방법 논문

미숙아 폐의 초기 환경을 재현하는 신생아 새끼 돼지 급성 폐 손상 모델 개발

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DOI:

10.3791/68058

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2025년 10월 31일

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1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2Division of Neonatology, Karolinska University Hospital, 3Division of Neonatology, Children's Hospital of Eastern Ontario, 4Department of Obstetrics, Gynecology and Newborn Care, University of Ottawa, 5Faculty of Medicine, University of Ottawa

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 기관지폐 이형성증의 분자 유발 요인에 대한 이해를 용이하게 하고 치료 번역을 향상시키기 위해 적절하지 않은 계면활성제 양, 고산소증, 고압 환기 및 염증을 포함하여 미숙아 폐에서 발생하는 초기 병원성 사건을 모델링하는 급성 폐 손상의 신생아 새끼 돼지 모델의 개발을 설명합니다.

초록

조산은 소아 이환율과 사망률의 주요 원인입니다. 기관지폐 이형성증(BPD)은 극도의 미숙아로 인한 심각한 결과로, 폐 성장 변화와 오래 지속되는 발달 효과를 초래합니다. BPD의 병인은 기계적 환기, 고산소증 및 염증을 발병의 주요 동인으로 포함하여 다인성입니다. 현재 BPD에 대한 치료법은 없습니다. 이 연구에서는 인간 미숙아 폐가 직면하는 임상 자극을 모방한 급성 폐 손상(ALI)의 실현 가능하고 재현 가능한 새로운 신생아 새끼 돼지 모델을 제시합니다. 계면활성제 고갈, 고산소증, 고압 환기 및 기관내 지질다당류(LPS) 투여를 결합한 다중 히트 ALI 신생아 새끼 돼지 모델은 산소 공급 장애, 폐 기능 교란, 호중구 침윤을 동반한 염증 및 조직학적 폐 손상을 초래합니다. 주요 장점은 BPD 발병을 유발하는 것으로 알려진 유해한 자극을 사용하고 유지 관리가 적다는 것입니다. 미국 흉부 학회 ALI 기준을 충족하는 고충실도 ALI를 생성합니다. 이 새끼 돼지 모델과 같은 대형 동물 모델은 초기 병원성 인자를 이해하고, 치료 표적을 식별하고, 환자에 대한 임상 번역을 촉진하는 데 중요합니다.

서론

극미숙아는 5세 미만 어린이의 주요 사망 원인입니다1. 미숙아의 가장 흔한 심각한 합병증은 만성 폐 질환인 기관지폐 이형성증(BPD)으로, 염증, 고산소증으로 인한 산화 스트레스, 인공호흡기 유발 외상 등 다인성 요인이 있습니다2. 이러한 미세 환경은 폐 성장 장애로 이어져 미숙아의 성장과 발달에 장기적인 영향을 미칠 수 있습니다3. 현재 BPD에 대한 치료법은 없습니다.

BPD의 잠재적 치료법으로 중간엽 간질 세포의 사용에 대한 최근의 체계적 검토에서는 전임상 데이터가 설치류에서만 이루어졌다는 사실이 밝혀졌습니다4. 이러한 현상은 설치류 모델의 광범위한 가용성, 사용 용이성 및 유지 관리를 고려할 때 일반적입니다. 그러나 대형 동물 모델에서의 연구 재현은 미숙아를 위한 새롭고 향후 치료법에 대한 중개 노력의 성공을 보장하는 데 중요합니다. 많은 임상 시험이 부적절한 전임상 연구로 인해 실패합니다.5 환자를 위한 치료법 개발이 느려집니다. 인간이 아닌 영장류 모델을 사용하는 것은 인간 임상 시험의 토대를 마련하기 위해 선호되는 전임상 모델이지만 힘들고 비용이 많이 들며 쉽게 접근할 수 없습니다. 신생아 새끼 돼지 모델은 신생아 치료와 유사한 약물 및 장비를 사용하여 임상 신생아 집중 치료 환경을 모방하여 임상 번역의 타당성을 향상시키는 데 유리합니다. 또한, 돼지 폐의 면역 체계는 인간의 면역 체계와 매우 유사하며(6,7,8,9), 톨 유사 수용체의 유전적 변이의 80% 이상을 공유합니다 410, 대식세포는 지 질다당류(LPS)11,12에 반응하고 산화질소 13 - 인간 폐 염증의 잠재적 기여자입니다14. 또한, 돼지 유래 폐 계면활성제는 미숙아의 급성 폐 질환에 사용되는 임상적으로 확립된 치료법입니다15.

이 프로토콜은 미국 흉부 학회 ALI 기준 16,17,18에 따라 일관되고 표준화되며 번역 가능한 결과를 가진 신생아 새끼 돼지에서 새로운 1일 대형 동물 다중 히트 급성 폐 손상(ALI) 모델의 생성을 제시합니다. 고압 환기 및 후속 LPS 또는 기타 독성 노출을 통한 계면활성제 고갈을 위한 반복적인 식염수 폐 세척이 폐 손상을 유도하기 위해 성인 돼지에서 사용되었습니다18. 그러나 신생아 새끼 돼지에서 사용할 수 있는 유사한 모델은19,20이 부족합니다. 이 프로토콜은 고산소 및 고압 환기 하에서 계면활성제 고갈 폐 세척 21,22,23의 적응된 프로토콜로 폐 손상을 유도한 후 폐에 직접 주입된 LPS를 사용하여 염증 유발 요인을 유도하는 방법을 설명합니다. 이 모델은 유도된 폐 손상 후 국소적(기관내 - IT) 또는 전신적(정맥 - IV) 선택한 치료를 투여하기 위해 준비되었으며 5시간 동안 그 효과를 모니터링합니다. 전체 프레임워크는 미숙아 폐의 상태를 밀접하게 모방합니다. 계면활성제 고갈은 출생 시 계면활성제 부족으로 특징지어지는 호흡곤란 증후군을 재현합니다. 이 질병은 기압상해, 무기력외상, 높은 수준의 산소와 기계적 환기가 필요한 산소화 문제와 관련될 수 있습니다. 마지막으로, 대부분의 미숙아는 융모막염이나 감염으로 인해 염증성 환경에서 태어나며, 이는 이 새끼 돼지 모델에서 LPS 투여로 복제하려고 시도한 특징입니다. ALI의 이 다중 히트 모델은 인간 미숙아 폐가 직면하는 유사한 임상 자극을 생성하여 초기 BPD 병원성 과정에 대한 귀중한 통찰력을 제공하고 효과적인 임상 번역을 위한 잠재적인 치료 전달 최적화를 제공합니다24.

프로토콜

모든 실험은 지역 동물 관리 위원회 및 동물 관리 및 수의학 서비스(프로토콜 OHRIe-3731)의 승인을 받은 후 국가 및 기관 규정(https://ccac.ca/en/guidelines-and-policies/)에 따라 인증된 직원이 수행합니다. 이 모델에는 생후 0-3일의 갓 태어난 새끼 돼지와 요크셔, 토래종, 듀록 혼합 품종이 사용되었습니다. 실험(1-3), 안정화 기간(5)을 포함한 수술 절차(4) 다중 히트 폐 손상을 유도하기 전(7), 손상 후 관찰 및 유지 환기(6, 8)가 안락사 및 실험 완료(10)로 끝나는 전체 실험 기간 동안 사용되는 준비, 마취, 수액 및 약물 관리 및 모니터링을 위한 단계(괄호 안에 식별된 단계 번호)에 대한 자세한 설명이 제공됩니다. 기관내 치료(9)를 위한 선택적 표준화된 절차도 제시됩니다. 농장에서 실험 종료 및 샘플 수집까지의 총 시간은 약 12-15시간입니다. 본 연구에 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 실험 준비

  1. 새끼 돼지가 도착하기 전에 모니터와 인공호흡기를 켜고 보정하십시오. 실험 중에 지속적인 데이터 기록을 위해 메모리 카드가 모니터에 삽입되어 있는지 확인하십시오.
  2. 인공호흡기를 최대 흡기압(PIP) 15cmH2O, 호기말 양압(PEEP) 6 cmH2O, 흡기 유량 8L/min, 호흡수(RR) 30/min, 흡기 시간(Tinsp) 0.4초, 흡기 산소 분율(FiO2) 1.0으로 설정하고 새 환기 회로와 가습기를 부착합니다.
  3. 멸균 수술용 팩, 드레이프, 소모품(약물 포함 - 재료 표 참조), 카테터 및 인쇄된 CRF를 준비합니다. 연구팀이 필요하다고 판단하는 경우 수술실 온도를 25°C 이상으로 높입니다. 보온 담요/워터 매트리스를 39°C로 켭니다. 추가 온도 조절이 필요한 경우 바로 사용할 수 있는 강제 공기 가온 시스템을 준비합니다.
  4. 생리 식염수 1L 봉지를 따뜻한 물조(39°C)에 넣어 폐 세척을 준비합니다.
  5. 약물 주입 펌프(케타민 및 프로포폴)를 설치하고 실온의 젖산 링거 및 포도당이 담긴 새 백을 유체 펌프에 추가합니다.
  6. 새끼 돼지는 지역 농장에서 암퇘지와 함께 머물며 연구팀원이 모돈에 데리러 올 때까지 자유롭게 접근할 수 있습니다. 성별, 나이, 새끼 크기 및 출생 시간을 기록하십시오.
    알림: 자격을 갖춘 운전자가 있는 승인된 대학 운송 차량에는 숙련된 팀원이 운송 내내 존재합니다. 새끼 돼지는 밀폐된 대형 소프트 캐리어에 넣어 새끼 돼지가 안전하고 자유롭게 움직이고 제한 없이 누울 수 있습니다(필요한 경우 담요로 싸인 뜨거운 물 고무 열 패드 사용). 이렇게 하면 새끼 돼지가 이 차분한 환경에서 침착함을 유지합니다(종종 잠들기도 함). 새끼 돼지를 담은 캐리어는 안전벨트를 사용하여 제자리에 고정됩니다. 팀원은 새끼 돼지의 스트레스 수준을 최소한으로 유지하기 위해 새끼 돼지를 부드럽게 달래고 시끄러운 소음을 피하는 역할을 합니다.
  7. 연구 기관에 도착하면 소음을 최소화하고 마취 노즈콘을 얼굴에 대고 새끼 돼지를 부드럽게 잡습니다.

2. 동물 준비

참고: 이 섹션에는 마취 유도 및 유지가 포함됩니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름).

  1. 노즈 콘을 제자리에 놓을 때 이소플루란 없이 O2 흐름을 시작합니다. 새끼 돼지가 진정되면 이소플루란을 시작하고 3% 이소플루란이 투여될 때까지(약 60초) 증량합니다. 호흡을 주의 깊게 모니터링하고 그에 따라 이소플루란을 조정하십시오.
  2. 발가락을 세게 꼬집 어 새 끼 돼지의 무반응을 확인합니다.
  3. 새끼 돼지가 반응하지 않으면 적절한 약물 투여량을 위해 체중을 측정하고 측정하십시오.
  4. 진통을 위해 뒷다리에 25G 바늘을 사용하여 근육내(IM) 경로를 통해 부프레노르핀 HCL(0.04mg/kg)을 주사합니다.
  5. 맥박 산소 측정기를 오른쪽 발굽 상단(관 전), 비침습적 혈압 커프(대퇴 동맥이 캐뉼라가 삽입될 때까지) 및 ECG 리드에 부착합니다.
  6. 양쪽 귀에 24G 혈관 캐스를 삽입합니다. 식염수 플러시 6인치 확장 세트를 4방향 마개로 부착합니다. 위치 방해를 피하기 위해 혀 압자로 귀를 지지하십시오.
  7. 제조업체의 지침에 따라 보정된 혈당계를 사용하여 혈당(BG) 측정을 위해 삽입된 귀 카테터에서 혈액을 채취합니다.
  8. 5mL/kg/h에서 D5W 주입을 정맥 주사(IV)로 시작하고 혈당 수치에 따라 4-5mmol/L의 BG 수치를 목표로 조정합니다.
  9. 두 번째 귀 정맥에 진통/마취의 일시 주사를 투여합니다.
    참고: 최적의 안전한 사용을 위해서는 이러한 약물의 특성과 부작용에 대한 비판적 이해가 필요합니다.
    1. 희석된 케타민(10mg/mL)의 2mg/kg IV의 볼루스와 프로포폴(10mg/mL, 1%)의 5mg/kg IV의 볼루스를 여러 개의 소량 볼루스로 투여합니다. 프로포폴 일시 투여 후 무호흡이 발생할 가능성에 주의하십시오. 새끼 돼지가 딱딱한 발가락 꼬집기 테스트에 반응하지 않고 지속적인 프로포폴 주입이 확립될 때까지 프로포폴 볼루스(총 5mg/kg)를 주의 깊게 계속 투여합니다.
    2. 이소플루란을 중단하고(IV 프로포폴 주입이 시작되면) 나머지 실험 기간 동안 지속적인 IV 마취를 계속합니다.
  10. 마취의 안정적인 수술 깊이에 도달하기 위한 금단 반사를 포함하여 심박수와 혈압에 따라 신중한 적정으로 다음 마취 요법의 지속적인 주입을 시작합니다.
    1. 프로포폴(10mg/mL) 10-30mg/kg/h(1-3mL/kg/h에 해당) IV.
    2. 케타민(100mg/mL) 5-10mg/kg/h(0.05-0.1mL/kg/h에 해당) IV.
      참고: 진통제/마취 주입 라인은 D5W 주입의 반대쪽 귀 카테터에 부착됩니다. 적절한 지지와 항상성을 보장하기 위해 총 수분 섭취량 및 주변 온도에 대한 조정이 필요할 수 있습니다.

3. 수액, 약물 및 모니터링

알림: 이 섹션에서는 수분 공급, 포도당 공급, 진통/마취를 유지하고 실험 데이터, 우려 사항 또는 문제에 대한 적절한 검토를 보장하는 방법에 대한 정보를 제공합니다.

  1. 항상성을 위한 총 결합 유체(LRS 및 D5W) IV 주입 속도가 일반적으로 5-8 mL/kg/h인지 확인하십시오.
    1. D5W를 5-10mL/h로 귀 정맥 카테터에 투여합니다(동맥 혈당(BG) 값에 따라 매시간 조정 - 목표 4-5mmol/L).
    2. 체액 항상성을 유지하기 위해 대퇴 정맥 카테터를 통해 1-6 mL/kg/h의 속도로 LRS를 투여합니다. 동맥 및 정맥 접근의 응고를 방지하려면 압력 헤파린화 NS 주입 백을 변환기에 부착하고 압력을 250-300psi 사이로 유지하십시오.
    3. 수술 내내 그리고 안정화 기간(5.1단계)을 시작하고 근육 이완을 유도하기 전에 적절한 전신 마취 깊이와 진통을 확인하십시오.
  2. 다양한 매개변수 모니터링(실험 전반에 걸쳐 한 사람의 정규직).
    참고: 활력 징후, 인공호흡기 설정, 개입, 채취한 샘플, 약물에 대한 모니터링 및 문서화, 용량 및 시간, 미리 만들어진 인쇄된 CFR( 보충 파일 1) 전체 실험 동안. 압력 모니터와 인공호흡기에서 기록된 연속 데이터는 나중에 분석할 수 있도록 실험이 끝날 때 저장됩니다.
    1. 산소 포화도(SpO2) 모니터링 - 전도(오른쪽 발굽 위쪽) 맥박 산소 측정기 신호를 확인합니다.
    2. 심박수(HR) 모니터링 - ECG 리드를 새끼 돼지에 연결합니다.
    3. 온도를 모니터링하려면 윤활유가 도포된 직장 체온계를 3-4cm 깊이로 삽입하고 테이프로 꼬리에 고정합니다. 가열 패드와 주변 실내 온도(25°C)를 조정하여 새끼 돼지의 직장 온도를 38-39°C로 유지합니다. 전기 열원을 사용하는 경우 화상을 방지하기 위해 새끼 돼지와 가열 매트 사이에 여분의 담요를 놓으십시오.
      알림: 온도 항상성이 적절하게 달성되지 않는 경우 강제 공기 가온 시스템(예: 새끼 돼지 위에 덮인 담요)과 같은 추가 온난화 소스를 사용하십시오.
    4. 혈압의 경우 수술 후까지 적절한 크기의 커프로 비침습적 모니터링을 수행한 후 평균 동맥압(MAP) 및 중심정맥압(CVP)을 포함한 침습적 혈압을 결정하고 CRF에 문서화합니다.
      알림: 정확한 판독을 위해 동맥 및 정맥 변환기 돔이 심장 높이에 배치되고 영점이 조정되었는지 확인하십시오.
    5. 중심 동맥 또는 정맥 카테터 를 통해 미리 지정된 시점에서 혈액 샘플링을 수행합니다. 휴대용 혈액 분석기(최소 pH, PCO2, PO2, HCO3, BE, BG, 젖산염, 크레아티닌, Na, K, Cl - CRF에 기록됨)를 사용하여 0.1mL 헤파린화 동맥혈의 혈액 가스 분석을 수행하여 실험 전반에 걸쳐 환기 및 대사 조절을 관리합니다.
    6. 향후 실험 및 분석을 위한 생물학적 샘플링 수행: 연구 목표에 따라 실험 프로토콜 중 관련 시점에서 진행 중인 전혈, 혈장 및 소변을 수집합니다. 또한 연구 목적과 관련하여 기관지폐포 세척액(BALF), 폐 조직 및 기타 조직16,17을 포함한 종점 표본을 수집합니다.
      1. 의원성 빈혈 및 저혈량증 제한:
        1. 주사기에 혈액을 천천히 채취하고(사강 부피의 3배에 해당) 따로 보관하고, 염증 및 산화 스트레스 마커와 같은 향후 실험 분석(0.4-1.5mL)25 을 위해 충분한 부피를 채취합니다. 새끼 돼지의 체중, 헤모글로빈 수치 및 안정성에 맞게 샘플 부피를 조정합니다.
          참고: 사진 혈액을 동물에게 다시 주고, 혈액 라인을 제거하기 위해 혈액 샘플링(향후 실험을 위한 혈액 가스 ± 혈액)을 위해 채취한 것과 동일한 양의 식염수로 라인을 세척하여 혈전으로 인한 폐색 가능성을 제한합니다.
    7. 15-30분마다 정기적으로 CRF에 모든 바이탈 및 환기 매개변수를 기록하며, 마취 유도 및 수술 중 또는 새끼 돼지가 불안정한 경우 더 자주 기록합니다.
    8. 시작 및 종료 시간과 용량 수정을 기록하여 실험 전반에 걸쳐 마취 시작부터 약물의 변화를 기록합니다.
    9. 초기에 규칙적인 빈도로 금단 반사에 대한 발가락/관상 동맥 밴드 핀치를 평가하여 마취 깊이를 평가합니다. 완전한 근육 이완이 달성되면 지속적인 마취 깊이 평가를 위해 심박수와 혈압을 모니터링합니다.
    10. 실험 전반에 걸쳐 달리 언급되지 않은 경우 다음을 목표로 합니다: HR: 120-180 bpm, MAP: 50-80 mmHg, CVP: 3-10 cmH2O, 체온: 38-39 °C, BG: 4-5 mmol/L, PaCO2: 35-45 mmHg, RR 조정(최대 60 호흡/분), 일회 호흡량(VT): 7 mL/kg, PIP 조정.

4. 수술 절차(시간: ~30-40분)

  1. 수술 중 환기를 유지하십시오.
    1. RR을 30회/분으로 유지하고, 호기 VT를 PIP로 조정한 10mL/kg, 일정한 PEEP 6cmH2 O, Tinsp 0.4초, FiO2를 1.0으로 목표로 합니다.
  2. 표준 스크러빙 기술을 사용하여 기관절개술을 위해 목과 대퇴골 혈관 접근을 위해 사타구니에 선호하는 무균 피부 스크럽을 수행하여 멸균 영역을 설정합니다.
    1. 목 절개를 수행합니다.
      1. 윤상연골과 흉골 노치 사이(약 10cm 크기) 사이를 메스로 목 피부 절개합니다. 무딘 해부를 사용하여 기관을 분리합니다.
      2. 기관 아래에 두 개의 12인치 탯줄 타이를 끼웁니다.
      3. 기관 고리와 윤상 연골 바로 아래의 기관의 가장 앞쪽 부분 사이에 5mm 절개를 합니다. 기관내관(ETT)을 삽입합니다. 절개 부위에 가장 가까운 기관 위에 첫 번째 매듭을 묶습니다.
      4. ETT 커프를 팽창시키고 커프가 넥타이에 의해 멈출 때까지 ETT를 부드럽게 집어넣습니다. 첫 번째 동점을 강화하고 ETT에 대한 두 번째 동점을 확보합니다. 이 방법은 끝이 용골 위에 있도록 하고 대칭 및 양측 호흡음의 청진으로 확인됩니다.
        참고: 두개골 우엽 기관지는 기관의 분기점 근위부에서 발생합니다. ETT가 너무 깊게 배치되면 이 기관지가 막히지 않도록 주의하십시오. 환기 문제나 갑작스러운 변화가 발생하면 튜브 조정을 고려해 보세요. 미주신경 몸통과 후두 신경은 목의 이 부위에 있습니다. 이러한 신경에 자극이나 손상을 입히지 않도록 주의해야 합니다.
    2. 사타구니 절개를 수행합니다.
      1. 대퇴 동맥을 촉진하고 메스(약 8-10cm)로 오른쪽 사타구니의 표면 피부 절개를 수행합니다.
      2. 둔기 해부를 사용하여 대퇴 동맥과 정맥을 분리합니다.
      3. 대퇴 동맥과 정맥 아래에 두 개의 봉합사(실크 3.0)를 실을 꿰어 분리합니다26. 삽입할 카테터를 준비합니다.
        1. 오른쪽 대퇴 정맥 카테터 삽입의 경우 양쪽 봉합사를 들어 올려 혈류를 막습니다. 제안된 삽입 부위의 원위 대퇴 정맥을 묶습니다.
          1. 카테터를 완전히 삽입하고 탐침을 약간 뒤로 당기고 원위 타이를 묶어 카테터를 제자리에 고정합니다. 탐침을 제거하고 식염수로 프라이밍된 3방향 마개가 있는 6인치 확장 세트를 부착합니다.
          2. 카테터를 고정하기 전에 개통성을 보장하기 위해 소량의 혈액을 다시 빼십시오. 근위 봉합사 타이를 사용하여 카테터를 혈관에 고정하여 카테터가 미끄러지는 것을 방지합니다.
          3. 유지 수액 전달 및 약물 주입을 위한 보조 포트를 부착합니다. 중심 정맥압을 위한 기본 포트를 부착합니다.
        2. 우측 대퇴 동맥 카테터 삽입의 경우 4.2.2.3.1.1 단계에서 4.2.2.3.1.3에 설명된 정맥과 대퇴 동맥에 동일한 단계를 사용합니다.
          1. 침습적 혈압 모니터링을 위해 3방향 마개쇠의 첫 번째 포트를 부착하고 수술용 스테이플로 사타구니와 목 절개를 잃습니다.
    3. 소변 접근을 위해 치골상 방광 카테터 삽입을 수행합니다.
      1. 방광은 하복부, 중간 시상선의 약간 왼쪽에 표면적으로 위치합니다. 무균 기술을 사용하여 복부를 청소하십시오.
      2. 복벽과 평행하고 두개골에서 가장 낮은 유두 쌍(배끼 아래 5-6cm)에 멸균 18G 혈관 카테터(6인치)를 배꼽을 향하게 삽입하고 한 손으로 방광의 양쪽에 약간의 압력을 가하여 안정화하고 약간 더 크게 만듭니다(치골상 흡인을 위한 선택적 프로토콜은 다른 곳에서 찾을 수 있습니다27).
      3. 소변 흐름이 확인되면 카테터를 복부에 테이프로 붙여 위치를 고정합니다. 대구경 확장 세트를 카테터에 부착합니다. 동물 아래에 놓인 50mL 튜브에 원위 끝을 놓습니다.

5. 안정화 및 표준화된 수술 후 폐 모집(시간: ~30-60분)

참고: 모든 수술 절차가 완료되면 안정화가 시작됩니다. 근육 이완 전에 충분한 진통/마취 깊이는 MAP 및 HR과 같은 바이탈이 정상 범위 내에 있고 금단 반사가 없는지 확인하기 때문에 필수적입니다. MAP 및 HR은 적절한 마취 깊이를 보장하기 위해 프로토콜 전반에 걸쳐 지속적으로 모니터링됩니다.

  1. 로쿠로늄(0.3mg/kg) 볼루스 IV(귀 정맥 D5W 접근을 통해 )를 투여하고 폐 동원 조작 전에 근육 이완을 위해 로쿠로늄(5.5mg/kg/h)의 지속적인 주입을 시작합니다. 이 주입은 세척 절차를 표준화하고 인공호흡기와의 비동기성을 방지하기 위해 실험 기간 동안 계속됩니다.
  2. 표준화된 폐 동원 조작을 수행합니다.
    1. PEEP의 단계적 증가: PEEP 6 cmH2O에서 시작하여 PEEP 10 cmH2O에 도달할 때까지 매분 1 cmH2O씩 증가합니다. VT 10 mL/kg을 유지하도록 PIP를 조정합니다.
    2. VT 10 mL/kg을 유지하면서 반대 방식(단계 5.2.1에서와 같이)으로 PEEP 6 cmH2O로 돌아가기 전에 PEEP 10 cmH2O에서 2분 동안 유지합니다.
    3. PEEP 6cmH2O에서 VT 10 mL/kg에서 안정되면 호흡 설정, 생리학적 매개변수를 기록하고 동맥혈 가스를 채취합니다(CRF에서 시점 VT 10 mL/kg ).
      1. PaO2 가 >400mmHg(건강한 폐를 가진 동물의 고산소증에 대한 예상 반응)인지 확인하십시오. FiO2 1.0은 포함 기준으로 고산소증에 대한 적절한 반응을 보장하기 위해 실험의 초기 단계에서 사용됩니다.
      2. 이 값에 도달하지 못한 경우:
        1. 기관내관의 위치, 인공호흡기 설정, 산소 전달 및 적절한 혈액 샘플링 기술을 확인하십시오. 적절한 모집을 보장하기 위해 폐 동원 조작을 한 번 반복합니다.
        2. 그래도 개선되지 않으면 폐의 잠재적인 본질적인 문제(이전의 비실험적 노출로 인한 건강에 해로운 폐 - 즉, 농장에서)로 인해 동물을 제외하고 즉시 안락사시킵니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따라).
      3. PaCO2 를 35-45mmHg 사이로 유지하도록 RR을 조정합니다.
      4. FiO2 1.0 및 PEEP 6 cmH2O를 유지하면서 VT 7 mL/kg에 도달하도록 PIP를 낮춥니다.
      5. 안정화 후 동맥 및 정맥혈 가스를 포함한 생리학적 매개변수 및 샘플과 함께 CRF 시트에 VT 7mL/kg에 대한 시점 기준선 판독값을 기록합니다. 안정화에는 3.2.10단계와 같은 활력 징후 및 PaO2: 400-500 mmHg, PaCO2: 35-45 mmHg, pH: 7.35-7.45, BG: 4-5 mmol/L의 혈액 가스 값이 포함됩니다.

6. 대조 동물을 위한 환기

  1. 일회 호흡량 7mL/kg, PEEP 6cmH2O, FiO2 1.0으로 용적 조절 환기를사용합니다. 대조군 동물에서 폐 손상을 유도하지 마십시오(즉, 계면활성제 고갈 또는 내독소 주입을 수행하지 마십시오).
  2. 실험 동물에서 폐 손상을 유도하는 데 필요한 평균 시간과 일치하도록 약 90분 동안 환기를 계속합니다(7단계 및 그림 1 참조). 이 기간이 지나면 10단계로 바로 진행합니다.

7. 급성폐손상 유도(다중히트모델)

  1. 계면활성제 고갈 수행(시간: 1-2시간)
    1. 폐 세척을 시작하기 전에 흡입 장치를 켜고 사용할 준비가 되었는지 확인하십시오. 세척 수집 양동이를 제자리에 놓습니다. 동물의 머리 아래와 수술대 아래에 흡수 패드를 배치하여 세척 중에 누출되고 회수된 모든 체액을 포착합니다.
      1. 세척 전후에 패드의 무게를 측정하십시오. 인공호흡기를 PEEP 5 cmH2O, PIP 25 cmH2O, RR 25/min 및 FiO2 1.0으로 설정합니다. 세척 절차 전반에 걸쳐 이러한 압력 제어 환기 설정을 유지하십시오. 전체 세척 동안 VT가 약 35%-45% 감소할 것으로 예상합니다.
    2. ETT에서 환기 회로를 분리하고 세척 깔때기 장치를 부착합니다( 보충 파일 1 참조).
    3. 새끼 돼지 위 약 30cm 위에 있는 깔때기에 NS를 부드럽게 부어 따뜻한 등장 식염수(NS) 30mL/kg을 폐에 주입합니다.
    4. 기계적 "압착"을 제공하기 위해 측면을 양측으로 눌러 흉곽을 마사지합니다. 식염수를 폐로 옮기고 세척 장치 내에서 순환시키는 데 도움이 됩니다. 마사지 사이에 2-3초를 허용하십시오.
      알림: 부적절한 계면활성제 제거 또는 정맥 환류 장애를 방지하기 위해 너무 빠르거나 너무 느리게 마사지를 피하십시오. 세척 라운드당 30초를 초과하지 마십시오.
      1. 새끼 돼지 아래로 깔때기를 내려 세척액을 제거합니다. ETT에서 깔때기를 약간 분리하여 유체가 바닥의 수집 양동이로 배출되도록 합니다.
      2. 10초 이상 능동 흡입을 수행하지 마십시오. 체액 배액을 촉진하기 위해 흉곽 마사지를 계속하면서 흡입 카테터를 ETT에 삽입합니다. MAP 및 HR을 모니터링하고 매개변수 중 하나가 크게 떨어지면 조기에 환기를 다시 연결하십시오.
      3. 환기 회로를 다시 연결하십시오. ETT에 과도한 체액이 남아 있으면 두 번째 흡입을 수행하십시오.
    5. 스트레스와 과민증의 위험을 줄이기 위해 세척 라운드 사이에 최소 3분 동안 새끼 돼지가 회복되도록 하십시오.
    6. SpO2가 100%로 돌아오면 다음 세척 라운드를 시작합니다. SpO2가 100%로 돌아오지 않으면 SpO2가 안정화되면 혈액 가스를 통해 PaO2를 확인하십시오
      1. PaO2 >100mmHg)인 경우 - 폐 세척을 반복합니다(7.1.2-7.1.6단계).
      2. PaO2 <100mmHg인 경우 세척 환기 설정을 유지하면서 15분 동안 기다린 다음 혈액 가스 분석을 반복합니다.
      3. PaO2 >100mmHg인 경우 - 세척을 계속하고 7.1.6단계로 진행하여 손상 정도를 재평가합니다.
    7. PaO2 가 15분 동안 <100mmHg를 유지할 때 계면활성제 고갈 손상이 발생하는지 확인합니다. 세척을 중지하고 다음 단계로 진행합니다.
  2. 기관내 내독소 주입(시간: 15분)
    1. 대장균(1.5mg/kg)에서 3mL 주사기에 총 부피 2mL로 희석하여 대 장균 (1.5mg/kg)에서 지질다당류(LPS)를 준비합니다.
      참고: 효과의 잠재적인 변형 의존적 변화를 인정하여 적절하게 변형률과 용량을 선택하십시오.
    2. 최종 폐 세척 후 15분 동안 기다린 다음 새끼 돼지를 바로 누운 자세로 기관내(IT)로 LPS를 주입합니다.
    3. 다음 단계를 사용하여 무기폐에서 균질한 LPS 분포를 개선합니다.
      1. 표준 ETT 끝을 Y-포트 어댑터로 교체하여 밸브가 있는 측면 포트를 통해 카테터 를 통해 동시에 환기 및 LPS 투여를 허용합니다.
      2. 10cmH2O의 PEEP를 1분 동안 도포합니다. VT를 7mL/kg으로 유지하도록 PIP를 조정하고 RR을 분당 40회로 설정합니다.
      3. 측면 포트를 통해 ETT에 카테터를 미리 측정된 깊이까지 삽입하여 팁이 ETT를 넘어 1-2mm 확장되도록 합니다.
      4. 카테터를 통해 LPS를 주입합니다. 카테터를 1mL NS로 세척한 다음 9mL 공기 볼루스로 세척하여 완전한 전달을 보장합니다.
      5. 카테터를 제거하고 측면 포트를 닫습니다.
      6. LPS 투여 후 3분 동안 PEEP 10cmH2O(VT 7mL/kg을 유지하도록 PIP 조정)로 환기를 계속합니다.
      7. 의도하지 않은 폐 조직 동원을 되돌리기 위해 ETT에서 인공호흡기 회로를 30초 동안 분리합니다.
      8. 연결이 끊기는 동안 인공호흡기 설정을 FiO2 0.5, PEEP 6 cmH2O, PIP로 조정하여 VT 7 mL/kg을 유지하고 RR을 40-60 호흡/분으로 증가시켜 35-45 mmHg의 PaCO2 를 달성합니다.
      9. VT가 7mL/kg으로 안정화되면 시점 0시간 생리학적 측정값을 기록하고 CRF 시트를 작성합니다. 혈액 가스 분석의 PaCO2 를 기반으로 RR을 조정합니다.

8. 관찰 기간 동안 환기(시간: ~6시간)

  1. 0.5에서 FiO2 및 6 cmH2O에서 PEEP를 사용하여 용적 조절 환기로 전환합니다. VT를 7mL/kg으로 유지하기 위해 필요에 따라 PIP를 조정합니다(최대 PIP를 설정하지 않음). 정상적인 PaCO2를 유지하기 위해 RR을 최대 60회/분까지 조정합니다.
  2. 시간별 혈액 가스 측정을 사용하여 나머지 실험 동안 RR 조정을 안내합니다. VT를 7mL/kg으로 유지하도록 PIP를 지속적으로 조정합니다.
  3. 전체 6시간 관찰 기간 동안 대조군 동물과 다중 히트 동물 모두에 이러한 환기 매개변수를 균일하게 적용합니다( 그림 1 참조).

9. 치료 절차 - 선택 사항(시간: ~10-20분)

  1. 잠재적인 개입 연구의 경우 기관내(IT), 정맥(IV), 피하, 근육내 또는 비강내와 같은 임상적으로 관련된 경로를 통해 치료제를 전달합니다. 실험 설계에 따라 치료 시기를 선택합니다. 치료를 시행하지 않으면 10단계로 건너뜁니다. IT 관리의 예는 다음과 같습니다.
    1. 새끼 돼지를 오른쪽 측면 누운 자세로 배치합니다.
    2. PEEP를 6cmH로유지합니다 2 O. 7mL/kg의 VT를 달성하도록 PIP를 조정합니다.
    3. 카테터를 밸브가 있는 측면 포트에 미리 정해진 길이로 삽입합니다(7.2.3.3단계에 설명된 대로). 개입의 의도된 용량 또는 양의 절반을 주입합니다. 1mL NS와 9mL의 공기를 일시로 사용합니다. 볼루스 주사 후 환기 폐색의 위험을 최소화하기 위해 총 부피를 2.5mL/kg으로 제한하십시오.
    4. 환기 누출을 방지하기 위해 밸브가 있는 측면 포트를 캡으로 밀봉하십시오.
    5. 새끼 돼지를 왼쪽 측면 누운 자세로 재배치하고 9.1.3-9.1.4단계를 반복합니다.
    6. 새끼 돼지를 바로 누운 자세로 되돌립니다. VT를 7mL/kg으로 유지하도록 PIP를 조정합니다.
    7. 8단계에서 설명한 대로 환기를 계속하십시오.

10. 안락사 및 실험 완료

  1. 관찰 기간 동안 환기 6시간 후 최종 생리학적 기록 및 샘플 수집을 수행합니다(8단계).
  2. 120mg/kg 펜토바르비탈 나트륨 IV(240mg/mL)를 볼루스로 투여하여 동물을 안락사시킵니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름).
  3. 활력 징후(심장 박동, 혈압 및 호흡)가 없는 동물의 죽음을 보장합니다. 사망 확인을 위해 청진기로 심박수와 호흡음이 없는지 청진합니다. 사망은 심장과 폐의 말단 조직 수집으로 추가로 확인됩니다.
  4. 향후 실험을 위해 추가 생화학적, 분자 및/또는 조직학적 분석을 위해 조직 샘플과 체액을 수집합니다 14,17.
  5. 모니터링 장비와 인공호흡기에 모든 데이터를 저장하고, 백업 복사본이 로컬 드라이브와 공유 드라이브에 업로드되었는지 확인하고, 모든 장비를 끕니다.
  6. 모든 날카로운 물건/생물학적 위험 물질은 현지 정책의 지시에 따라 폐기하십시오.
  7. 선호하는 방부제로 모든 표면을 청소하십시오.
  8. 모든 기구를 세척하고 밤새 건조시키십시오.

결과

이 모델의 종점은 생리학적, 조직학적, 염증성 및 폐포-모세혈관 장벽 변경을 포함하는 ALI에 대한 미국 흉부 학회 기준(최소 4개 중 3개)과 일치합니다16,17. 연구에 따라 이 모델을 구현하려는 각 연구 그룹의 재량에 따라 추가 종점이 포함될 수 있습니다. 중등도 폐 손상은 200mmHg< 100mmHg 중증 < 흡기 산소 분율에 대한 동맥혈 내 산소의 부분 분율의 비율로 정의됩니다17. 산소 지수(OI)는 다음 공식을 사용하여 계산됩니다: OI = (평균 기도압(mAWP) * %O2)/PaO2, 8-16 사이의 값은 중등도 손상으로 분류됩니다28. 대조군 동물과 비교하여 다중 히트 동물은 산소화 지수 장애, P/F 비율 및 호흡계 순응도 감소로 인해 중증에서 중등도의 폐 손상을 보였습니다(그림 2). 5-양식 조직학적 폐 손상 점수16,17(그림 3)을 사용하여 조직학적 손상의 명확한 징후가 나타났으며, 폐포 및 간질 공간에 호중구 유입, 공공간을 채우는 단백질 파편 및 폐포 중격 비후가 있었습니다. BALF의 호중구 유입은 폐 조직에서 증가된 IL-6 사이토카인과 함께 염증 과정의 징후를 제공합니다(그림 4).

figure-results-1
그림 1: 신생아 새끼 돼지의 급성 폐 손상 순서도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 중등도에서 중증의 ALI는 이 프로토콜에 제시된 다중 히트 손상을 따라 관찰됩니다. (A,B) 증가된 산소화 지수(8-12 사이) 및 낮은 PaO2/FiO2 (P/F) 비율은 중등도 내지 중증의 폐 손상과 일치하여 대조군(파란색 선)과 비교하여 본원에 제시된 다중 히트 모델(빨간색 선)에서 얻어집니다. (C) 다중 히트 동물에서 폐 기능이 손상되었으며, 여기서는 호흡계 순응도가 >50% 감소하는 것으로 표시됩니다. 동물 수(N): 대조군(N = 5) 및 다중 히트(LPS 균주 O55:B5, 1.5 mg/kg)(N = 3). 사용된 모든 값은 ± SD를 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 다중 히트 ALI 모델은 이질적인 조직학적 손상을 나타냅니다. (A,B) 다중 히트 폐의 후방 중앙 측면에 우선적으로 영향을 미치는 고르지 못한 폐 손상의 거시적 증거가 관찰됩니다. (C,D) 헤마톡실린 및 에오신(H&E)이 폐 절편을 염색하고 다중 히트 폐에서 폐포 및 중격 비후를 보여주는 폐포 및 간질 공간의 호중구 유입을 보여주는 대표 이미지(100x). (E,F) H&E 염색 폐 절편의 대표 이미지(400x)는 구조적 무결성 손상, 호중구 침윤 및 다중 히트 폐의 폐포 공간에 파편 침착을 강조합니다. 파란색 사각형은 (E,F)에서 확대된 영역을 나타냅니다. 검은색 눈금 막대는 100mm(C,D) 및 50mm(E,F)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: 다중 히트 모델은 ALI 후 염증 반응을 보여줍니다. (A) 대조군 동물과 비교하여 유도된 폐 손상(다중 히트) 후 6시간 후에 기관지폐포 세척액(BALF)에서 총 세포 비율의 75% 이상에 도달하는 호중구 유입. (B) 전염증성 사이토카인 IL-6은 ALI 유도 후 6시간 후에 기관지폐포 세척액(BALF) 및 (C) 폐 조직에서 상승합니다. 동물의 수(N)는 분석 시점에서 사용 가능한 재료에 따라 다릅니다. BALF(B)의 경우 효소 결합 면역흡착 분석법을 사용하였고, 폐 조직(C)의 경우 다중 레이저 비드 기술을 수행했습니다. 모든 값은 평균 ± SD로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 신생아 새끼 돼지 급성 폐 손상 모델에 대한 사례 모니터링 양식. 이 fle를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

신생아 새끼 돼지 ALI 모델은 계면활성제 제거를 위한 폐 세척(무기폐 외상으로 이어지는 호흡 곤란 증후군 모방), 고산소 노출(활성 산소종으로 이어짐), 기계적 환기(기압/볼루 외상) 및 미숙아의 BPD 병인에 관여하는 것으로 생각되는 다양한 구성 요소를 반영하는 염증 자극으로서의 LPS의 IT 관리를 특징으로 하는 다중 히트 모델로 구성됩니다2. 계면활성제 고갈 과정에서 의도적으로 압력과 산소가 증가하여 부상에 기여합니다. FiO2 1.0으로 고산소증에 대한 노출은 약 3시간이며, 유도된 폐 손상 단계(계면활성제 고갈 세척 및 내독소 설치) 동안 약 90분 동안 고압이 추가됩니다. 극미숙아의 소생술 중 높은 흡기 산소 수준(높은 FiO2 0.9 대 낮은 FiO2 0.3)은 고산소증 노출이 1시간 미만인 더 높은 산화 스트레스와 염증을 초래했습니다29. 새끼 돼지 모델에서 계면활성제가 고갈되면 폐가 허탈/무기폐를 초래하고 적절한 환기 및 산소 공급을 위해 폐포 개통을 유지하는 능력이 감소합니다. 따라서 관찰 기간 동안 설정이 감소하더라도 계면활성제를 제거하면 7mL/kg의 일회 호흡량을 달성하기 위해 더 높은 압력이 필요합니다. 폐는 시간이 지남에 따라 계면활성제를 생성할 수 있으며 진행 중인 유해 과정의 정도는 시간이 지남에 따라 줄어들 수 있습니다. 그러나 ALI의 이 새로운 신생아 새끼 돼지 모델은 유도된 폐 손상 후 6시간 동안 관찰 기간 동안 폐 기능(순응도) 및 산소화(PF 비율)의 회복(그림 2)이 거의 없음을 보여줍니다. 이 모델은 극미숙아가 직면하는 가장 일반적인 초기 출생 후 상황과 매우 유사하므로 번역 노력과 매우 관련이 있습니다. 이 모델은 P/F 비율28로 정의되는 중등도(100-200mmHg)에서 중증(<100mmHg) 급성 폐 손상을 생성합니다. 염증에 대한 LPS 효과는 손상 후 1-2시간에 최고조에 달합니다30. 이 모델은 연구 프로그램에 맞게 사용되는 관찰 또는 치료 기간을 변경하여 다른 그룹이 조작할 수 있는 발판으로 사용할 수 있습니다.

프로토콜의 중요한 단계

접근성에 대한 우선순위에도 불구하고 이 대형 동물 모델은 여전히 복잡하므로 이 실험을 완료하기 위해 고도로 숙련된 팀이 협력해야 합니다. 프로토콜에는 각별한 주의가 필요한 중요한 단계가 있습니다. 이러한 고려 사항은 이 복잡한 실험 프레임워크의 성공을 보장하는 데 중요합니다.

동물의 운송

어미와의 조기 분리는 동물에게 극도로 스트레스가 많은 시기가 될 것으로 예상되며, 이는 잠재적으로 심혈관 안정성을 유지할 수 없고 운송 중 사망할 수 있습니다. 그러나, 본원에 제시된 수송 프로토콜(단계 3 참조)은 매우 차분한 동물(일부는 심지어 잠들기까지)을 허용하여 완전한 실험을 허용했다. 최대 운송 길이에 대한 명확한 권장 사항을 제시하기는 어렵지만 새끼 돼지는 우리의 경험상 약 60분의 운송을 편안하게 견딜 수 있었습니다.

환기 최적화

인공호흡기는 전체 일회 호흡량이 폐로 전달되도록 회로 순응도를 보상하도록 설정해야 합니다. 이것은 일회 호흡량이 회로로 손실되면 새끼 돼지가 혈역학적으로 불안정해질 수 있기 때문에 계면활성제가 고갈되는 동안 특히 중요합니다. 연구자들은 사용 가능한 인공호흡기가 신생아에게 적절한 일회 호흡량 전달을 허용하는지 확인해야 합니다. 성인용 인공호흡기는 적절한 신생아 일회 호흡량을 달성하지 못하는 경우가 많습니다. PIP는 호기 일회 호흡량 값을 유지하는 데 사용됩니다(폐 세척 중 제외, 다른 사람들 14,19,20,21,31,32에 의해 이전에 설명된 바와 같이 이 프로토콜에서 사용되는 7mL/kg - 다음 섹션 참조). LPS 투여 중 또는 IT 치료를 위해 밸브가 있는 측면 포트가 있는 기관내관 어댑터를 표준화하여 사용하면 환기 회로에서 분리되는 것을 방지하여 기도압을 유지할 수 있습니다.

수술 후 표준화된 폐 동원 전략

무기폐는 준비 및 수술 단계에서 새끼 돼지 폐에서 발생할 수 있습니다. 적절한 폐 통기를 보장하기 위해 근육 이완 후 "폐 동원" 조작이 제공되었습니다.33 . 동원 기동 후, 건강한 개방 폐에서 정상적인 고산소 반응을 감안할 때 동맥혈의 산소 분압은 400mmHg 이상일 것으로 예상됩니다. 이에 도달하지 못한 경우, 연구자는 최적화되지 않은 실험 조건으로 인해 폐가 적절하게 모집되지 않았는지 또는 새끼 돼지가 기존 상태를 가지고 있는지 여부를 고려해야 합니다(예: 새끼 돼지가 알려지지 않은 노출이 발생할 수 있는 농장에서 얻은 경우). 이 프로토콜은 이 목표를 달성할 수 있는지 확인하기 위해 모집 기동을 한 번 다시 시작하여 전자의 설명을 테스트할 수 있도록 합니다. PaO2의 400mmHg에 두 번째로 도달하지 못하는 경우, 실험 결과에 부적절하게 영향을 미칠 수 있는 기존 조건으로 동물을 제외하는 것을 고려하십시오.

충분한 체액과 대사 항상성이 가장 중요합니다

이것은 열악한 수분 공급 및 신진대사 조절과 관련된 중요한 교란 효과를 제한할 것입니다. 일반적으로 큰 새끼 사이에서 태어나는 이 신생아 만삭 새끼 돼지는 모두 수유 기회를 비슷하게 갖는 것은 아닙니다. 따라서 실험에 사용하기 전에 일정 수준의 출생 후 탈수에 노출될 수 있습니다. 5-8mL/kg/h의 총 수분 섭취량을 제공하는 것은 양호한 혈관 내 용적을 유지하기에 충분합니다14,34. 대사 조절을 보장하는 것은 혈당 수치를 4-5mmol/L(신생 새끼 돼지의 정상 생리적 범위35,36) 사이로 유지하면서 발생합니다. 높은 혈중 젖산은 열악한 산소 전달을 반영하는 데 사용되는 또 다른 기준이며 저산소증 이전의 낮은 혈관 내 액 상태를 반영할 수 있습니다. 충분한 수분 요법과 수분을 충분히 공급한 동물은 심혈관 안정성으로 계면활성제 고갈 세척을 견디며 심각한 산증을 일으키지 않습니다. 헤모글로빈 및 기타 생화학 매개변수의 기준값은 연령과 종에 따라 다릅니다37,38. 낮은 헤모글로빈은 산소 공급에 영향을 미칠 수 있으며, 이를 위해서는 최적화되고 보수적인 혈액 샘플링이 필요합니다39,40. 각 채혈은 동일한 양의 NS로 보상됩니다. 혈중 전해질, 요소 및 크레아티닌 수치를 사용하여 충분한 수액 요법을 따랐습니다.

폐 세척 절차 중 충분한 회복 시간 허용

폐 세척 동안, 위험한 간 울혈41, 간 출혈 및 우심부전을 피하기 위해 적절한 정맥 환류를 허용하기 위해 각 세척 사이에 최소 3-5분의 중요한 회복 기간이 필요합니다. 이 현상은 실험 코호트 내의 몇몇 동물에서 관찰되었습니다. 적절하고 적극적인 수액 관리는 임상적 안정성을 유지하는 데 필수적입니다. 이 새끼 돼지 모델을 위한 소규모 집중 치료 환경을 재창조함으로써 중요한 상황 및 관련 비상 계획을 인식하기 위해 팀 구성원 간의 지식 번역을 촉진할 수 있는 임상의, 신생아 전문의 또는 수석 수의사 기술자를 보유하는 것이 필수적입니다.

권장 문제 해결

새끼 돼지는 전체 수술 및 실험 시간 동안 전신 마취 및 진통 하에 있을 것입니다. 한 사람이 전체 실험 동안 새끼 돼지를 모니터링하는 데 전념합니다. 동물마다 마취제에 대한 민감도와 반응이 다릅니다. 바이탈과 매시간 혈액 가스로 마취를 유도한 직후 동물의 상태를 모니터링하는 것이 중요합니다. 필요에 따라 신체 평가 외에도 마취 수준 및 대사 안정성에 대한 정보를 제공합니다. 계면활성제 고갈에 도달하는 데 필요한 폐 세척 횟수(6회에서 20회)와 시간(28-115분)에는 가변성이 있습니다.

마취 유도, 안정화 및 수술 중 발생할 수 있는 문제 및 해결책: (1) 무호흡이 발생하면 마취 가스를 차단하고 자발 호흡이 돌아올 때까지 백 마스크 환기로 호흡을 지원해야 합니다. (2) 높은 HR, 낮은 MAP 또는 낮은 CVP 를 통한 저혈량증의 징후가 있는 경우 10mL/kg의 NS의 수액 덩어리를 투여해야 하며 유지 수액 비율 증가를 고려해야 합니다. (3) MAP가 30-40mmHg로 감소하는 저혈압이 수액 볼루스로 해결되지 않는 경우 마취 펌프를 줄이거나 중지해야 하며 10-15분 후에 관류 및 저혈압의 징후를 재평가해야 합니다. 내부 출혈 가능성을 평가하기 위한 헤모글로빈 수치에 대한 혈액 가스 분석. (4) 호흡기 증상이 기흉(급성 불포화 또는 서맥>20%)을 나타내는 경우 새끼 돼지를 즉시 안락사시킵니다.

제한

본원의 모델은 대형 동물 모델에서 단기(6시간) 신생아 ALI를 나타낸다. BPD로 이어지는 부상의 만성화는 고려해야 할 중요한 요소입니다. 이 모델은 병인의 이러한 측면을 완전히 포착하지 못할 수 있으며 6시간 이후의 폐 손상 진행을 알려주는 데이터는 아직 결정되지 않았습니다. 그럼에도 불구하고 이 모델의 일관성은 이를 구현할 연구 그룹에 다양성을 허용하여(길이 확장/프로토콜 수정) 구축할 수 있는 강력한 기반이 됩니다. 구상 과정에서 이 대형 동물 모델의 접근성과 타당성에 중점을 두었음에도 불구하고 실험의 원활한 실행을 위해서는 특정 기술이 필요합니다. 초기 단계의 구현 및 성공적인 완료를 위해서는 생리학에 대한 강력한 기반과 약물/주입/등을 통한 급격한 변화/악화를 관리할 수 있는 지식이 필요합니다. 그런 다음 이 기술 세트를 팀 구성원에게 전송하여 시간이 지남에 따라 모델을 지속적으로 유지 관리할 수 있습니다. 또한 강력한 의사소통과 협력이 구축된 수의학 기술자, 실험실 기술자 및 선임 대학원생으로 구성된 팀은 각 실험의 모든 구성 요소를 적절하게 커버할 수 있습니다. 워크플로가 최적화되면 실험을 처음부터 끝까지 수행하려면 최소 3명의 팀원이 필요할 것으로 예상됩니다.

의의와 잠재적 적용

임상 번역은 전임상 수준의 강력한 기초 연구에 의존합니다. 그러나 전임상 모델과 인간 생리학 간의 불일치로 인해 많은 임상 시험이 실패하고 있으며, 이는 번역 잠재력을 강화하기 위해 밀접하게 관련된 대형 동물 모델의 중요성을 강조합니다. 폐 손상의 새로운 신생아 새끼 돼지 모델의 생성은 초기 병원성 사건을 더 잘 이해하고 인간 조산 폐에서 BPD 발병에 도움이 되는 환경을 조성하는 데 중요합니다. 여기에 제시된 모델은 생후 첫 며칠 동안 미숙아를 위한 집중 치료 환경(고산소증, 고압 환기 및 계면활성제 부족)의 중요한 측면을 밀접하게 모델링하여 재현합니다. 이 다재다능한 새로운 신생아 새끼 돼지 다중 히트 모델은 초기 BPD 병원성 과정에 대한 귀중한 통찰력을 제공하고, 치료 후보에 대한 지식을 발전시키며, 효과적인 임상 번역을 위한 치료 전달 최적화를 제공할 것입니다. 이는 협업을 위한 훌륭한 벡터 역할을 하여 안전성부터 효능, 지식 생성에 이르기까지 다양한 개념 증명 연구를 위한 가설 테스트 프레임워크를 육성할 것입니다. 향후 시험의 기초가 되는 이 모델은 미숙아에서 볼 수 있는 급성 폐 손상에 대한 임상 번역 노력을 크게 발전시킬 것입니다.

공개 사항

다른 모든 저자는 선언할 경쟁 이해관계가 없습니다.

감사의 글

이 프로젝트 전반에 걸쳐 사용된 신생아 인공호흡기를 아낌없이 빌려준 토론토 SickKids 병원의 Martin Post 박사에게 감사드립니다. 또한 이 모델을 개발하는 동안 모든 도움을 준 오타와 대학교 심장 연구소의 동물 관리 및 수의학 서비스의 Dan DeVette와 그의 팀에게도 감사드립니다. 이 작업은 CHEO의 CHAMO 혁신 기금, 줄기 세포 네트워크, 로비사 공주 협회[HKH Kronprinsessan Lovisas förening], David and Astrid Hagelén Foundation, Swedish Heart Lung Foundation의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
#10 메스 칼날피부 절개
1ml 주사기벡턴딕슨BD309659슬립 팁 
10ml 주사기벡턴딕슨BD302995동맥 및 정맥 관에 플러시 주사기
18 G 혈관카테터  인사이트방광 캐널레이션
20ml 주사기벡턴딕슨BD302830필요하다면 수액 볼루스를 투여해야 합니다
22G 주사바늘벡턴딕슨리필 주사기
24 G 혈관카테터인사이트160465귀 IV 접근과 대퇴동맥 및 정맥
25G 주사기벡턴딕슨근육 주사(IM) 부페노르핀
3ml 주사기벡턴딕슨약물 주입 및 모니터링 라인 데드스페이스 제거
3-0 실크 넥타이에티콘A304H동맥 및 정맥 카테터를 고정하는 데 사용됩니다
4방향 스톱콕디스코픽스, 브라운D500456020플러싱 및 샘플링을 위한 유체 및 모니터링 라인에 연결되어 있습니다
6인치 익스텐션 세트SAI 주입 기술확장 6정맥주사/동맥 라인에 부착됨;
60인치 익스텐션 세트BBV6223약물 주입 라인
AirLife Neo-Verso Y 기관관 삽입용 기도 접근 어댑터비아이레CSC300기관내 투여에 사용됨
부페노르핀, 0.3 mg/mLCDMV128140근육 볼루스(근육 볼루스)를 진통제로 사용해
포도당, 5%백스터JB0063혈당 유지
일회용 커튼3M3M1050멸균 야외 커튼
심전도 전극3M220790심전도용 일회용 전극
기관내관(ETT) 투여 카테터
기관내관 3.5 텔레플렉스5-10107기관절개술에 사용됨
에피네프린, 1 mg/mL호스피라07541L01필요 시 소생을 위해 멸균 생리식염수로 0.1 mg/mL로 희석하여 소생 시를 마련합니다
에포크 혈액 가스 분석기 및 nbsp;지멘스10736398NXS 호스트가 있는 EPOC 혈액 분석 시스템
에POC 샘플 카드지멘스BD309659혈액 가스 카트리지
포르말린, 10% 완충피셔 사이언티브SF100-4폐 고정
온열 패드켄트 사이언티픽TPZ-814EA물 순환 담요
정맥(IV) 주입 펌프 3회시그마 올드리치Z401358케타민/프로포폴과 로쿠로늄 주입
케타민, 10 mg/mL베토퀴놀112170마취 유지 시 주사기 펌프에서 무균 생리식염수로 희석한 연속 주입 및 참고;
케타민, 100 mg/mL베토퀴놀112170전신 마취 유도 시 볼루스로, 마취 유지를 위한 주사기 펌프로 사용하며,
락테이트 링거백스터JB2323혈액량 유지
세척 장비: 깔때기, 3방향 커넥터, ETT 커넥터, 4피트 튜브해당 없음해당 없음세척용 수제 튜브
지폴리다당, LPS (O55:B5), 100mg시그마-올드리치L2880-100mg2차 타격 폐 손상
MR850 호흡기 가습기피셔와 페이켈MR850JXX*
펜토바르비탈 나트륨(유탄일), 240 mg/mL베토퀴놀381인도적 안락사를 위한 정맥 주사
압력 변환기맥카시 수의생용품V6402서지베에서 동맥/정맥 압력을 측정하는 데
프로포폴, 10 mg/mL전신 마취 유도 시 볼루스로, 마취 유지를 위한 주사기 펌프로 사용하며,
맥박 산소 측정기마이스모NEOPT-500
로쿠로늄, 10 mg/mL아우로파마2498820수술 후와 폐 손상 유도 시작 전에 사용하며, 이어서 연속 주입
식염수, 0.9%백스터JB1324혈관 세척 및 혈액량 소생술
멸균수해당 없음해당 없음환기기 가습기를 위해
흡인기 카테터 10 CH/25 cm메디플라스트608810251폐엽의 기관지 폐조 세척에 사용됩니다
흡인 카테터 6 CH/40 cm메디플라스트60880640세척 중 과도한 식염수를 제거합니다
수술 기구: 메스 손잡이, 모기 겸자, 엄지 겸자, 메첸바움 가위, 스테이플러, 수술용 가위, 견인기, 거즈, 스테인리스 스틸 그릇해당 없음해당 없음외과용 팩 오토클레이브
서지벳: NIBP 커프, 체온 프로브, 그리고 nbsp; 침습적 혈압, 심전도, 맥박 산소 측정기 2회맥카시 수의생용품V9203비침습적 혈압계(NIBP), 체온계, 2배 침습적 혈압(BP), 심전도(ECG), 맥박 산소 측정기 포함
주사기 펌프 3개마취 펌프
테이프귀 IV 라인 고정
엄블리컬 테이프에티콘기관내 기관관 삽입
인공호흡기 (서보-I)게팅게적절한 일조량을 위해서는 신생아 설정이 필요합니다
환기 회로피셔와 페이켈RT265가습기 사용
보르스 튜브 폐쇄 클램프해당 없음해당 없음세척 중 튜빙 막힘

참고문헌

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