방법 논문

피하 농양에서 외과용 임플란트의 생물막 형성에 대한 정량적 평가를 위한 고유한 마우스 모델

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DOI:

10.3791/68067

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2025년 6월 6일

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1Department of Orthopaedic Surgery, Orthopaedic Trauma Institute (OTI), University of California, San Francisco (UCSF), 2Rosies Base, LLC, 3Department of Neurological Surgery, Weill Institute for Neurosciences, Brain and Spinal Injury Center (BASIC), University of California, San Francisco (UCSF)

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 단일 마우스 내에서 동일한 조건에서 박테리아가 있는 두 개의 임플란트를 동시에 배양할 수 있는 임플란트 관련 감염에 대한 고유한 실험 모델을 설명합니다. 또한 최적화된 비교 분석 방법을 사용하여 임플란트 표면의 생물막 형성을 정밀하게 평가할 수 있으며, 생체 재료의 항균 특성을 평가하기 위한 고급 기술을 입증합니다.

초록

정형외과 수술을 위한 항균 특성을 가진 새로운 생체 물질을 개발하기 위해서는 병리학적 상태를 밀접하게 모방한 임플란트 관련 감염에 대한 실험적 동물 모델을 확립하는 것이 중요합니다. 또한 물질의 생물막 형성을 평가하기 위해 대조 샘플과의 정량적 비교가 필요합니다. 그러나 각 개인에게 단일 물질을 이식하는 현재의 동물 모델은 피험자 간의 감염 상태의 이질성으로 인해 일관되지 않은 결과를 산출할 수 있습니다. 또한 in vivo 물질의 생물막 형성을 정확하게 정량화하는 것은 여전히 어려운 일이며 연구 결과의 신뢰성이 부족할 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 이 연구는 단일 마우스 내의 밀폐된 환경에서 박테리아가 포함된 두 개의 임플란트를 동시에 배양하여 캡슐화된 피하 농양을 형성할 수 있는 고유한 임플란트 관련 감염 마우스 모델을 보여주었습니다. 성숙한 에어 파우치는 처음에 등 피부 아래에 만들어졌습니다. 두 개의 스테인리스 스틸 와이어를 연결하여 파우치에 넣은 다음 황색포도상구균의 생물 발광 균주인 Xen 36을 접종했습니다. 접종 후 14일이 지났을 때, 전선 주위에 피하 농양이 형성되었습니다. 각 와이어의 표면에서 생물막을 완전히 제거하고, 용해된 박테리아 현탁액을 최적화된 방법을 사용하여 정확하게 측정하여 임플란트의 생물막 형성을 평가하고, 집락 형성 단위를 결정하고, 정량적 중합효소 연쇄 반응 분석을 수행했습니다. 생물 발광 박테리아의 lux operon을 활용하여 luxA 및 16S rRNA의 상대적 발현 수준을 사용하여 각 와이어의 생물막 내 박테리아 부하를 측정했습니다. 이 최적화된 비교 분석 접근법을 통해 단일 마우스 모델 내에서 균일한 감염 조건에서 두 개의 와이어에서 생물막 형성을 정밀하게 평가할 수 있으며 항균 특성을 가진 생체 재료의 발전을 촉진할 수 있습니다.

서론

임플란트 관련 감염은 수술 기법 및 임플란트 설계의 발전에도 불구하고 정형외과 수술에서 높은 이환율과 사망률을 유발할 수 있기 때문에 임상 환경에서 중요한 과제로 남아 있습니다1. 수술실 환경에서의 현대적인 무균 제어 표준과 수술 전후 항생제 예방을 위한 적절한 프로토콜로 인해 외과용 임플란트와 관련된 감염 발생률이 크게 감소했지만, 1차 수술에서 임플란트 관련 감염 발생률은 여전히 2%-5%2입니다.

임플란트 관련 감염의 주요 기전은 임플란트 표면에 생물막을 형성하는 것인데, 이는 항생제와 면역 체계로부터 미생물을 보호하여 감염을 근절하기 어렵게 만듭니다 3,4. 임플란트 표면에 대한 박테리아 부착은 생물막 형성의 첫 번째 단계에서 매우 중요하기 때문에 박테리아 접착 및 후속 생물막 형성을 최소화하는 것이 임플란트 관련 감염의 위험을 줄이기 위한 필수 전략입니다. 다양한 임플란트 기술의 항균 특성에도 불구하고 세포 독성 및 알레르기와 같은 부작용으로 인해 임상적으로 널리 사용되지 않았습니다 5,6,7,8. 따라서 임플란트 관련 감염의 위험을 줄이기 위해 안전성, 효능, 안정성 및 내구성을 조화시키는 항균 임플란트에 대한 충족되지 않은 임상적 요구가 여전히 있습니다. 항균 특성을 가진 임플란트의 연구 개발은 이러한 문제를 극복하기 위한 수술 기술을 발전시킬 수 있습니다.

대형 동물 모델 및 임상시험을 진행하기 전에 소동물 모델을 사용하여 다양한 생체 재료의 항균 특성을 평가하는 것이 필수적입니다9. 수많은 연구에서 luxABCDE 오페론 10,11,12,13,14,15를 포함하는 생물 발광 박테리아를 사용하여 임플란트 관련 감염에 적용 가능한 마우스 모델을 보여주었습니다. 이러한 모델은 항균 임플란트 또는 기술 개발에 대한 연구를 가속화하지만 몇 가지 한계가 있습니다. 첫째, X-ray 또는 전용 이미징 시스템과 같은 고급 전문 지식과 특수 장비가 마우스 모델에 배치된 임플란트에 가해지는 박테리아 부하를 직접적이고 정확하게 평가하기 위해 필요한 경우가 많습니다. 둘째, 수집된 임플란트는 일반적으로 동물당 단일 감염 부위에서 단독 임플란트를 평가하지만, 감염 상태와 면역학적 반응은 개인마다 다를 수 있으므로 비교 평가 결과에 변동이 있을 수 있습니다. 따라서 다양한 생체 내 재료의 항균 효과를 in vivo에서 비교할 때 균일한 환경에서 박테리아를 이식하고 접종하는 것이 이러한 문제를 해결하는 데 더 유익합니다. 또한 현재 방법론을 최적화하고 동물 모델과 사용된 박테리아의 특성을 활용하여 재현성과 정확성을 갖춘 정량적 평가를 수행하는 것이 필수적입니다.

이 연구는 생체 내 임플란트 관련 감염에 대한 새로운 실험적 접근 방식을 제시하며, 이를 통해 단일 마우스 모델 내에서 두 임플란트 표면의 생물막 형성을 비교 개별 및 개인 내 분석 방법을 통해 정밀하게 평가할 수 있습니다. 각 임플란트의 바이오필름은 임플란트의 바이오필름을 시각화하고, 집락 형성 단위(CFU)를 결정하고, 황색포도상구균의 생물 발광 균주에 대한 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 분석을 결정하기 위한 최적화된 방법을 사용하여 정량화할 수 있습니다. 이전 연구에서는 이러한 포괄적인 접근법을 사용하여 새로운 금속 임플란트가 황색포도상구균에 대한 유망한 생체 내 항균 효능을 가지고 있음을 보여주었습니다16. 이 방법론은 표준 실험실 환경에서 쉽게 구현할 수 있으며 항균 생체 재료 개발을 위한 연구를 가속화할 수 있습니다.

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프로토콜

모든 동물 절차는 UCSF(University of California San Francisco)의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았으며 UCSF 환경 보건 및 안전(Environmental Health and Safety)에서 관리하는 UCSF Biosafety Hazard Program과의 협의 및 승인을 거쳐 BSL2 시설에서 수행됩니다. 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스(12-16주령, 25-50mg)를 사용했습니다. 시약과 사용된 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 박테리아 준비

  1. 생물 발광 황색포도상 구균 Xen36 (ATCC49525)을 병원체로 사용하십시오.
    참고: 이 균주는 American Type Culture Collection(버지니아주 매나사스)에서 얻었으며 숙주의 네이티브 플라스미드에 최적화되고 통합된 luxABCDE 오페론을 고유하게 활용합니다. Xen36은 또한 럭스 오페론에 연결된 카나마이신 저항성 유전자를 사용합니다.
  2. 소량의 Xen 36 냉동 글리세롤 스톡을 넣고 200μg/mL 카나마이신을 함유한 트립틱 소이 육수(TSB) 배지 5mL에 조각을 추가합니다.
  3. 37°C에서 하룻밤 동안 진탕 배양기(200rpm)에서 배양합니다.
  4. 200μg/mL 카나마이신을 함유한 TSB 한천 플레이트(한천 내 TSB 1.5%)에 Xen36을 줄무늬로 만들고 37°C에서 밤새 배양합니다.
  5. 진탕 인큐베이터(200rpm)에서 37°C에서 하룻밤 동안 200μg/mL 카나마이신이 함유된 5mL의 TSB로 Xen36 단일 콜로니와 배양을 분리합니다.
  6. 630nm에서 결과 배양물의 흡광도를 측정합니다.
  7. 배양액을 희석하고 630nm에서의 흡광도를 기준으로 1.0 x 108 CFU/mL의 Xen36 배양을 만듭니다.
    참고: 630nm(TSB 블랭크 대비)에서 0.5의 흡광도 측정은 Xen36의 1.0 x 108CFU /ml와 거의 동일합니다.
  8. 배양액을 희석하고 1.0 x 105 CFU/mL의 Xen36 배양을 만듭니다.

2. 커넥티드 임플란트의 준비

  1. 각각 길이 8mm, 직경 0.5mm인 시중에서 판매되는 수술용 스테인리스강(SUS316L)으로 구성된 두 개의 막대 모양의 와이어를 사용하십시오.
  2. 약 3mm 길이로 절단된 20μL 피펫 팁의 양쪽 끝에 두 개의 와이어를 삽입하여 수직으로 연결합니다.
    참고: 수직으로 연결된 전선을 18G 바늘 끝에 삽입합니다(그림 1). 분리를 방지하기 위해 전선이 피펫 팁으로 단단히 고정되어 있는지 확인하십시오.
  3. 외과적으로 마우스에 이식하기 전에 와이어를 고압멸균합니다.

3. 성숙한 피하주머니 생성

참고: 세균 접종 7일 전에 다음과 같이 에어 파우치를 만듭니다.

  1. 흡입을 통해 마우스(C57BL/6)를 2% 이소플루란으로 마취합니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름).
    참고: 호흡수, 근육 긴장도, 발가락 꼬집음, 각막 반사 및 점막의 색을 관찰하여 적절한 마취 수준을 평가합니다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 사용하십시오.
  2. 마취된 마우스를 수술 침대로 옮기고 마우스의 등쪽 경추/흉부 부위를 면도합니다.
  3. 70% 에탄올과 포비돈 요오드로 전체 부위를 면봉으로 닦고 살균합니다.
  4. 10mL 주사기에 멸균 공기를 채우고 27G 바늘을 배출구에 연결합니다.
  5. 마우스의 목 아랫부분을 부드럽게 꼬집고 들어 올려 피하 조직과 근막 사이에 공간을 만듭니다.
  6. 바늘을 마우스의 견갑골 사이의 정중선에 놓고 3mL의 멸균 공기를 피하로 주입하여 공기 주머니를 만듭니다(그림 2).
    알림: 공기를 주입하는 동안 반대쪽 손으로 등의 양쪽을 잡고 공기가 등 중앙으로 퍼져 중간에 주머니를 만듭니다.
  7. 생쥐를 열 패드로 따뜻하게 한 케이지에 다시 넣고 마취에서 회복될 때까지 면밀히 모니터링합니다.
  8. 위에서 설명한 대로 3mL의 멸균 공기를 주입하여 캐비티의 팽창을 유지하고 2일마다 성숙한 파우치를 만듭니다.
    알림: 팽창할 때마다 파우치에서 공기를 흡입하여 바늘 끝이 적절하게 배치되었는지 확인하십시오. 바늘 끝은 파우치에 남겨두고 바늘에서 주사기를 조심스럽게 제거합니다. 파우치에 3mL의 멸균 공기를 다시 주입합니다.

4. 연결된 전선의 주입 및 세균 접종

  1. 첫 번째 공기 주입 후 7일 후에 3.1단계에 설명된 대로 마우스를 마취합니다.
    알림: 수술 중에는 마우스가 숨을 쉬고 마취되어 있는지 지속적으로 확인하십시오. 전체 수술 절차는 숙련된 외과의가 수행할 때 일반적으로 10-15분이 소요됩니다. 마취는 산소와 혼합된 2% 이소플루란을 전달하는 튜브를 마우스 옆에 배치하여 유지됩니다.
  2. 70% 에탄올과 포비돈 요오드로 전체 부위를 면봉으로 닦고 살균합니다.
  3. 수술 직전에 부피바카인을 피하로 주사합니다.
  4. 주머니 상단에 3mm의 정중선-세로 절개를 만듭니다.
  5. 연결된 전선이 들어 있는 18G 바늘을 구멍을 통해 파우치에 삽입하고 25G 척추 바늘의 내부 주사기를 사용하여 전선을 밀어냅니다(그림 3A, B).
  6. 18G 바늘 끝을 파우치 안에 넣은 채 내부 실린더를 부드럽게 제거하고 주사기를 사용하여 1.0 x 105 CFU/mL Xen36 배양 3mL를 주입합니다(그림 3C,D).
  7. 조심스럽게 모든 바늘을 제거하고 상처 클립을 사용하여 피부를 봉합한 다음 국소 피부 접착제로 밀봉합니다(그림 3E, F).
  8. 누출이 없는지 확인하고 열 패드로 따뜻하게 한 개별 케이지에 마우스를 다시 넣고 이전과 같이 모니터링합니다.

5. 피하 농양에서 임플란트 추출

  1. 이소플루오란을 과다 투여 하여 안락사한 후 마우스의 등쪽 경추, 흉부 및 요추 부위를 면도하고 70% 에탄올과 포비돈 요오드로 전체 부위를 면봉 및 살균합니다(그림 4A).
    참고: 안락사는 미국 수의학 협회(AVMA)의 동물 안락사 지침에 따라 진행되었습니다.
  2. 요추 부위를 2cm 정도 정중하게 절개하고 가위를 이용하여 피하 조직을 조심스럽게 각질을 제거합니다.
  3. 절개 부위와 피하 절개를 근방으로 확장하고 농양을 둘러싼 부착 조직을 분리합니다(그림 4B - D).
  4. 피하 농양 전체를 절제합니다(그림 4E).
  5. 농양을 자르고 농양 내부에서 와이어를 조심스럽게 빼냅니다(그림 4F).

6. 임플란트 표면에 형성된 생물막의 정량화

  1. 크리스탈 바이올렛 어세이
    1. 농양에서 추출한 와이어를 24mL의 탈이온수(DI) 물이 들어 있는 1웰 플레이트의 개별 웰에 넣습니다.
    2. 와이어 표면에서 느슨하게 부착된 박테리아를 제거하기 위해 1mL의 DI 물이 포함된 새 웰로 와이어를 옮깁니다.
    3. 100% 에탄올로 와이어에 바이오필름을 1분 동안 고정하고 건조시킵니다.
    4. 와이어를 1mL의 0.1% 크리스탈 바이올렛 시약이 들어 있는 새 웰로 옮깁니다.
    5. 15분 동안 염색한 후 DI 워터로 와이어를 두 번 부드럽게 세척하여 과도한 염료를 제거합니다.
    6. 33% 아세트산 250μL가 들어 있는 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 임플란트를 15분 동안 놓습니다. 임플란트의 생물막에 부착된 크리스탈 바이올렛을 가용화한 다음 1분 동안 와류화합니다.
    7. 200μL의 현탁액을 96웰 플레이트로 옮기고 마이크로플레이트 리더를 사용하여 OD630nm 에서 흡광도를 측정합니다. 모든 측정은 삼중으로 수행됩니다.
  2. 집락 형성 단위(CFU) 계수
    1. 6.1.2단계에 설명된 대로 전선 표면에서 느슨하게 부착된 박테리아를 제거합니다.
    2. 200μL의 10x 트립신이 들어 있는 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 임플란트를 넣고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
    3. 1분 동안 와류를 일으키고 100W의 수조에서 5분 동안 초음파 처리한 다음 30초 동안 추가로 소용돌이를 일으켜 생물막을 현탁액으로 분리합니다.
    4. TSB 한천 플레이트(한천 내 TSB 1.5%)에 연속 희석된 현탁액 10μL에 200μg/mL 카나마이신을 접종합니다.
      참고: 각 솔루션에 대해 이 절차를 세 번 수행합니다.
    5. 플레이트를 37°C에서 24시간 동안 배양한 후 플레이트의 콜로니를 세고 평균 콜로니 카운트17을 사용하여 원래 배양액의 박테리아 세포 수를 계산합니다.
      알림: 정확한 측정에 중요한 전선에서 모든 박테리아가 제거되도록 하려면 전선을 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 플레이트에 현탁액을 적용한 후 관찰하십시오. 예비 실험에서 위의 기계적 및 화학적 해리의 조합은 기존 스테인리스강 와이어의 표면에서 모든 Xen36 생물막을 성공적으로 제거했습니다(그림 5).
  3. 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR) 분석
    1. 6.1.2단계에 설명된 대로 전선 표면에서 느슨하게 부착된 박테리아를 제거합니다.
    2. 600μL의 TSB가 들어 있는 1.5mL 마이크로튜브에 임플란트를 넣습니다.
    3. 펠릿이 없는 변형 알칼리 용해 시스템16을 사용하여 DNA를 추출합니다.
      참고: 용리된 DNA의 최종 부피는 20μL입니다.
    4. DNA를 1:10으로 희석하여 -20 °C에서 보관합니다.
    5. luxA 및 16S rRNA 유전자16에 대해 qPCR을 수행합니다.
      참고: 모든 qPCR 반응은 3회에 걸쳐 수행됩니다. 총 반응 혼합 부피는 10 μL이며, DNA 템플릿 3 μL, SYBR Green 5 μL, 뉴클레아제가 없는 물 1 μL 및 각 프라이머 0.5 μL를 포함합니다. luxA 유전자에 대한 프라이머는 5'-GAGCATCATTTCACGGAGTTTG -3' 및 5'-ATAGCGGCAGTTCCTACATTC -3'입니다. 16S rRNA 유전자에 대한 프라이머는 5'- GTGGAGGGTCATTGGAAACT - 3' 및 5'- CACTGGTGTTCCTCCATATCTC - 3'입니다. PCR 조건은 다음과 같습니다 : 94 °C에서 2 분 동안 초기 변성 후 94 °C에서 15 초, 60 ° C에서 30 초, 72 ° C에서 30 초의 40 사이클, 72 ° C에서 5 분 동안 최종 연장.
    6. 임플란트에 대한 박테리아 부하를 추정하기 위해 연속적으로 희석된 순수 Xen36 배양물에서 직접 정제된 DNA로 생성된 보정 곡선에 대해 3주기 임계값(Ct) 값의 평균을 플롯합니다(그림 6).

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결과

이 연구는 이전 연구에서 사용된 임플란트 표면의 생물막 형성에 대한 최적화된 정량적 평가와 함께 임플란트 관련 감염에 대한 새로운 마우스 모델을 사용하여 포괄적인 접근 방식의 신뢰성을 평가했습니다16. 두 개의 동일한 임플란트는 표면에 형성된 생물막을 검사하는 데 사용되었으며, 단일 마우스 모델의 고독한 피하 공간 내에서 두 임플란트가 균일한 감염 조건에서 동시에 배양될 수 있는지 확인하는 것을 목표로 했습니다. 마우스는 피하 주머니 생성 절차를 거쳤고(그림 2), 7일 후에 연결된 스테인리스강 와이어를 성숙한 주머니에 이식한 다음 황색포도상구균 Xen36을 접종했습니다(그림 3). 접종 후 14일이 지나면 길이 약 2cm, 너비 1cm의 캡슐화된 농양이 파우치에 형성된 연결된 와이어를 포함합니다(

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토론

이 연구는 새로운 마우스 모델과 임플란트 관련 감염에 대한 최적화된 분석 기술을 활용하여 여러 임플란트에서 생물막 형성의 정확한 정량적 평가를 위한 포괄적인 접근 방식을 보여주었습니다. 동일한 피험자에게 동일한 감염 조건에서 두 개의 임플란트를 배양하기 위해 반복적인 공기 주입을 통해 한 마리의 마우스 내에서 성숙한 피하 주머니를 만들었습니다. 이 모델은 마우스가 움직이는 동안에도 동일한 감염 조건에서 두 개의 연결된 임플란트를 배양할 수 있는 폐쇄적이고 안정적인 환경을 제공했습니다. 황색포도상구균을 접종한 후, 약 2cm 길이의 고독하게 캡슐화된 피하 농양이 발생했는데, 이는 양쪽 와이어를 완전히 둘러싸고 임상 임플란트 관련 감염의 특성과 매우 유사했습니다. 두 와이어는 농양에서 추출하고 기계적 및 화학적 해리를 사용하여 각 표면에서 생물막을 제거했습니다. 용해된 박테리아 용액은 각 와이어의 생물막 내 박테리아 부하를 정량적으로 분석하는 데 사용되었습...

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공개 사항

저자는 경쟁 이익이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 Center for Disruptive Musculoskeletal Innovations(IIP-1916629), Komatsuseiki Kosakusho Co., Ltd. 및 Rosies Base, LLC라는 NSF 산학협력 연구 프로그램의 일부 자금 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세트산토마스 사이언티픽12-16-15-00
Agilent BioTek 800 TS 흡광도 리더애질런트BT800TS
Air-Tite 멸균 피하 주사 바늘, 바늘 게이지: 18g피셔 사이언티픽14817151(CS)
BD 척추 바늘: 25g피셔 사이언티픽22043805
벤치탑 인큐베이터 셰이커피셔 사이언티픽
Branson 초음파 수조, 115 Vac, 60 Hz피셔 사이언티픽2489500
브랜슨 초음파 2510R-MTH (초음파 발생기)RPI-T48500-500.0
원심분리기 sorvall pico피셔 사이언티픽
CFX96 실시간 광학 모듈 qPCR 시스템바이오 RAD
소형 살균기, 30L토마스 사이언티픽 LLC22A00N096 (EA/1)
크리스탈 바이올렛, 1%, 용액 SCI_ED피셔 사이언티픽10114-58-6
Falcon 24웰 세포 배양 플레이트피셔 사이언티픽877125
Falcon 96웰 세포 배양 플레이트피셔 사이언티픽8771001
Fisherbrand 디지털 와류 믹서피셔 과학
카나마이신토마스 사이언티픽 LLC 15160054
만니톨 소금 한천 
피셔 과학 
Micirobiological 인큐베이터써모 사이언티픽51028063H
PBS, 인산염 완충 식염수
황색포도상구균 ATCC 49525 (Xen36)퍼킨 엘머119243
SYBR 그린 I 핵산 젤 염색피셔 사이언티픽
트립신 10x (2.5%)피셔 사이언티픽15090046
트립산 콩 국물 네타 사이언티픽 INC 
Zyppy 플라스미드 미니프렙 Ki피셔 사이언티픽501977785펠릿 프리 변성 알칼리성 용해 시스템

참고문헌

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