네크로 텍스의 microcircuits의 네트워크 역학을 이해하기 위해서는 동시에 뉴런의 다수의 활동을 기록하는 것이 필수적입니다. - 생체내에서 두 광자 칼슘 이미징 하나는 단일 셀 해상도 고밀도의 연결 인구의 활동을 기록하는 수있는 유일한 방법입니다.
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이 논문에서
요약
초록
네크로 텍스의 microcircuits의 네트워크 역학을 이해하기 위해서는 동시에 뉴런의 다수의 활동을 기록하는 것이 필수적입니다. - 생체내에서 두 광자 칼슘 이미징 하나는 단일 셀 해상도 고밀도의 연결 인구의 활동을 기록하는 수있는 유일한 방법입니다. 방법은 뉴런의 큰 숫자에 의해 촬영하고 마지막에 - 생체내 두 광자 현미경을 사용하여 시간 저속 칼슘 이미징과 뉴런의 활동을 기록 할 수있는 형광 칼슘 지표 염료를 주입, 두개골 이미지 창을 이온 주입으로 구성되어 있습니다. astrocyte 특정 염료의 공동 주사 하나 astrocytes에서 뉴런을 차별화 할 수 있습니다. 기술은 더 나은 세포의 서로 다른 그룹의 네트워크 상호 작용을 이해하는 뉴런의 특정 subpopulations에 형광 분자를 표현 생쥐에서 수행할 수 있습니다.
프로토콜
- 형광 칼슘 지표 솔루션을 준비합니다. 우리는 짧게 염료를 아세 톡시 메틸 에스테르 염료를 사용하거나, AM. 이들은 extracellularly 주입했을 때 세포에 의해 촬영 수있는 염료입니다. 우리는 일반적으로 1 ㎜의 농도에 오레곤 - 그린 BAPTA - 1 AM 또는 AM Fluo - 4를 사용합니다. AM의 염료 50 마이크로 그램의 튜브 안에 Invitrogen에서 얻을 수 있습니다. 우리가 먼저 DMSO에서 Pluronic F - 127의 20 % 솔루션을 준비합니다. 우리는 분명까지 매일 사용하기 전에 솔루션을 따뜻하게. 우리는 칼슘 표시 10 mm의 농도 15-20분에 대한 20 % Pluronic의 F-127/DMSO을 풀다. 150 NaCl, 2.5 KCl, 10 Hepes, 산도 7.4 : 우리는 다음 MM에 포함된 솔루션에서 1mM에 대한 해결책을 희석. 또한, 100 μm의 제품 Sulforhodamine 101은 일반적으로 레이블 astrocytes에 포함되어 있으며 사출 동안 피펫을 시각화. 우리는 0.49 미크론 원심 필터 (..; Garaschuk 외, 2006 Stosiek 외, 2003)로 사전에 주입에 대한 해결책을 필터링합니다.
- 몇 군데로 그 지역에있는 두개의 창문을 이식. 우리는이
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토론
electrophysiological 녹음을 통해이 방법의 장점은 덜 침략하고 밀도의 연결의 연결을 네트워크에 활동의 기록을 허용한다는 것입니다. 이 절차를 수행할 때 그것은 두라을 손상하지 craniotomy를 수행할 때 극단적인 돌봐 기억하는 것이 중요 S. 과 경막하 출혈도 작은 금액은 크게 이미지를 흐릿하게.
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감사의 글
우리는 칼슘 지표의 대량 로딩을 최적화에 도움이 토론에 대한 올가 Garaschuk을 인정하고 싶습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| Oregon Green BAPTA1-AM | 시약 | Invitrogen | O-6807 | |
| Fluo 4- AM | 시약 | Invitrogen | F-14201 | |
| Sulforhodamine 101 | 시약 | Invitrogen | S-359 | |
| DMSO 내 Pluronic F-127 | 시약 | Invitrogen | P-3000MP | |
| 원심분리 필터 (0.45 micron) | 시약 | EMD Millipore | UFC3 0HV 0S |
참고문헌
- Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1, (2006).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.
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