관절의 생체 영상 촬영은 염증이 생긴 관절 내 백혈구의 이동 행동과 분자 역학을 밝히는 데 매우 유용한 기법입니다. 여기서는 제2형 콜라겐 유발 관절염(CIA) 마우스 모델을 사용한 관절의 생체 내 영상 검사에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
백혈구는 염증을 매개하기 위해 뼈에서 유래한 혈액 매개 세포로, 조직으로 이동해야 합니다. 따라서 이 이동을 통제하는 것은 염증을 완화하기 위한 새로운 치료 전략 개발에 중요한 시점입니다. 전통적인 종말 연구로는 생체 내 백혈구의 이동 행동을 완전히 해부하지 못했습니다. 그러나 최근 영상 기술의 발전은 살아있는 동물의 면역 세포 이동에 대한 전례 없는 통찰을 제공하여, 면역 세포 수송의 분자 조절에 대한 이해를 크게 향상시켰습니다.
여기서는 마우스 타입 II 콜라겐 유발 관절염(CIA) 모델을 이용한 관절의 생체 내 영상 검사에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 마우스는 완전한 프로인트 보조제에 유화된 제2형 콜라겐으로 면역을 받으며, 관절염 진행 상황은 임상 점수 측정과 발바닥 두께 측정으로 모니터링됩니다. 관절염 절정기에는 형광 단백질을 발현하는 형질전환 마우스에서 공초점 현미경을 사용해 생체 내에서 백구를 관찰하거나, 야생형 마우스에서는 혈관 염색을 위해 형광 표지된 항체와 고분자량 덱트렌을 정맥 주사한 후 관찰됩니다. 관절의 신중한 외과적 노출, 아가로스 도포, 그리고 다리의 적절한 위치 조정을 통해 안정적인 장기 영상 촬영이 가능하며, 보통 몇 시간 동안 지속됩니다. 이 접근법은 염증이 있는 관절 내 백혈구 정지, 기어 다니기, 내피 이동을 실시간으로 분석할 수 있게 합니다.
이 프로토콜은 관절염 및 기타 염증성 질환에서 백혈구 수송을 연구하는 연구팀에 매우 유용할 것입니다. 또한 면역 세포 이동을 표적으로 하는 치료법의 전임상 평가 플랫폼으로도 활용될 수 있습니다.
서론
백혈구는 골수에서 유래한 혈액 매개 세포이기 때문에 염증을 일으키려면 조직 내에 들어가야 합니다1. 이 과정의 조절은 염증을 완화하기 위한 새로운 치료제가 개발될 수 있는 핵심 시점입니다. 일반적으로 염증 조직으로의 백혈구 이동은 모세혈관 후 정맥에서 발생하며, 혈관 벽에 의해 자유롭게 흐르는 백혈구가 포획되는 유착 연쇄 과정을 따라갑니다. 더 나아가, 이 과정 뒤에는 백혈구가 혈관 벽을 따라 흐름 방향으로 굴러가고, 내피에 백혈구가 정지하며, 유착에서 해제되고, 혈관 표면 모든 방향으로 기어가 조직 내 특정 위치로 이동할 수 있는 수용 부위(TEM)를 찾는다.
이러한 뚜렷한 단계는 셀렉틴(구르기용), 인테그린(정지, 기어가기용), 화학유인제(CA)(정지, 기어갈 가능성, TEM) 등 분자 신호의 조합에 의해 조절됩니다. CA는 7개의 막을 관통하는 G 단백질 결합 화학유인체(CAR)를 통해 백혈구를 활성화하며, 인테그린 친화도를 상향 조절하여 정지(정지)를 유도하고 TEM을 유도함으로써 부착 연쇄 과정에서 중요한 역할을 합니다. 그러나 TEM의 정확한 메커니즘은 완전히 이해되지 않았습니다. 전통적인 평가 연구 및 시험관 내 실험은 CA-CAR 신호전달이 생체 내에서 백혈구 이동 행동을 동적으로 조절하는 방식을 밝히지 못했습니다.
최근 영상 기술의 발전은 살아있는 동물의 면역 세포 이동에 대한 전례 없는 시각을 제공하여, 생체 내 면역 세포 수송의 분자 조절에 대한 이해를 크게 향상시켰습니다 4,5,6.예를 들어, 이 기술은 열간 손상7, 레이저 피부 손상8과 같은 조직 염증 부위로의 호중구 수송 분자 조절을 밝혀냈습니다. 따라서 우리는 관절염 부위로의 호중구 수송을 조절하는 분자 메커니즘을 조사하기 위해 신청했습니다. 여기서 설명한 생체 관절 영상은 보체 구성 요소 C5a 수용체 1(C5aR1)이 호중구 부착을 관절 내피에 유도하여 관절 내 염증을 유발하는 데 매우 중요함을 밝혀냈습니다. C5aR1은 인테그린 의존적 호중구 정지 및 전파를 촉진했으며, 이어 백코트리엔 B4 수용체에 의한 TEM과 CC 화학민 수용체 1(CCR1)에 의해 기어가는 현상이 이어졌습니다. CXC 화학카인 수용체 2(CXCR2)는 염증 관절 내 호중구 TEM 후기 단계에서 역할을 했습니다10. 또한, 생체 내 관절 영상 검사에서는 관절 내 3형 과민반응에서 새로운 패러다임이 밝혀졌는데, 여기서 C5a는 염증의 시작인자로 작용하고, 조직 내 세포는 현재 제3형 과민반응 패러다임에서 염증에서 더 중요한 역할을 한다10,11.
또한, 관절의 생체 내 영상을 적용하여 관절 내 C5a의 분자 역학을 연구하였습니다. 야생형 마우스에서 관절 조직에 적재된 C5a는 혈관 내강으로 빠르게 운반되었으나, C5aR2 결핍 마우스에서는 C5a가 완전히 활막 조직 내에 남아 있었습니다. 이 데이터는 관절 내피에서 발현된 C5aR2가 C5a를 혈관 내강으로 운반하며, 이는 관절 내 C5aR1 의존성 호중구 유착에 필수적인 과정임을보여줍니다.
관절의 생체 영상은 모든 염증성 관절염 모델에 적용 가능하며 장기간 관찰(보통 몇 시간 정도)을 가능하게 하지만, 사용하는 현미경에 따라 심부 조직(>1 mm) 시각화는 제한될 수 있습니다. 이 기법은 염증이 생긴 관절 내 백혈구의 이동 행동과 분자 역학을 조사하는 강력한 도구를 제공합니다. 우리는 염증이 있는 관절에서 이 과정을 연구하는 연구팀을 지원하기 위해 이 프로토콜을 생체 내 관절 영상 촬영에 공유합니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
모든 동물 실험은 세인트 마리아나 대학교 의과대학의 기관 동물 관리 및 이용 위원회(승인 번호)의 승인을 받았습니다. TG240926-2 및 TG250801-2)는 기관 및 국가 지침에 따라 진행되었습니다.
1. 관절염 마우스 모델 준비
참고: 관절염의 동물 모델은 질병의 발병 기전을 이해하고 새로운 치료법을 개발하는 데 귀중한 도구를 제공해 왔습니다14. 여러 관절염 마우스 모델이 고유한 장점과 한계를 가지고 있지만, 제2형 콜라겐 유발 관절염(CIA)은 류마티스 관절염(RA)의 발병 기전 연구에 널리 사용되어 왔습니다14. 이 절에서는 CIA 관절염 모델의 프로토콜을 설명합니다(용품 및 기구는 그림 1에 표시됨).
- 4°C에서 하룻밤 흔들어 0.05M 아세트산(최종 농도 4 mg/mL)에 희석한 소 II 콜라겐을 준비합니다.
- 유제를 만들기 위해 콜라겐 희석물(4 mg/mL, 0.05 M 아세트산)을 완전한 프로인트 보조제(CFA)와 1:1 비율로 유리 주사기에서 혼합합니다. 이로 인해 유제 내 최종 콜라겐 농도는 2 mg/mL가 됩니다. 손으로 약 20분간 힘차게 섞어주세요. 이 과정은 열을 발생시키므로, 유제가 들어 있는 유리 주사기를 얼음 위에 식히세요. 준비 중에 유제의 질도를 비커로 확인하세요.
메모. 남은 콜라겐 희석은 -80°C에 보관하세요. 이 백신은 두 번째 예방접종에 사용할 수 있습니다. - 에멀젼을 26 x 1/2 G 바늘이 장착된 1mL 유리 주사기로 옮기고, 예방접종 전까지 얼음에 보관하세요.
- 8주 된 DBA1/J 마우스(수컷 또는 암컷)에게 메데토미딘(0.3 mg/kg), 미다졸람(4 mg/kg), 베토르팔레(5 mg/kg)의 복막 내 주사로 마취합니다.
메모. 형질전환 마우스는 종종 C57BL6 배경을 가지고 있습니다. 닭 콜라겐은 주로 C57BL6 마우스에서 CIA에 사용됩니다; 그러나 C57BL6 마우스에서 CIA의 발생률과 중증도는 DBA/1J 마우스보다 낮습니다. C57BL6 배경에서 형질전환 마우스를 사용할 경우, CIA 발생률과 중증도를 평가하기 위한 파일럿 연구를 고려할 수 있습니다. - 예방접종을 위해 이발기를 사용해 꼬리 주변 털을 밀어주세요.
- 100 μL 부피의 유화(콜라겐 200 μg 포함)를 꼬리 등쪽(꼬리 밑부분 근처)을 피하 공간에 천천히 주입합니다(그림 2).
- 21일째에 1.2부터 1.6까지 단계를 반복하여 두 번째 예방접종을 시행합니다(그림 2).
2. 관절염 임상 점수 평가 및 발바닥 두께 측정
참고: 관절염의 임상 점수 부여와 발바닥 두께 측정은 질병 활동성 평가에 필수적입니다. 일반적으로 관절염 임상 점수 및 발바닥 두께 측정은 첫 접종 후 1-3일마다 이루어집니다.
- 관절염 임상 점수: 각 쥐의 네 발 모두에 대한 점수 합계를 기록하세요. 다음 점수 체계를 사용하세요:
0 = 정상
1 = 홍반과 한쪽 손가락 부종
2 = 두 손가락의 홍반과 부종 또는 발목 관절의 홍반과 부종
3 = 홍반과 세 손가락 이상의 부기 또는 두 손가락과 발목 관절의 부종
4 = 발목, 발, 손가락의 심한 부종과 기형.
메모. 부어오른 발목 관절은 발바닥 두께가 4mm를 초과하는 것으로 정의됩니다. - 발 두께 측정: 디지털 슬라이드 캘리퍼스를 사용해 각 발의 두께를 측정하세요. 각 쥐의 네 발 모두에 걸쳐 평균 발 두께를 사용하세요.
3. 관절의 생체 내 영상
참고: 관절의 생체 영상 촬영을 통해 백혈구가 관절로 이동하는 모습을 관찰하고, 생체 생쥐에서 조직 내 그 행동을 분석할 수 있습니다. 세포를 시각화하기 위해, 특정 세포에서 형광 단백질을 발현하도록 유전공학적으로 개조된 형질전환 마우스와 항세포 표지 항체를 정맥 주사한 마우스가 사용됩니다. 사용된 보급품은 그림 3에 나와 있습니다.
- 관절 유발 마우스를 메데토미딘(0.3 mg/kg), 미다졸람(4 mg/kg), 베토르팔레(5 mg/kg)로 복강 내 마취합니다.
- 이발기로 쥐 다리를 면도하고 제모 크림(<60초)을 사용해 남은 털을 제거하세요. 피부 자극을 방지하기 위해 장기간 바르지 마세요.
- 크림을 촉촉한 거즈로 제거하세요(그림 4A). 영상 부위에 원치 않는 자가형광을 방지하기 위해 모든 모발을 제거하세요. 필요하면 반복하세요.
- 마취 중 양쪽 눈에 멸균 각막 윤활제를 발라하여 각막 건조나 궤양을 예방합니다.
- 수술 내시경 아래에서 미세가위를 사용해 피부를 따라 1cm 절개를 합니다(그림 4B).
메모. 이 단계는 매우 중요합니다. 수술은 백혈구(특히 호중구) 모집을 유발할 수 있습니다. 아티팩트를 유발할 수 있는 손상은 피하세요. 관절염 관절의 혈관신생으로 인해 이 관절들은 출혈에 취약합니다. 성공적인 수술을 위해서는 여러 차례 연습이 필요할 수 있습니다. - 관절염 관절을 플라스틱 판 위에 위치시킵니다(그림 4C).
메모. 조직 접착제는 쥐의 다리를 고정하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 연구는 점토를 이용해 유리 슬라이드를 플라스틱 판에 고정합니다. - 영상 영역을 약 1mL 1.5% 아가로스와 인산 완충 식염수(PBS)를 덮습니다(그림 4D).
메모. 아가로오스가 식었는지 확인하여 조직 손상을 예방해야 하며, 이는 영상 부위로의 백혈구 모집을 촉진할 수 있습니다. - 현미경 앞에서 무대를 세팅하세요.
메모. 장시간 영상 촬영 중에는 온열 패드를 사용해 쥐의 체온을 유지하세요. - 공초점 현미경 설정(레이저 출력, 게인, 오프셋, 위치 등)을 조정하세요. 여기서는 25 수중 물에 담긴 대물렌즈 NA 1.1을 사용한 공초점 현미경으로 영상 촬영을 수행합니다. 레이저 여기 거리를 488 nm, 561 nm, 640 nm에 설정하고, 방출은 488.0 nm, 561.6 nm, 638.5 nm에서 수집합니다.
- 현미경 스캔 속도를 확인하세요. 512 x 512 픽셀 해상도, 5개의 광학 단면, 4 μm Z 스택, 15초의 사이클 타임을 사용하여 개별 운동성 세포를 충분한 시간 동안 분석하여 의미 있는 데이터를 얻을 수 있도록 합니다.
- 적합한 위치를 확인하면 이미지 수집을 시작하세요.
메모. 항세포 표지체 항체를 이용해 백혈구를 표지할 경우, 영상 촬영 시작 3분 전에 항체를 정맥 주사로 투여하세요. 혈관 시각화를 위해 Qdots, CD31 항체, 또는 덱트론을 동시에 주입하세요. 예를 들어, 호중구에는 약 2 μg의 Ly6G, T 세포에는 CD4 항체를, 혈관 염색을 위해 680-250k 덱트론 약 80 μg를 주입합니다. 항체와 덱트론은 보통 100 μL 무균 PBS에 용해됩니다. 일부 항체가 백혈구 수를 감소시킬 수 있으니, 선택된 항체가 백혈구 수를 감소시키지 않도록 주의하세요. - NIS-Elements 이미지 분석 소프트웨어의 General Analysis 3(GA3) 모듈(버전 6.20.00)을 사용하여 공초점 현미경으로 획득한 ND2 파일 이미지를 처리합니다. 혈관 부위 추출과 배경 감산 시술을 수행합니다. 모든 시간 프레임을 처리한 후 이미지를 비디오로 내보내세요.
메모. 분석 과정에서 붙어 있는 세포와 침투 세포의 수를 세세요. - 영상 촬영이 끝난 후, 생존 절차로 동물을 회복시키거나 인도적으로 안락사시키는 것이 실험 설계에 따라 결정됩니다. 생존을 목표로 한다면, 수술 부위를 부드럽게 닫고 기관 동물 관리 지침에 따라 적절한 수술 후 관리를 제공하세요.
참고: 본 연구에서는 모든 동물이 기관 및 국가 지침을 준수하여 영상 촬영 직후 인도적으로 안락사되었습니다.
4. 통계 분석
- 데이터를 평균± 표준오차(SEM)로 제시합니다. 두 그룹 비교에는 학생 t-검정을, 다집단에는 일원 ANOVA를 사용한 후 Tukey의 사후 검정을 사용하여 통계 분석을 수행합니다. p-값 0.05< 통계적으로 유의미하다고 생각하자.
참고: 모든 분석은 GraphPad Prism 버전 10을 사용하여 수행되었습니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
여기서는 8주 된 수컷 DBA/1J 쥐를 0일차와 21일차에 소 타입 II 콜라겐과 CFA가 포함된 유제로 1:1 비율로 면역을 접종합니다. 관절염 임상 점수 매기기와 발바닥 두께 측정은 0일차부터 42일차까지 1-3일마다 수행됩니다. 일반적으로 관절염의 발병은 약 28일째에 관찰되며, 관절염 임상 점수와 발바닥 두께는 약 35일째에 정점에 도달합니다(그림 5A-C). DBA/1J 마우스에서 CIA 발생률은 보통 35일차에 90-100% 이상입니다(그림 5A)15.
반면, 8주 된 수컷 C57BL6 마우스는 0일차와 21일차에 닭 타입 II 콜라겐과 CFA가 포함된 유제로 1:1 비율로 면역을 접종합니다. CIA...
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
관절의 생체 내 영상은 전통적인 종말 연구와 달리 생체 내 생체 영상 검사에서 생체 생체 생체 생체 내 역동적인 생물학적 과정에 대한 전례 없는 통찰을 제공합니다. 예를 들어, 이 기법은 네 가지 서로 다른 화학유인제 수용체인 C5aR1, BLT1, CCR1, CXCR2가 어떻게 협력하여 관절염 염증 관절에 호중구 모집을 시작하는지 이해할 수 있게 합니다10,11. 또한, 생체 내 영상 검사에서 C5aR2가 조직에서 혈관 내강으로 C5a를 운반하는 새로운 기능적 역할을 한다는 사실이 밝혀졌습니다.
하지만 이 방식을 사용할 때는 아래에 자세히 설명된 중요한 단계와 한계가 있습니다. (i) 수술적 도전: 수술은 특히 호중구를 포함한 백혈구의 관절...
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
Y.M.은 추가이 제약회사로부터 연구비 및 연구 지원을 받았습니다.
감사의 글
Y.M.의 활동은 일본학술진흥회(JSPS) KAKENHI [연구비 번호 JP22K08531, JP25K02574]의 지원을 받고 있습니다. 일본 의학연구개발기구(AMED) [연구비 번호 25bm1423033]; 모치다 의학 및 제약 연구 기념재단; JCR 연구 촉진 보조금, FRONTIER와 미쓰비시 재단.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 29 G x 1/2" | 테루모 | SS-10M2913 | |
| 0.1 M 아세트산 | 후지필름 | 016-18835 | |
| 1mL 플라스틱 주사기 | 맨 위로 | 19531 | |
| 그리스용 1mm 주사기 | 테루모 | SS-01T | |
| 18 G x 1 1/2" | 테루모 | NN-1838R | |
| 26 G x 1/2" | 테루모 | NN-2613 | |
| 680-250 kDa 덱스트란 | 바이오티움 | 80135 | |
| 아가로스 | 인비트로젠 | 16520-100 | |
| 소 유형 II 콜라겐 | 콜라겐 연구 센터 | K42 | |
| 점토 | 데비카 | 93186 | |
| 완전 프렌트 보조제(CFA) | 콘드렉스 | 7001 | |
| 공초점 현미경 | 니콘 | A1 | |
| 커버 유리 | 마쓰나미 글라스 IND.,Ltd | C024401 | |
| 디지털 슬라이드 캘리퍼 | 미츠토요 | 500-180-30 | |
| 팔콘 튜브 (15 mL) | 코닝 | NA | |
| 팔콘 튜브 (50 mL) | 코닝 | NA | |
| FITC 접합 항생쥐 Ly6G 항체 | 바이오레전드 | 127606 | |
| 겸자 | 로보즈 | RS-5070 | |
| 겸자 | 나폭스 | MA-48-2 | |
| 유리 주사기와 커넥터 | 츠바사 산업주식회사, nbsp; | 시즌 7P | |
| 그리스 | 토레이 다우 코닝 실리콘 | NA | |
| 머리깎이 | 발 | WA5109 | |
| 머리깎이 | 발 | 9966 | |
| 제모 크레이브; 나 | 크라시 | 해당 없음 | |
| 메데토미딘 | 메이지 | 해당 없음 | |
| 마이크로 가위 | 로보즈 | RS-5610 | |
| 마이크로 가위 | 로보즈 | RS-5630 | |
| 미다졸람 | 산도즈 | 해당 없음 | |
| 습한 거즈 | 닛폰 페이퍼 크레시아 주식회사 | S-200 | |
| NIS-Elements 이미지 분석 6.20.00 | 니콘 | NA | |
| 팔콘 튜브 내 PBS (50 mL) | 시마즈 진단 주식회사 | 5913 | |
| PE 접합 항생쥐 CD4 항체 | 바이오레전드 | 100408 | |
| 플라스틱 플레이트 | 코닝 | 351029 | |
| 프리즘 10.3.1 | 그래프패드 | NA | |
| 슬라이드 글라스 | 무토 퓨어 케미컬 주식회사 | 5115 | |
| 수술 범위 | 올림포스 | VMZ | |
| 조직 결합 | 3M | 1469SB | |
| 베토르팔레 | 메이지 | 해당 없음 |
참고문헌
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Miyabe, Y., Lian, J., Miyabe, C., Luster, A. D. Chemokines in rheumatic diseases: pathogenic role and therapeutic implications. Nat Rev Rheumatol. 15 (12), 731-746 (2019).
- Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity. Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).
- Murooka, T. T., et al. HIV-infected T cells are migratory vehicles for viral dissemination. Nature. 490 (7419), 283-287 (2012).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427 (6970), 154-159 (2004).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital microscopy: visualizing immunity in context. Immunity. 21 (3), 315-329 (2004).
- Wang, J., et al. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Miyabe, Y., Kim, N. D., Miyabe, C., Luster, A. D. Studying chemokine control of neutrophil migration in vivo in a murine model of inflammatory arthritis. Methods Enzymol. 570, 207-231 (2016).
- Miyabe, Y., et al. Complement C5a receptor is the key initiator of neutrophil adhesion igniting immune complex-induced arthritis. Sci Immunol. 2 (7), eaaj2195(2017).
- Sadik, C. D., Miyabe, Y., Sezin, T., Luster, A. D. The critical role of C5a as an initiator of neutrophil-mediated autoimmune inflammation of the joint and skin. Semin Immunol. 37, 21-29 (2018).
- Miyabe, Y., Miyabe, C., Mani, V., Mempel, T. R., Luster, A. D. Atypical complement receptor C5aR2 transports C5a to initiate neutrophil adhesion and inflammation. Sci Immunol. 4 (35), eaav5951(2019).
- Kohl, J. Igniting the flame in arthritis: C5aR2 controls endothelial transcytosis of C5a. Sci Immunol. 4 (35), eaax0352(2019).
- Miyabe, Y., Miyabe, C., Luster, A. D. LTB4 and BLT1 in inflammatory arthritis. Semin Immunol. 33, 52-57 (2017).
- Miyabe, Y., et al. Necessity of lysophosphatidic acid receptor 1 for development of arthritis. Arthritis Rheum. 65 (8), 2037-2047 (2013).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
태그
