M2 유사 대식세포 공동 배양 그룹에 대해 2 x 10⁵ 표적 세포가 있는지 확인하십시오.
14. 100μL의 종양 세포를 0일에 준비된 48웰 플레이트의 M2 유사 대식세포 공배양 그룹으로 옮기고 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 세포를 37°C에서 24시간 더 배양합니다.
    참고: JeKo-1:M0 대식세포의 2:1 비율은 M2 유사 표현형 분화에 대해 테스트되었습니다. 필요에 따라 다른 비율을 테스트할 수 있습니다.
15. 8일째에 M2 유사 표현형 플레이트를 얼음 위에 놓고 세포를 격렬하게 분리하고 단계 3.4-3.11에 설명된 대로 표현형 분석을 준비합니다.
    참고: M2 유사 대식세포는 M0 대식세포보다 훨씬 더 부착력이 높으므로 더 긴 얼음 배양이 필요할 것으로 예상됩니다. 이 프로토콜은 세포에 대한 스트레스를 최소화하기 위해 대식세포를 분리하기 위해 얼음과 얼음처럼 차가운 PBS만 사용합니다.
16. 7일째의 M0 표현형 분석의 유세포 분석 파일을 M2 유사 표현형과 결합합니다. M0 대식세포 샘플의 CD14⁺ 모 세포 집단의 CD206 및 CD163을 게이트하고 M2 유사 대식세포 샘플에 동일한 게이팅 전략을 적용하여 집단 이동을 시각화합니다.
17. T 세포를 공동 배양에 도입하려면 2.5단계에서 생성된 8일째 CART19 및 UTD T 세포를 수확하고 세포를 50mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 피펫으로 잘 섞고 세포 계수기로 계산합니다.
18. 세포를 4°C에서 300 x g 로 5분 동안 스핀다운하고 상청액을 조심스럽게 흡인합니다. CART 또는 UTD T 세포를 세포 배양 배지에 재현탁하여 최종 농도인 2 x 10⁶ cells/mL에 도달합니다.
19. 종양 세포주를 준비하고 세포 계수기에서 계산합니다. 세포를 4°C에서 300 x g 으로 5분 동안 회전시키고 상청액을 흡인합니다.
20. 종양 세포를 세포 배양 배지로 재현탁하여 최종 농도인 2 x 10⁶ cells/mL에 도달합니다. 100μL의 종양 세포를 M2 유사 대식세포가 없는 공동 배양 웰로 옮깁니다(표 1).
21. 100μL의 CART 또는 UTD T 세포를 적절한 공동 배양 웰로 옮깁니다(표 1). M2 유사 대식세포와의 최종 공동 배양은 종양 세포, T 세포 및 대식세포가 2:2:1의 비율로 있어야 합니다. 대식세포가 없는 공배양을 대조군으로 사용합니다.
22. 그룹 간에 최종 부피를 일관되게 유지하려면 대식세포가 없는 웰에 100μL의 세포 배양 배지를 추가합니다. 세포를 37°C에서 3일 동안 배양합니다.
    참고: 동종 CART 세포를 사용하는 경우, 사용자는 동종 유도 T 세포 확장을 검출하기 위한 적절한 대조군으로 공배양에 기증자 일치 UTD T 세포를 포함해야 합니다. 이 경우, 냉동 보존된 이전에 생성된 CART 및 UTD T 세포를 적절하게 해동 및 회수한 후 공동 배양에 추가하기 전에 최소 3-4시간의 휴식을 취해야 합니다.

4. 공배양의 항원 특이적 증식 분석

1. 11일째에 공동 배양 플레이트를 얼음 위에 놓고 세포를 세게 피펫팅합니다. 세포를 잘 혼합하고 세포를 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
   참고: 공동 배양의 주요 판독값은 T 세포 확장을 정량화하는 것이므로 사용자가 동일한 패널에서 대식세포에 대한 다른 마커도 분석할 계획이 없는 한 대식세포를 분리할 필요가 없습니다.
2. 얼음처럼 차가운 PBS 200μL를 샘플 웰에 넣고 세게 피펫팅합니다. 나머지 용액을 동일한 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
3. 현미경(10배)으로 웰을 확인하여 현탁 세포가 완전히 수확되고 있는지 확인합니다. 세포를 4°C에서 300 x g 로 5분 동안 스핀다운하고 상청액을 흡인합니다.
4. 200μL의 FACS 완충액으로 모든 조건에서 세포를 재현탁하고 바닥이 평평한 96웰 플레이트로 옮깁니다. 세포를 4°C에서 300 x g 에서 3분 동안 스핀다운합니다. 상청액을 조심스럽게 디캔팅하십시오.
5. 0.3 μL의 생/사체 시약(405 nm에서 여기)과 0.5 μL의 APC 접합 항인간 CD3¹⁷ (1 ng/μL; 재료 표) 각 샘플 우물에 대해. 각 웰에 50μL의 염색 용액을 첨가하고 기포를 방지하기 위해 피펫으로 세포를 조심스럽게 혼합합니다.
   알림: 이 단계에서는 큰 세포 펠릿이 있습니다. 모든 T 세포가 염색되고 있는지 확인하려면 플레이트 바닥을 확인하여 완전히 혼합한 후 남아 있는 세포 펠릿이 없는지 확인하십시오.
6. 실온에서 15분 동안 어두운 곳에서 세포를 배양합니다. 각 웰에 200μL의 FACS 완충액을 추가합니다. 세포를 4°C에서 300 x g 에서 3분 동안 스핀다운합니다. 상청액을 조심스럽게 디캔팅하십시오.
7. 200μL의 FACS 완충액을 첨가하여 세척합니다. 세포를 4°C에서 300 x g 에서 3분 동안 스핀다운합니다. 상청액을 조심스럽게 디캔팅하고 세포를 200μL의 FACS 완충액에 재현탁합니다.
8. 유세포 분석기에서 샘플을 실행합니다. CD3⁺ 세포를 게이트하고 아래와 같이 살아있는 CD3⁺ 세포의 절대 수를 정량화합니다.
   
9. GraphPad Prism을 사용하여 각 조건에서 CD3⁺ 세포의 절대 수를 그래프로 표시합니다.
   참고: M2 유사 대식세포와의 공동 배양은 M2 유사 대식세포가 없는 조건보다 CD3 T 세포의 절대 수가 훨씬 낮을 것으로 예상됩니다.

5. 트랜스웰 시스템에서 CART 세포에 대한 M2 유사 대식세포의 영향

참고: Transwell 플레이트는 자극된 CART 세포에서 M2 유사 대식세포를 물리적으로 분리하고 용해성 분자만 세포 유형 간에 이동하도록 허용하여 사용자가 대식세포와 CART 세포 간의 접촉 독립적 상호 작용의 역학을 연구할 수 있도록 합니다(그림 1).

1. 1 x 10⁶ 인간 고전적 단핵구를 분리하고 단계 1.1-1.10에 설명된 대로 유세포 분석법으로 집단 순도를 확인합니다. 1 x 10 6^{개의 단핵} 구를 4°C에서 300 x g 로 5분 동안 회전시키고 상청액을 흡인합니다.
   참고: 사용자는 2.5단계에 설명된 대로 자가 CART 및 기증자 일치 UTD 세포를 생성하기를 원할 수 있습니다.
2. 세포 배양 배지에 세포를 재현탁하여 1 x 10⁶ cells/mL의 최종 농도에 도달합니다. 인간 재조합 GM-CSF를 첨가하여 최종 농도 10ng/mL에 도달하고 잘 혼합합니다.
3. 200μL의 재현탁된 세포를 3번의 기술 반복실험으로 24웰 트랜스웰 플레이트(0.4μm)의 하단 웰로 옮깁니다. 각 웰에 100μL의 세포 배양 배지를 추가하고 웰 바닥이 완전히 덮여 있는지 확인합니다. 대식세포가 없는 조건(양성 대조군)을 위해 300μL의 세포 배양 배지를 다른 3개의 웰에 추가합니다.
4. 세포 배양 증발을 방지하기 위해 주변 웰에 200μL의 PBS를 추가합니다. 세포를 37°C에서 7일 동안 배양합니다.
5. 7일째에 1.4 x 10⁶ JeKo-1 종양 세포를 준비하고 15mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 세포를 4°C에서 300 x g 으로 5분 동안 회전시키고 상청액을 흡인합니다.
6. 종양 세포를 세포 배양 배지로 재현탁하여 2 x 10⁶ cells/mL의 최종 농도에 도달합니다. 모든 샘플 조건의 하단 웰에 200μL의 종양 세포를 추가하고 잘 혼합합니다. 세포를 37°C에서 24시간 더 배양합니다. JeKo-1만 양성 대조군으로 있는 바닥 웰을 사용하십시오.
7. 8일째에, 단계 5.1에서 생성된 8일째 CART 및 UTD T 세포를 수확한다. T 세포를 세포 배양 배지에 재현탁하여 1 x 10⁶ 세포/mL의 최종 농도에 도달합니다.
   참고: 동종 CART 세포를 사용하는 경우, 사용자는 3.22단계에 설명된 대로 공배양에 기증자 일치 UTD T 세포를 포함해야 합니다.
8. 1.4 x 10⁶ JeKo-1 세포를 계수하고 준비합니다. 종양 세포를 15mL 원심분리기 튜브로 옮기고 4°C에서 300 x g 로 세포를 5분 동안 스핀다운합니다.
9. 상청액을 흡인하고 세포 배양 배지에 세포를 재현탁하여 최종 농도인 1 x 10⁶ cells/mL에 도달합니다. 모든 샘플 조건에 대해 100μL의 준비된 T 세포와 100μL의 종양 세포를 각 상부 웰로 옮깁니다.
10. 상부 웰에서 세포를 완전히 혼합하고 37°C에서 3일 동안 배양합니다.
11. 11일째에 상부 챔버에서 세포를 혼합하고 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 200μL의 PBS로 상부 웰을 세척하고 나머지 세포를 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
12. 세포를 4°C에서 300 x g 로 5분 동안 스핀다운하고 상청액을 흡인합니다. 단계 4.4-4.9에 설명된 대로 T 세포 증식 분석을 수행한다.
    참고: JeKo-1 편광 M2 유사 대식세포는 접촉 독립적인 방식으로 항원 특이적 T 세포 증식을 억제할 수 있습니다. 필요에 따라 다른 종양 모델을 테스트할 수 있습니다.

6. NSG 마우스에서 인간 대식세포와 종양을 모두 이용한 이종이식 모델 구축

1. 1 x 10⁷ 인간 고전적 단핵구를 분리하고 단계 1.1-1.10에 설명된 대로 유세포 분석법으로 순도를 확인합니다. 그림 2에 도시된 바와 같이 M2-유사 대식세포의 전종양 효과를 확인하기 위해 JeKo-1 단독으로 생착된 NSG 마우스를 대조군으로 사용합니다.
   참고: 이 프로토콜은 NSG 마우스에 5 x 10⁵ 인간 대식세포를 피하에 생착합니다. 7일째 분리 후 대식세포 회복률은 약 50%입니다. 사용자는 그에 따라 셀 번호를 조정하고 추가 셀을 준비할 수 있습니다.
2. 분리된 단핵구를 4°C에서 300 x g 로 5분 동안 회전시키고 상청액을 흡인합니다. 세포 배양 배지에 세포를 재현탁하여 1 x 10⁶ cells/mL의 최종 농도에 도달합니다.
3. 인간 재조합 GM-CSF를 첨가하여 최종 농도 10ng/mL에 도달하고 잘 혼합합니다. 단핵구를 T25 조직 배양 플라스크로 옮기고 세포를 37°C에서 7일 동안 배양합니다.
4. 7일째에 10분마다 얼음 위에 세포를 세게 피펫팅하고 대부분의 대식세포가 분리될 때까지 현미경으로 세포를 확인합니다. 세포를 얼음 위의 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고, 얼음처럼 차가운 PBS로 플라스크를 세척하여 나머지 세포를 풀어준 다음 원뿔형 튜브에서 세포를 결합합니다.
5. 셀 카운터에서 셀 수를 계산합니다. 세포를 4°C에서 300 x g 로 5분 동안 스핀다운하고 상청액을 흡인합니다.
6. 얼음처럼 차가운 PBS 5mL로 세포를 세척하고 재현탁합니다. 세포를 4°C에서 300 x g 로 5분 동안 스핀다운하고 상청액을 흡인합니다.
7. 얼음처럼 차가운 PBS에 세포를 재현탁하여 최종 농도인 2 x 10⁷ cells/mL에 도달합니다. 세포 용액을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관합니다.
8. 1.5 x 10⁷ 루시페라아제⁺ JeKo-1 세포를 준비하고 세포를 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
   참고: 주입된 세포의 수가 적기 때문에 종양 부담을 모니터링하기 위해 생물발광 이미징(BLI)이 필요합니다. 피하 주사를 위한 대식세포와 종양 세포의 수는 필요에 따라 확장될 수 있습니다. 주사 후 캘리퍼스로 종양이 보이고 접근할 수 있는 경우 야생형 종양 세포를 대신 사용할 수 있습니다.
9. 세포를 4°C에서 300 x g 으로 5분 동안 스핀다운하고 상청액을 흡인합니다. 얼음처럼 차가운 PBS에 세포를 재현탁하여 최종 농도인 4 x 10⁷/mL에 도달합니다.
10. 동일한 부피의 대식세포와 종양 세포를 다른 신선한 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 잘 혼합합니다. 동일한 부피의 가용화된 기저막 매트릭스를 혼합 세포 용액에 첨가하고 얼음 위에서 잘 혼합합니다.
    참고: 기저막 매트릭스는 응고를 방지하기 위해 얼음 위에서 밤새 해동해야 합니다. 이 시점에서 세포 용액 100μL마다 기저막 매트릭스에 5 x 10⁵ 개의 대식세포와 1개의 10⁶ 개의 JeKo-1이 현탁되어 있으며, 이는 시험관 내 M2 유사 대식세포 분화 프로토콜에서 사용되는 것과 동일한 세포 수 비율을 사용합니다.
11. 대조군으로서, 동일한 부피의 얼음처럼 차가운 PBS로 준비된 나머지 JeKo-1 세포를 신선한 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮기고, 동일한 부피의 기저막 매트릭스를 세포 용액에 첨가하고 얼음 위에서 잘 혼합합니다.
12. 2.5% 이소플루란으로 흡입 마취를 위해 10마리의 6-8주령 암컷 및 수컷 NOD-SCID-γ-/-(NSG) 마우스(~20g)를 준비합니다. 설치류 흡입 마취 장치를 사용하여 이소플루란 마취를 도입합니다. 기화된 이소플루란은 챔버와 노즈 콘이 있는 가열 단계로 전달됩니다.
13. 마우스를 마취실에 1-2분 동안 넣습니다. 자세 및 오른쪽 반사가 상실되면 가열된 단계의 노즈콘으로 마우스를 옮깁니다¹⁸. 절차 내내 마우스를 가열 단계에 두십시오. 마취 중 깜박임 반사 상실로 인한 각막 손상을 방지하기 위해 마우스의 양쪽 눈에 눈 연고를 바릅니다.
14. 마우스를 마취한 후 피부를 노출시키기 위해 각 마우스의 오른쪽 옆구리를 조심스럽게 면도합니다. 0.5mL 주사기에 100μL의 JeKo-1-대식세포 세포 혼합물을 넣고 용액에서 기포를 조심스럽게 제거합니다.
15. 노출된 피부를 손으로 조심스럽게 들어 올리고 들어 올린 부위에 바늘을 삽입합니다. 바늘로 피부를 계속 들어 올리고 주사 부위를 한 손가락으로 누릅니다. 우발적인 구멍 및 세포 누출을 방지하기 위해 일단 삽입된 바늘을 움직이지 마십시오.
16. 세포를 피하층으로 천천히 방출하고 바늘을 조심스럽게 제거합니다. 10마리의 NSG 마우스 모두에 대해 피하 주사를 반복하며, 5마리의 마우스는 JeKo-1과 대식세포를 모두 투여받고 5마리의 마우스는 JeKo-1 단독을 투여받습니다.
17. D-루시페린(재료표)을 15mg/mL의 농도로 준비합니다. 0.5mL 주사기에 200μL의 D-루시페린을 로드하고 각 마우스에 복강 내로 주입합니다.
18. D-루시페린 주사 후 10분 동안 마취된 마우스를 BLI 스테이지에 놓습니다. 각 마우스에 대해 BLI를 수행하고 기준선(0일) 종양 부하로 기록합니다. 쥐를 케이지에 다시 넣습니다.
    참고: 사용자는 영상 촬영 후 흉골 누운 자세를 유지하기 위해 의식을 회복할 때까지 마취된 쥐를 방치하지 않도록 해야 합니다.
19. 실험적 또는 인도적 종점에 도달할 때까지 일주일에 2회 BLI로 종양 부하를 모니터링합니다. 전체 생존 종점은 종양 부피가 아래 공식으로 계산된 2000mm³ 이상이 되면 도달합니다.
    
    참고: 종양 모니터링 기간은 실험의 목적과 원하는 판독값에 따라 조정할 수 있습니다. 처음 2-3주 동안의 종양 크기가 매우 작기 때문에 BLI는 종양 부담 적응증에 권장됩니다. 종양이 캘리퍼스로 보이고 접근할 수 있게 되면 정확한 종양 분석을 위해 BLI와 캘리퍼스 측정을 모두 권장합니다.
20. NSG 마우스에서 생착된 인간 대식세포와 자가 CART19 세포 사이의 상호작용을 연구하기 위해, 단계 6.1-6.16에 기술된 바와 같이 생체 외 분화된 인간 대식세포를 생성하고 생착한다. 이전에 설명한 바와 같이 6.1단계에서 동일한 헌혈자로부터 자가 T 세포를 분리합니다 ^9,13,14.
    참고: 각 NSG 마우스는 2 x 10⁶ CART19 세포로 처리됩니다. 사용자는 10마리의 마우스를 치료하기 위해 최소 2 x 10^{7 CART} 세포를 생성해야 합니다. CART 세포는 8일째에 냉동 보존되고 피하 주사 후 5일 후에 JeKo-1/대식세포가 마우스에 생착될 때까지 보관됩니다.
21. 종양/대식세포 주사 5일 후, 단계 6.17-6.18에 설명된 대로 BLI에 기초하여 마우스를 무작위화합니다. 3.22단계에 설명된 대로 CART 셀을 해동하고 준비합니다. CART 세포를 PBS로 세척하고 세포를 4°C에서 300 x g 로 5분 동안 스핀다운합니다.
22. CART 세포를 PBS에 재현탁하여 최종 농도인 2 x 10⁷ cells/mL에 도달합니다. 0.5mL 주사기에 100μL의 준비된 CART 세포를 로드하고 꼬리 정맥을 통해 각 종양 생착 마우스에 정맥 주사합니다.
23. 4주 동안 일주일에 한 번 BLI로 종양 부하를 모니터링합니다.
    참고: 생착된 인간 대식세포의 면역억제 기능으로 인해 JeKo-1/대식세포를 주입한 마우스에서 손상된 CART 항종양 활성 및 더 높은 종양 부담이 예상됩니다.

7. 면역형광 염색에 의한 생착된 인간 대식세포에서 M2 유사 표현형 확인

1. 면역형광 염색에 의해 단계 6에 기술된 생착된 인간 대식세포에서 JeKo-1 유도 M2 유사 표현형을 확인하기 위해, 단계 6.1-6.19에 따르고, 주입된 대식세포 및 루시페라아제⁺ JeKo-1의 수를 NSG 마우스당 각각 5 x 10⁶ 세포 및 1 x 10⁷ 세포로 확대한다.
   참고: 사용자는 각 마우스의 최종 주입량이 100μL인지 확인해야 합니다.
2. 7일째에 NSG 마우스를 CO₂로 안락사시키고, 자궁경부 탈구를 수행하고, 앞서 설명한 바와 같이 각막 반사의 상실을 확인한다¹⁹. 종양이 위쪽을 향하도록 작업대에 마우스를 놓습니다. 종양 부위에 70% 에탄올을 뿌리고 가위와 겸자로 생착된 종양을 조심스럽게 채취합니다.
3. 이전에 설명한 바와 같이 고정을 위해 20-30mL의 4% 파라포름알데히드로 채워진 50mL 원뿔형 튜브로 종양 조직을 옮깁니다²⁰. 이전에 발표된 프로토콜에 따른 면역형광 염색을 위한 냉동 보존 및 냉동 절편 종양 조직²⁰.
4. AF546과 접합된 마우스-항-인간 CD206 항체 (1:50) 및 AF647과 접합된 토끼-항-인간 iNOS 항체를 면역형광 염색 완충액에서 희석한 후 이전에 기술한 바와 같이 핵 염색 및 보존으로 종양 조직 슬라이드를 염색합니다²¹.
   참고: 최적의 염색 결과를 위해 사용자는 특히 다른 종양 세포주를 사용하는 경우 그에 따라 항체 적정을 수행해야 합니다.
5. 40x의 공초점 현미경으로 면역형광 이미지를 획득합니다. 생착된 인간 대식세포가 M2 유사 표현형을 발달시키는지 확인하기 위해 인간 CD206의 발현과 인간 iNOS의 최소 발현을 볼 것으로 예상합니다.

이 프로토콜의 목적은 상호 작용의 복잡한 특성과 역학 및 제한된 기존 이종이식 모델로 인해 인간 면역억제 대식세포와 CART 세포 사이의 상호 작용을 연구하기 위해 시험관 내 및 생체 내 모델을 모두 확립하는 것입니다. 프로토콜에 따라, 분리된 인간 고전적 단핵구는 M2 유사 표현형을 획득하고 기능적으로 면역억제되기 위해 분화됩니다.

분리된 인간 고전적 단핵구의 순도를 확인하기 위해 유세포 분석기에서 염색된 샘플을 실행하고 인간 CD14+CD16- 집단에 대해 게이팅하여 분석합니다(그림 3A-B). 성공적인 단핵구 분리는 살아있는 세포 모 집단에서 최소 90%의 CD14+CD16- 집단을 제공합니다. 분화된 M2 유사 대식세포를 표현형화하고 확인하기 위해 M0 대식세포와 M2 유사 대식세포를 비교할 때 CD163낮은 CD206낮은 CD163높은 또는 CD206높은 집단의 이동이 예상됩니다(그림 4). 면역억제 대식세포에 의해 부정적인 영향을 받는 CART 항원 특이적 증식의 성공적인 입증은 CART 증식의 상당한 감소를 보여줄 것입니다(그림 5A). 우리의 데이터에 따르면, JeKo-1 분화 대식세포는 또한 트랜스웰 분석에서 접촉 독립적인 방식으로 CART 항원 특이적 증식을 억제할 수 있습니다(그림 5B). 인간 면역억제 대식세포로 생착된 NSG 마우스에서 성공적인 이종이식 모델은 종양 세포만 생착한 마우스보다 훨씬 빠른 종양 진행을 보여야 합니다(그림 6). NSG 마우스에서 생착된 인간 대식세포에서 M2 유사 표현형을 추가로 확인하기 위해, 면역형광 염색에 의해 대식세포에서 인간 CD206의 발현 및 인간 iNOS의 최소 발현을 관찰해야 합니다(그림 7A-D). 생착된 면역억제제 인간 대식세포는 NSG 마우스에서 CART19 생체 내 항종양 활성을 손상시킬 것으로 예상됩니다(그림 8).

그림 1: CART 세포와 대식세포 사이의 접촉 독립적 상호작용을 연구하는 트랜스웰 분석의 스키마. 고전적 단핵구는 프로토콜에 설명된 바와 같이 트랜스웰 플레이트의 하단 챔버에서 M2 유사 대식세포로 분화됩니다. CART19 세포와 JeKo-1을 상부 웰에서 1:1의 비율로 3일 동안 공동 배양한 후 유세포 분석에 의한 CART 항원 특이적 증식 분석을 실시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 인간 면역억제 대식세포 및 종양 세포로 생착된 이종이식 NSG 마우스 모델의 스키마. 고전적 단핵구는 프로토콜에 설명된 대로 M0 대식세포로 분화됩니다. M0 대식세포를 조심스럽게 분리하고 Matrigel에서 루시페라아제+ JeKo-1과 1:2의 비율로 혼합합니다. 대조군으로서, 루시페라아제+ JeKo-1을 Matrigel에서 1:1의 부피비로 PBS와 혼합합니다. NSG 마우스는 종양 세포와 대식세포 모두를 피하 생착시키거나 종양 세포만으로 생착합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 유세포 분석법에 의한 고전적인 단핵구 집단 순도 확인. 인간 고전적 단핵구(CD14+CD16-)는 제조업체의 지침에 따라 자기 음성 비드 선택에 의해 신선한 PBMC에서 분리됩니다. PBMC와 분리된 단핵구 모두 프로토콜에 설명된 대로 유세포 분석 염색을 위해 처리됩니다. (A) 대조군으로서의 염색된 인간 PBMC의 게이팅 전략. (B) 염색된 정제된 인간 고전적 단핵구의 게이팅 전략. 대표적인 흐름 결과와 게이팅 전략이 표시됩니다. 이상적인 고전적 단핵구 분리는 순도가 >90%여야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 분화 후 대식세포의 M2 유사 표현형 분석. M0 대식세포 및 JeKo-1-분화된 M2-유사 대식세포는 프로토콜에 기술된 바와 같이 유세포 분석법에 의해 CD163 및 CD206 발현을 위해 준비됩니다. 대표적인 인구 이동은 히스토그램 하프 오버레이로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: M2 유사 대식세포는 접촉 독립적인 방식으로 CART19 항원 특이적 증식을 억제합니다. (A) JeKo-1, M2 유사 대식세포 및 T 세포를 프로토콜에 설명된 대로 3일 동안 2:1:2의 비율로 공동 배양합니다. 살아있는 CD3+ 세포의 절대 수는 유세포 분석법으로 측정됩니다. 대표적인 증식 분석이 나와 있습니다. 평균과 SEM이 표시됩니다. 총 3개의 생물학적 복제가 분석되었습니다. 양방향 분산 분석이 사용되며 *p < 0.05, ***p < 0.001입니다. (B) M2-유사 대식세포는 프로토콜에 기술된 바와 같이 트랜스웰 플레이트(0.4μm)에서 항원 자극 CART19 세포로부터 물리적으로 분리됩니다. 대표적인 증식 분석이 나와 있습니다. 평균과 SEM이 표시됩니다. 총 3개의 생물학적 복제가 분석되었습니다. 양방향 분산 분석이 사용됩니다. **p < 0.01, ****p < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 분화된 대식세포는 NSG 이종이식에서 피하 종양 진행을 촉진합니다. NSG 마우스는 프로토콜에 기술된 바와 같이 JeKo-1 또는 JeKo-1 세포 단독과 결합된 고전적인 단핵구 분화 M0 대식세포로 피하 생착됩니다. 시간 경과에 따른 종양 부담은 생물발광 영상(BLI)으로 모니터링됩니다. 평균과 SEM이 표시됩니다. 양방향 분산 분석이 사용되며 ***p < 0.001입니다. Mφ = 대식세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: NSG 마우스에서 생착된 인간 대식세포에서 M2 유사 표현형의 확인. NSG 마우스는 5 x 106 생체 외 분화 인간 대식세포 및 1 x 107 루시페라아제+ JeKo-1로 피하 생착됩니다. 종양을 채취하여 종양/대식세포 주사 후 7일 후에 면역형광 염색을 준비합니다. (A) 인간 CD206 또는 (B) iNOS는 각각 AF547(적색)과 접합된 마우스-항인간 항체 또는 AF647(자홍색)과 접합된 토끼-항인간 항체로 염색된다. (C) 실험실에서 생성된 루시페라아제+ JeKo-1은 GFP도 발현합니다(녹색). (D) DAPI는 파란색으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: CART19 생체 내 항종양 활성의 면역억제 대식세포 매개 억제. NSG 마우스에 5 x 105 인간 생체 외 편광 대식세포 및 1 x 106 루시페라아제+ JeKo-1 또는 1 x 106 루시페라아제+ JeKo-1 단독을 피하 주사한다. 마우스는 종양 주사 5일 후 꼬리 정맥으로 2 x 106 CART19를 정맥 주사합니다. 종양 부담은 4주 동안 BLI로 표시됩니다. 평균과 SEM이 표시됩니다. 양방향 분산 분석이 사용되며 *p < 0.05입니다. Mφ = 대식세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 관심 있는 CART19, 대식세포 및 JeKo-1 공배양 조건. 48웰 공배양 분석에서 CART19 또는 UTD 세포를 M2 유사 대식세포 및 JeKo-1 세포와 2:1:2의 비율로 3일 동안 공배양하였다. 트랜스웰 분석에서 M2 유사 대식세포는 하단 챔버에 파종되었고 JeKo-1 자극 CART19 또는 UTD 세포는 상부 챔버에 파종되었습니다.

SSK는 Novartis(Mayo Clinic, University of Pennsylvania 및 Novartis 간의 계약을 통해), MustangBio(Mayo Clinic을 통해) 및 Sendero(Mayo Clinic을 통해)에 라이선스가 부여된 CAR 면역 요법 분야의 특허 발명가입니다. RLS와 SSK는 Humanigen(Mayo Clinic을 통해)에 라이선스가 부여된 CAR 면역 요법 분야의 특허에 대한 발명가입니다. KY, RLS, TH, BK, ES 및 SSK는 Immix에 라이선스가 부여된 CAR 면역요법 분야의 특허에 대한 발명가입니다. SSK는 Kite, Gilead, Juno, BMS, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis/Viracta, LifEngine Animal Health Laboratories Inc., Incyte 및 Lentigen으로부터 연구 자금을 받습니다. SSK는 Kite/Gilead, Humanigen, Juno/BMS, Capstan Bio 및 Novartis와의 자문 회의에 참여했습니다. SSK는 Humanigen 및 Carisma의 데이터 안전 및 모니터링 위원회에서 활동했습니다. SSK는 Torque, Calibr, Novartis, Capstan Bio, Carisma 및 Humanigen의 컨설턴트로 활동했습니다.