방법 논문

Real-Time Force Measurement Between Emulsion Droplets During Enzymatic Breakdown

DOI:

10.3791/68182

⸱

2025년 6월 27일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Quantum Precision Measurement, College of Physics, Zhejiang University of Technology, 2College of Optical and Electronic Technology, China Jiliang University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 듀얼 트랩 광학 핀셋을 사용하여 에멀젼의 효소 분해 중에 실시간으로 액적 간 힘을 측정합니다. 이는 에멀젼 안정성과 액적 역학에 대한 연구를 촉진하며, 식품 과학 및 제약 분야의 응용 분야를 지원합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 듀얼 트랩 광학 핀셋을 사용하여 효소 분해 중 에멀젼의 안정성과 에멀젼 방울의 동적 분해를 조사하기 위한 고유한 방법론을 소개합니다. 이 프로세스에는 에멀젼 준비, 효소 도입, 그리고 실시간으로 액적 간 힘을 모니터링하기 위한 힘 측정 시스템 구성이 포함됩니다. 듀얼 트랩 광학 핀셋을 사용함으로써 이 방법은 에멀젼 방울의 정밀한 조작 및 관찰을 가능하게 하여 효소 분해 중 방울 사이의 힘 측정을 용이하게 합니다. 이 실험 기법은 분해 중 에멀젼의 상호 작용 및 안정성에 대한 중요한 통찰력을 제공하며, 특히 식품 과학, 제약 및 유기 에멀젼과 관련된 기타 산업 분야의 연구와 관련이 있습니다. 이 방법은 다양한 광학 핀셋 설정 및 다양한 유형의 에멀젼 또는 효소에 적용 할 수 있으며 다양한 분야에서 기계적 특성 및 분해 과정을 탐색하기위한 다목적 도구 역할을합니다. 또한 이러한 시각적 접근 방식은 힘 역학을 실시간으로 모니터링할 수 있는 이점을 제공하여 다양한 응용 분야에서 에멀젼 거동을 연구할 수 있는 새로운 길을 열어줍니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

에멀젼은 두 개의 혼합되지 않는 액체로 구성된 이종 시스템으로, 한 액체가 다른 액체 내에 방울로 분산되어 있습니다. 이러한 시스템은 식품, 제약1, 화장품 및 석유 화학을 포함한 다양한 산업에서 유비쿼터스합니다. 에멀젼의 안정성과 기능은 액적 간의 상호 작용에 크게 의존하며, 이는 표면 화학, 환경 조건 및 효소의 존재와 같은 다양한 요인의 영향을 받을 수 있습니다2.

많은 응용 분야, 특히 식품 과학 및 약물 전달에서 에멀젼은 효소 환경에 노출됩니다 3,4. 예를 들어, 인간의 소화계에서 섭취된 에멀젼 기반 식품과 약물은 구조와 기능을 변화시킬 수 있는 다양한 효소를 만나게 됩니다. 효소 분해 중 액적 상호 작용의 역학을 이해하는 것은 안정적이고 효과적인 에멀젼 기반 제품을 설계하는 데 중요합니다 5,6.

광 산란 또는 유변학적 측정과 같은 에멀젼 안정성 2,7을 연구하는 전통적인 방법은 귀중한 벌크 정보를 제공하지만 개별 액적8 간의 상호 작용을 직접 관찰하고 정량화할 수는 없습니다. 이러한 한계는 에멀젼의 효소 분해 중에 발생하는 미시적 과정에 대한 이해를 방해했습니다.

광학 핀셋은 미세한 물체를 조작하고 마이크로 및 나노 규모에서 힘을 측정하기 위한 강력한 도구로 부상했습니다9. 빛의 운동량을 활용함으로써 광학 핀셋은 매우 정밀하게 개별 물방울을 포착하고 이동할 수 있습니다. 이 기능은 복잡한 환경에서 액적-액적 상호 작용을 연구할 수 있는 새로운 가능성을 열어줍니다10,11.

이 프로토콜은 이중 광학 핀셋과 실시간 힘 측정을 결합하여 효소 분해 중 에멀젼 방울 간의 상호 작용을 조사하는 고유한 방법을 제공합니다. 대표적인 예로, 유채씨유 또는 유청 단백질에 의해 안정화된 하나의 지방 방울로 구성된 에멀젼 시스템을 사용하여 트립신에 의해 소화되는 방법을 사용하여 시연됩니다. 이 모델 시스템은 일반적인 식품 에멀젼과 소화관에서의 거동을 모방하기 때문에 식품 과학 및 영양과 특히 관련이 있습니다12.

이 접근 방식을 사용하면 효소 분해를 겪을 때 개별 액적 사이의 힘을 직접 관찰하고 정량화할 수 있어 소화 조건에서 에멀젼 안정성의 역학에 대한 전례 없는 통찰력을 제공합니다. 이 방법은 최첨단 듀얼 트랩 광학 핀셋 설정인 광학 핀셋 시스템을 사용하여 에멀젼 액적을 조작하고 높은 정밀도로 액적 간 힘을 측정합니다13.

이 실험 기술은 벌크 에멀젼 연구와 분자 수준 조사 사이의 격차를 해소하여 효소 분해 중 에멀젼의 거동에 대한 독특한 관점을 제공합니다. 이 방법에서 얻은 통찰력은 식품 공학, 제약 제형 및 기초 콜로이드 과학을 포함한 다양한 분야에 광범위한 영향을 미칩니다. 특정 오일-단백질-효소 시스템이 예로 사용되지만, 여기에 제시된 방법론은 다양한 산업 분야에서 광범위한 유기 에멀젼 시스템 및 소화 효소를 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

그림 1 은 듀얼 트랩 광학 핀셋 액적 트래핑의 개략도를 보여줍니다. 이 연구에 사용된 시약과 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 유청 단백질 분산액의 제조

  1. 탈이온수에 5%(w/v) 유청 단백질 분산액을 준비합니다.
    1. 전자 저울을 사용하여 유청 단백질 분말 2.5g의 무게를 정확하게 잰다.
    2. 눈금이 매겨진 실린더를 사용하여 47.5mL의 탈이온수를 측정합니다.
  2. 재료를 결합하십시오.
    1. 계량된 단백질 분말과 측정된 물을 비커에 옮깁니다.
    2. 비커에 마그네틱 교반 막대를 추가합니다.
  3. 비커를 밀봉합니다.
    1. 증발 및 오염을 방지하기 위해 비커를 밀봉 필름으로 덮으십시오.
  4. 분산액을 혼합합니다.
    1. 비커를 자석 교반기에 놓습니다. 단백질 분말이 완전히 용해되고 용액이 고르게 분산될 때까지 교반 속도를 1500rpm(그림 2A)으로 설정합니다.
  5. 단백질에 수분을 공급합니다.
    1. 유청 단백질의 완전한 수화를 보장하고 거품을 최소화하려면 에멀젼 준비 하루 전에 분산을 준비하십시오.
    2. 5% 유청 단백질 분산액을 실온에서 밤새 혼합합니다.
      주의 : 단백질 분산에 영향을 미치지 않도록 모든 유리 제품과 기구에 깨끗하고 오염 물질이 없는지 확인하십시오.
      참고: 하룻밤 수화 단계는 최적의 단백질 기능과 에멀젼 안정성에 매우 중요합니다. 이 단계를 건너뛰면 유화 효율이 떨어질 수 있습니다. 이 프로토콜 섹션에서는 유청 단백질 분산액을 준비하기 위한 초기 단계를 간략하게 설명하며, 이는 후속 에멀젼 준비에서 유채씨유 방울을 안정화하는 데 사용됩니다. 다음 단계에는 일반적으로 수중유 에멀젼 준비, 광학 핀셋 실험 설정, 분해 연구를 위한 트립신 도입이 포함됩니다.

2. 수중유 에멀젼의 제조

  1. 제형을 최적화합니다.
    1. 15% 오일과 85% 단백질 용액을 부피 단위로 혼합하여 단백질 대 지질 질량 비율 0.3을 달성하여 에멀젼을 준비합니다.
  2. 지질 단계를 준비합니다.
    1. 유채씨유는 실온에서 액체입니다. 나중에 사용할 수 있도록 유채씨유 30mL를 원심분리기 튜브에 넣습니다.
    2. 유지방은 실온에서 고체입니다. 유지방을 약 5스쿱 정도 가져다가 원심분리기 튜브에 넣습니다.
    3. 튜브를 비커에 넣고 약 40mL의 탈이온수를 비커에 추가합니다.
    4. 디지털 가열판을 사용하여 비커를 42°C로 가열하고 이 온도를 30분 동안 유지하여 완전히 용융합니다(그림 2B).
      알림: 유지방의 녹는점은 약 30 °C에서 40 °C입니다. 실험실 온도는 26°C로 유지됩니다. 녹은 유지방은 일정 기간 동안 액체로 남아 있을 수 있지만 그대로 두면 실온에서 점차 응고됩니다.
  3. 재료를 결합하십시오.
    1. 5mL 원심분리 튜브에 0.6mL의 오일(유채씨유 또는 녹은 유지방)과 준비된 유청 단백질 용액 3.4mL를 추가합니다.
  4. 에멀젼을 균질화합니다.
    1. 고전단 믹서(HSM)를 사용합니다. 속도를 25,000rpm으로 설정하고 5분 동안 믹싱합니다(그림 2C).
    2. 선택적으로, 굵은 에멀젼을 고압 균질화기를 통해 통과시킵니다. 일반적인 조건: 500-1000bar 압력에서 2-3회 통과.
  5. 에멀젼을 희석하십시오.
    1. 에멀젼을 1:1000 희석액으로 준비합니다. 피펫을 사용하여 원래 에멀젼의 4 μL를 측정합니다. 이것을 3996μL의 탈이온수에 첨가하십시오. 균일한 희석을 위해 철저히 혼합하십시오.

3. 광학 핀셋의 초기 설정

  1. 미세유체 플로우 셀(microfluidic flow cells)을 준비하고 세척합니다( 재료 표 참조).
    알림: 이 장치에는 6개의 미세유체 채널이 장착되어 있습니다. 이 실험은 단일 채널을 사용하며 그림 3B 의 가장 왼쪽 채널만 사용됩니다.
    1. 미세유체 채널을 준비하려면 필요한 모든 장비와 흐름 채널을 청소하십시오. 잔류물이 남지 않도록 모든 장비를 탈이온수로 철저히 헹굽니다.
    2. 청소하려면 필요한 채널을 에탄올로 세척하십시오. 유속을 1.0bar로 설정하고 에탄올로 플러시합니다. 실험 1시간 전에 소 혈청 알부민(BSA)을 플로우 셀(flow cell)에 플러시합니다. BSA는 에멀젼 방울 또는 기타 생체 분자의 비특이적 흡착을 줄이기 위해 표면에 "차단" 층을 형성합니다.
  2. 준비된 에멀젼을 실험 채널로 흘립니다.
  3. 실험 전에 기기를 준비합니다.
    1. 광학 핀셋 기기를 엽니다.
    2. 약 70μL의 탈이온수를 하부 대물렌즈에 추가합니다.
    3. "딸깍" 소리가 들릴 때까지 샘플 챔버를 삽입합니다.
    4. 샘플 챔버 위에 이멀젼 오일 한 방울을 떨어뜨립니다(그림 3C).
    5. 시료 챔버의 상단 표면에 가볍게 닿을 때까지 콘덴서 렌즈를 부드럽게 내립니다.
    6. 레이저를 켜기 전에 광학 핀셋 기기를 닫으십시오. 레이저는 1064nm에서 작동합니다.
  4. Z-평면을 찾아 광학 경로를 조정합니다.
    1. 레이저를 켜고 전원을 100%로 설정합니다.
    2. 광학 핀셋 시스템의 하단 손잡이(그림 3A)를 조정하여 레이저 스폿을 찾습니다. 아래에서 위로 이동(시계 방향 조정)하여 레이저 스폿을 세 번 관찰합니다. 레이저 스폿의 두 번째와 세 번째 세트 사이에 Z-plane을 설정합니다.
      참고: 세 세트의 레이저 스폿은 레이저가 플로우 셀의 아래쪽 표면, 아래쪽 커버슬립의 위쪽 표면 및 위쪽 유리 슬라이드의 아래쪽 표면에 초점을 맞출 때 나타납니다. 레이저는 커버슬립의 상부 표면과 유리 슬라이드의 하부 표면 사이에 집중되어야 합니다.
    3. 레이저 출력을 30%로 줄입니다.
    4. 7-11개의 간섭 무늬가 화면에 나타나는지 확인합니다(그림 3E). 숫자가 너무 높거나 낮으면 하단 손잡이를 조정하십시오.
      참고: interference fringes의 수는 condenser와 flow cell 사이의 간격 최적화를 반영합니다. 7 - 11 fringe 범위 내에서 콘덴서는 기계적 응답과 같은 측정된 신호에 대해 우수한 신호 대 잡음비를 보장하기에 충분한 빛을 효과적으로 포착합니다. 또한 이 간격은 렌즈가 flow cell과 접촉하는 것을 방지하고 광학 경로 산란 또는 반사 간섭을 줄이기 위해 안전한 거리를 유지합니다.
  5. 흐름 채널을 조정합니다. 불필요한 채널을 닫고 필요한 실험 채널만 열려 있는지 확인합니다.
  6. 레이저 출력을 설정합니다. 일반적으로 레이저를 100%로 설정하여 액적을 포착하되 특정 실험 조건에 필요한 강도로 조정합니다.
  7. 데이터 저장소를 설정합니다. 실험 데이터를 즉시 수집할 수 있도록 파일 저장 디렉토리를 구성합니다.

4. 에멀젼에 대한 힘-거리 곡선 측정

  1. 유속을 0.5bar로 설정합니다. 물방울은 약 5초 동안 화면에 표시되어야 합니다. 그런 다음 진공 을 선택하여 흐름을 중지하고 채널 밸브를 닫습니다.
  2. 물방울을 포착합니다.
    1. 조이스틱을 사용하여 채널 내에서 비슷한 크기의 두 방울을 캡처합니다. 성공적으로 포집된 액적의 개략도는 그림 4에 나와 있습니다.
    2. 두 방울 사이의 거리를 약 10μm로 조정합니다. 밧줄이 형성되면 눈에 띄는 힘의 변화가 관찰됩니다.
    3. 오른쪽 옵티컬 트랩의 x 및 y 위치와 왼쪽 옵티컬 트랩의 y 위치를 고정합니다. 두 방울을 각각 자홍색과 녹색 상자로 표시합니다.
  3. 파워 스펙트럼 밀도(PSD)를 측정합니다.
    1. Calibration(보정) 메뉴로 이동합니다.
    2. 왼쪽 화면에서 측정을 선택합니다. 소음 수준이 과도하면 만족스러운 결과를 얻을 때까지 측정을 반복하십시오.
    3. 적용을 선택하여 보정을 확인합니다.
  4. 원본 데이터를 지우고 힘-거리를 측정합니다.
    1. 이 단계에서 조이스틱은 왼쪽 광학 트랩만 제어해야 합니다. 거리가 0이 될 때까지 일정한 속도(1.0μm/s)로 왼쪽 트랩을 오른쪽 방울 쪽으로 천천히 이동합니다. 이 절차를 통해 필요한 힘-거리 곡선을 얻을 수 있습니다.
  5. 데이터를 선택하고 저장합니다.
    1. 마우스 왼쪽 버튼을 사용하여 10μm 액적 분리에서 0μm까지 관심 있는 데이터 간격을 선택합니다. 0μm 거리에서 측정된 힘은 일반적으로 최대값에 도달합니다.
  6. 선택한 데이터를 저장합니다.
    1. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 선택한 데이터 세그먼트를 초기 폴더 디렉토리에 저장합니다 .

5. Tris 완충 용액 및 트립신 용액의 제조

  1. 11.860g/L Tris 염기, 0.735g/L 염화칼슘 이수화물(CaCl2·2H2O) 및 8.766g/L 염화나트륨(NaCl) 구성으로 Tris 완충 용액을 준비합니다. 최종 부피를 100mL로 조정합니다. 염산(HCl)을 사용하여 초기에 pH를 약 8.4로 조정하고 pH 테스트 스트립을 사용하여 최종 pH를 확인합니다.
  2. Tris 완충액 1000mL에 Trypsin 1:250(돼지 췌장에서 유래) 100mg을 용해하여 트립신 용액을 준비합니다. 자석 교반기로 혼합물을 4°C 및 500rpm에서 15분 동안 저어줍니다. 그 후, 용액을 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다.

6. 트립신 작용 및 동적 검출 체계

  1. 에멀젼에 트립신 용액을 첨가합니다.
    1. 0.5 μL - 10 μL 범위의 피펫을 사용하여 트립신 용액 4 μL를 추출하고 준비된 4 mL 에멀젼에 조심스럽게 첨가합니다.
  2. 실시간 동적 모니터링을 수행합니다.
    1. 트립신 용액을 첨가한 후 광학 핀셋 기술을 사용하여 에멀젼을 동적으로 모니터링합니다. 측정은 10분마다 수행되며, 첫 번째 측정은 트립신 용액을 첨가한 후 10분 후에 수행됩니다.

7. 데이터 처리

  1. .h5 형식의 실험 데이터를 얻고 데이터 처리 환경을 사용하여 필요한 형식 변환을 수행하여 표 형식의 데이터 파일을 생성합니다. 변환된 파일은 각각 Force 및 Distance 데이터를 기록하는 두 섹션으로 구성됩니다.
  2. 곡선 피팅 기법을 사용하여 이 두 섹션의 데이터를 피팅하고, 추가 분석을 위해 결과로 생성된 피팅 곡선을 시각적으로 플롯합니다.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구에서는 유채씨유와 유청단백질, 유지방과 유청단백질을 함유한 에멀젼을 광학 핀셋을 이용하여 분석하였다. 먼저, 기준선 데이터를 설정하기 위해 두 에멀젼 사이의 힘-거리 관계를 측정했습니다(그림 5A-F). 그런 다음 각 에멀젼에 트립신을 첨가하고 힘-거리 관계를 10분마다 다시 측정했습니다.

그림 5는 트립신이 없는 두 에멀젼 방울의 힘-거리(FD) 곡선을 보여줍니다. 액적 사이의 거리가 줄어들면 상호 작용하는 힘이 비선형적으로 증가하여 액적이 접촉할 때 피크를 생성합니다. 트립신을 첨가하지 않으면 피크 힘은 액적 직경과 밀접한 관련이 있습니다. 더 큰 액적은 더 높은 상호 작용력을 나타냅니다. 예를 들어, 그림 5C 의 액적은 직경이 약 8μm이고 상호 ...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 방법론의 핵심 혁신은 이중 광학 트랩과 실시간 기계 모니터링 기술(그림 3A)의 동기화된 작동에 있으며, 이를 통해 단일 액적 수준에서 고정밀 동적 분석이 가능합니다. 이중 광학 핀셋을 사용하여 두 개의 액적을 독립적으로 포집하고 초기 10μm 거리로 분리를 정밀하게 조절함으로써(단계 4.2.2 참조) 이 방법은 단일 액적을 조작하는 기존의 한계를 극복합니다. 그림 1 은 액적을 포집하고 조작하는 데 사용되는 이중 광학 핀셋의 원리를 보여줍니다. 효소 분해 중 10분 간격으로 획득한 실시간 FD 곡선 측정(단계 6.2.1 참조)은 계면 역학의 동적 진화를 보여주며(그림 6 및 그림 7) 기존 종말점 분석에서는 액세스할 수 없는 과도 반응 역학을 포착합니다...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 중국 국가 핵심 연구 개발 프로젝트(보조금 번호 2023YFF0613603)와 중국 국립 자연 과학 재단(보조금 번호 22202167)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Bluelake 소프트웨어LUMICKS, 네덜란드광학 핀셋 제어 소프트웨어
CaCl2.H4O2
Dome LED 디지털 가열판 교반기SCILOGEXSCI280-Pro 
전자 저울Shanghai Hengping Instrument Co., LTDFA1204
HCl
고속 균질화기Ningbo Kemai Instrument Co., LTDKM-S10
침지 오일
광유도 와류 혼합 장치Shanghai HUXI Industrial Co., LTDVortex-5S
마이크로소프트 오피스 엑셀마이크로소프트
유지방SM MlekovitaMaslo Klarowane
NaCl
광학 핀셋 플랫폼LUMICKS,네덜란드m-trap
Origin 소프트웨어Origin Lab2024힘 및 거리 피팅 곡선을 그리려면
피펫 건Eppendorf10 μ L, 100 & 엘, 1000 & L
유채씨유 번지 폴란드 Sp.z o.o. Kujawski
밀봉 필름파라필름4IN*125FT
트리스
트립신Sangon BiotechA100458-0010트립신 1:250, 돼지 췌장
청 단백질 농축액 에서 추출;SM MlekovitaWPC
유

참고문헌

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