방법 논문

유전적으로 재프로그래밍된 쥐 흑색종의 FFPE 검체를 분석하기 위한 DNA 바코드 기반 다중 면역형광 이미징

DOI:

10.3791/68124

⸱

2025년 6월 6일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University, 2Translational Tissue Engineering Center, Johns Hopkins University, 3Johns Hopkins Translational ImmunoEngineering Center, Johns Hopkins University, 4Department of Dermatology, Johns Hopkins University, 5Department of Oncology, Johns Hopkins University, 6Department of Pathology, Johns Hopkins University, 7Convergence Institute, Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center Johns Hopkins University School of Medicine, 8Bloomberg Kimmel Institute for Cancer Immunotherapy, Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 9Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 10Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University, 11Departments of Neurosurgery and Ophthalmology, Johns Hopkins University School of Medicine, 12Departments of Materials Science & Engineering and Chemical & Biomolecular Engineering, Johns Hopkins University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 쥐 FFPE 흑색종 조직의 DNA 바코드 기반 이미징을 위한 다중 면역형광 항체 패널을 설계하기 위한 단계별 가이드를 제공합니다. 또한 쥐 흑색종 종양 면역 미세환경에 대한 공간 단백질체학 통찰력을 생성하기 위해 오픈 소스 도구를 사용하는 이미지 분석 파이프라인에 대해 설명합니다.

초록

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여기에 제시된 것은 조직 미세환경의 공간 단백질체학을 분석하는 Co-Detection-by-indEXing을 기반으로 하는 새로운 DNA-바코드 기반 멀티플렉스 이미징 기술입니다. 성공적인 이미징을 위해서는 잘 설계되고 적절하게 검증된 항체 패널의 레퍼토리가 필요하지만, 현재 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 샘플에 대한 항체는 거의 없습니다. FFPE는 갓 동결된 표본에 비해 광범위한 가용성, 취급 및 보관 용이성, 조직 마이크로어레이(TMA)를 만들 수 있는 능력과 같은 몇 가지 이점을 제공합니다. 여기에서는 종양 미세환경 재프로그래밍을 위한 면역학적 신호를 암호화하는 플라스미드 DNA를 전달하는 나노입자로 처리된 쥐 흑색종 모델로부터 FFPE 조직을 시각화하고 분석하기 위한 항체 패널을 개발하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 또한 조직에 주석을 달고, 세포를 분할하고, 단백질체학 데이터를 처리하고, 세포 집단을 표현형화하고, 공간 메트릭을 정량화하기 위한 오픈 소스 컴퓨팅 도구를 사용하는 이미지 분석 파이프라인에 대해서도 설명합니다. 이 프로토콜은 쥐 FFPE에서 항체 패널을 설계하고 복잡한 조직 미세환경의 공간 단백질체학에 대한 새로운 통찰력을 생성하기 위한 응용 프로그램을 제공합니다.

서론

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피부 흑색종은 가장 흔한 피부암으로, 진단 시점과 1차 진료에 따라 전 세계적으로 다양한 질병과 사망률을 보입니다1. 지난 10년 동안 흑색종에 대한 생물학적 이해가 높아짐에 따라 고형 종양을 치료하기 위한 새로운 암 모델 개발이 촉진되었습니다2. 최근 면역요법이 부상하면서 내인성 면역 체계의 활성화에 기초한 암 치료의 혁신적인 개념이 생겨났습니다 3,4.

종양 미세환경(TME)은 매우 복잡하며 다양한 면역세포, 암 관련 섬유아세포, 주피세포, 내피 세포 및 다양한 조직 상주 세포로 구성되어 있습니다5. TME를 연구하기 위해 과거에는 유세포 분석 및 단세포 염기서열분석과 같은 여러 기술이 적용되었는데, 이는 종양 조직을 파괴하는 데 필요하기 때문에 공간적 맥락을 손상시킵니다. 면역형광(IF) 및 면역조직화학(IHC)과 같은 기존 현미경 이미징을 통해 샘플 조직을 파괴하지 않고 단백질 바이오마커를 시각화할 수 있습니다. 그러나 이러한 접근법은 2개 또는....

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프로토콜

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모든 동물 작업은 존스 홉킨스 동물 관리 및 사용 위원회(Johns Hopkins Animal Care and Use Committee)가 정한 지침에 따라 승인된 프로토콜 번호 MO18M388 및 MO21M384를 사용하여 수행되었습니다.

1. 항체 선택

  1. 관심 조직과 특정 바이오마커의 풍부함을 기반으로 항체 패널을 설계합니다. 문헌에서 면역형광(IF) 및 면역조직화학(IHC) 염색의 성공적인 이전 응용 프로그램을 기반으로 항체 클론을 선택하십시오. 이러한 항체의 안전한 무운반 버전.
    참고: 캐리어가 없는 정제된 항체는 바코드 접합에 중요합니다. BSA, 글루텐, 글리세롤 등과 같은 단백질 기반 방부제는 피하십시오. 무운반 항체를 사용할 수 없는 경우, 공급업체에 맞춤형 항체를 요청하거나 BSA 제거 키트를 사용하여 무운반 항체를 만드십시오. 아지드화나트륨은 항체 접합을 방해하지 않습니다. IgG 이소형은 IgM 이소형보다 권장됩니다.
  2. 기존의 면역형광(IF) 이미징11을 사용하여 관심 조직에서 이러한 선택된 클론을 확인합니다. 이중 IF 이미징을 사용하여 특정 클론의....

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결과

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여기에서는 쥐 FFPE 조직에 대한 항체 패널을 설계하고, 다중 면역형광 이미징을 수행하고, 단백질체학 정량화 및 공간 관계를 위한 이미지를 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 검증된 패널에는 흑색종 세포(SOX10), 백혈구(CD45), T 세포(CD3, CD4, CD8, FOXP3), B 세포(CD20), 대식세포 및 아형(F4/80, CD68, CD86, CD163, CD206), 수지상 세포(CD11c), NK 세포(NK1.1) 및 내피 세포(CD31)를 시각화하기 위한 마커를 제공하는 27개의 항체가 포함되어 있습니다. 전체 패널에는 다른 면역 집단(CD11b, CD38), 증식 활성(Ki67), T 세포 기능(T-bet, Eomesodermin, granzyme B), 항원 발현(LMP2, beta-2 microglobulin, MHC II) 및 관문 발현(TIM3, LAG3, PD-L1)에 대한 마커도 포함되어 있습니다12<.......

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토론

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이미징의 성공 여부는 잘 설계되고 검증된 항체 패널에 달려 있습니다. FFPE 샘플의 다중 면역형광 이미징은 높은 자가형광과 파라핀 포매링으로 가려진 에피토프를 회수하는 어려움으로 인해 어려움을 겪습니다. 그러나 FFPE가 FF 표본에 비해 몇 가지 이점을 제공한다는 점을 감안할 때 FFPE 항체 패널을 설계하고 검증하는 것이 필수적입니다. 면역형광(IF) 이미징 중에 양성 신호를 보이는 항체 클론을 마무리하는 것이 첫 번째 단계입니다. 그런 다음 DNA 바코드와 조심스럽게 결합하는 것이 중요합니다. 항체 접합은 SH 결합을 생성하기 위해 항체의 부분적인 감소를 필요로 하며, 이는 바코드를 통한 말레이미드기 반응 중에 사용됩니다. 모든 항체 클론이 이 단계를 견딜 수 있는 것은 아니며, 일부 반응은 항체에 돌이킬 수 없는 손상을 일으켜 성공적인 접합에도 불구하고 이미징 실패를 초래할 수 있습니다. 이러한 이유로, 일부 항체가 기존 IF 검증 중에 긍정적인 신호를 보일 .......

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공개 사항

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J.C.S.는 Emerson Collective LLC와 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 재정적 지원을 인정합니다. J.J.G.는 또한 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 자금 지원도 인정합니다. J.C.S.는 Palleon Pharmaceuticals Inc.와 관계를 맺고 있으며, 여기에는 기금 지원금이 포함됩니다. S.Y.T. 및 J.J.G.는 주식 또는 주식과 관련된 OncoSwitch Therapeutics와 관계를 맺고 있습니다. S.Y.T., J.J.G., J.C.S. 및 K.M.L.은 특허 출원 중입니다. 다른 모든 저자는 이 논문에 제시된 연구에 영향을 미친 것으로 인식될 수 있는 경쟁적인 재정적 이해관계나 개인적 관계를 알려진 바가 없다고 진술합니다.

감사의 글

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J.C.S.는 저자의 경력을 발전시킨 공로로 Dermatology Foundation과 Dermatopathology Career Development Award를 인정합니다. 저자는 컴퓨터 분석 기술에 대한 도움을 준 미국 국립 암 연구소(National Cancer Institute)의 암 데이터 과학 연구소(Cancer Data Science Laboratory)의 Hsin-Pei Lee에게 감사를 표합니다. 이 연구는 Emerson Collective와 National Institutes of Health(R37CA246699, P41EB028239 및 R01CA228133)로부터 자금을 지원받았습니다. 또한 존스 홉킨스 종양학 조직 서비스(OTS) 핵심은 미국 국립보건원(P30CA006973)의 지원을 받습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
16% 파라포름알데히드(PFA)전자현미경 과학PN# 15710조직 염색 과정에서 필요
50kDa MWCO 필터밀리포어UFC50509625kDa 및 100kDa로 인해 고장이 발생합니다.
아코야 바코드와 기자아코야 바이오사이언스다양 한각 바코드는 50ug의 보균자 없는 항체를 접합하는 데 사용할 수 있으며 두 개의 리포터 바이알과 함께 제공됩니다.
항체 접합 키트아코야 바이오사이언스7000009접합 키트는 맞춤형 바코드 접합 항체를 만드는 데 사용됩니다. 각 키트에는 10개의 접합에 충분한 시약이 들어 있습니다. 키트는 4 °에 저장된 하나의 하위 키트 상자로 구성됩니다. C 및 -20°C에 보관된 하나의 하위 키트 상자. 4 ° C 서브킷에는 필터 차단 용액, 환원 용액 2, 접합 용액, 정제 용액 및 항체 저장 용액이 포함됩니다. -20 &g; C 서브킷에는 환원 솔루션 1이 포함되어 있습니다.
베타2MG앱캠 AB214769
CD11bCST #41028
CD11CCST #39143SF
CD163중부 표준시 #68922BF
CD20CST #45839
CD206중부 표준시 #87887
CD3CST #24581
CD31CST #92841
CD38CST #68336BF
CD4앱캠 AB271945
CD45CST #98819
CD68중부 표준시 #29176
CD8인비트로젠 #14-0808-82
CD86중부 표준시 #20018
디메틸 설폭사이드아반토르/VWRBDH1115-4LP
EOMES앱캠 AB222226
Eppendorf PCR 튜브에펜도르프E0030124286필수 매장 5 & 겔 전기영동에 의한 접합 확인을 위한 L 접합 항체
에탄올 200 프루프
F4/80CST # 25514
폭스P3CST #72338
그란-B중부 표준시 #79903SF
가열 오븐
하이브리드화 챔버항체 칵테일로 조직을 염색하는 데 사용됩니다.
과산화수소시그마#216763표백액 제조에 필요
인스턴트 냄비 압력솥 또는 Decloaking Chamber ARC인스턴트 팟 또는 바이오케어 의료
키-67아코야 바이오사이언스
LAG3CST #80282BF
LMP2앱캠 AB243556
메탄올
MHC-IIe바이오사이언스 #14-5321-82
NK1.1중부 표준시 #24395SF
핵 염색아코야 바이오사이언스7000003
PDL1CST #85095
연어 정자 DNA, 전단 (10 mg/mL)인비트로젠AM9680리포터 플레이트 준비 단계에서 분석 시약(Akoya)의 대안으로 사용할 수 있습니다.
SOX-10아브캠  AB245760
PhenoCycler-Fusion용 염색 키트아코야 바이오사이언스7000017PhenoCycler-Fusion 샘플 키트에는 전체 슬라이드 이미징을 위한 플로우 셀과 함께 PhenoCycler 바코드와 접합된 항체를 사용하여 조직 염색에 필요한 완충액 및 시약이 포함되어 있습니다. 각 키트는 10개의 PhenoCycler-Fusion 실험에 충분합니다. 4 °에 저장된 하나의 서브킷으로 구성됩니다. C, -20 °에서 또 다른 온도; C, 실온에 보관된 10개의 플로우 셀 패키지. 서브킷은 4 ° C에는 수화 완충액, 염색 완충액, 저장 완충액, N 차단제 및 J 차단제가 포함되어 있습니다. -20 > C에는 G 차단제, S 차단제 및 고정 시약이 포함되어 있습니다.
티베팅CST #53753
팀-3중부 표준시 #72911
UltraPure DNase/RNase가 없는 증류수인비트로젠10977015항체 접합 중 바코드를 용해하는 데 필요

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schadendorf, D., et al. Melanoma. Lancet. 392 (10151), 971-984 (2018).
  2. Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathol. 31 (2), 214-234 (2018).
  3. Marzagalli, M., Ebelt, N. D., Manuel, E. R. Seminars in cancer b....

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