이 프로토콜은 주사 후 4일 후에 발생하는 환자 유래 B- 및 T- 급성 림프구성 백혈병(ALL) 세포의 난자 이종이식을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 연구는 B 세포 및 T 세포 계통을 모두 포괄하는 환자 유래 급성 림프구성 백혈병(ALL) 세포의 난자 이 종이식을 위한 신속하고 비용 효율적이며 효율적인 방법을 소개합니다. 수정된 닭 배아를 사용하여 수정 후 11일(11dpf)에 환자 유래 B-ALL 및 T-ALL 세포를 배아의 맥관 구조에 주입했습니다. 놀랍게도, 주사 4일 후, 생착된 인간 백혈병 세포는 발달 중인 닭 배아 내에서 상당한 생존, 증식 및 혈관 집락화를 보였습니다. 15dpf까지 배아 맥관 구조의 혈액 샘플에서 CD10/CD19+ B-ALL 및 CD4/CD8+ T-ALL 세포의 눈에 띄는 증가를 감지하여 성공적인 생착을 확인했습니다. 이 시스템은 다른 동물 모델과 관련된 상당한 비용과 윤리적 제약 없이 살아있는 유기체에서 백혈병 세포 행동을 효율적이고 재현 가능한 평가를 용이하게 합니다. 이러한 신속한 접근 방식은 잠재적인 치료 화합물을 평가하기 위한 높은 처리량 및 생물학적으로 관련된 생 체 내 플랫폼을 제공합니다. 여기에 제시된 난 자 내 환자 유래 이종이식(PDX)-ALL 시스템은 전임상 약물 스크리닝, 기계론적 연구 및 잠재적으로 백혈병 연구에서 맞춤형 의학 접근법을 위한 유망한 도구를 제공합니다.
서론
병아리 융모막(CAM)은 배양 후 수정 후 7일째에 형태를 갖추기 시작하여 12일째에 완성됩니다. CAM은 혈관신생1 및 암세포 2,3,4,5,6,7,8,9,10, 특히 혈액 관련 암세포11 생착에 적합한 생체 내 모델로서 각광을 받고 있습니다, 본질적으로 면역결핍이고 혈관 형성이 잘 발달되어 있기 때문입니다. 또한, CAM은 콜라겐, 인테그린 αVβ3, 피브로넥틴, 라미닌 및 매트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2)10을 포함한 다수의 세포외 기질 단백질을 운반하기 때문에 종양 침범 및 전이를 조사하는 데 바람직한 시스템이기도 합니다.
급성 림프구성 백혈병(ALL)은 미성숙 B 림프구와 T림프구의 급격한 증가를 특징으로 하는 골수 및 혈액암입니다. 가장 널리 퍼진 소아암이자 어린이 암 사망의 주요 원인입니다. ALL은 영향을 받은 소아의 >85%에서 완치가 가능하지만 성인과 유아의 완치율이 상당히 낮고 재발성/불응성 ALL의 5년 생존율은 <10%입니다12. 따라서 재발성 또는 불응성 ALL을 예방하거나 중단하기 위한 새로운 치료 전략 개발이 시급히 필요합니다. 마우스 및 쥐13과 같은 많은 이종이식 모델이 개발되었지만 이러한 방법은 시간이 많이 걸리고(예: 수개월) 비용이 많이 들며 포괄적인 윤리 규정이 필요합니다. 새로운 ALL 치료법에 대한 충족되지 않은 임상적 요구를 해결하려면 기본적인 체외 작업을 확장하는 데 적합한 재현 가능하고 시간 및 비용 효율적인 동물 모델을 개발하는 것이 필수적입니다.
이 연구에서 우리는 환자 B- 및 T-ALL 세포의 3D 혈관 집락화를 안정적으로 생성하는 난 자 내 이종이식 프로토콜의 성공적인 확립을 보고하며, 이는 ALL 진행을 멈출 수 있는 새로운 치료법의 설계 및 ALL 치료 결과 및 위험에 대한 예측 도구 개발에 잠재적으로 사용됩니다.
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프로토콜
실험은 캘거리 대학의 윤리 위원회(REB15-1143; 모든 피험자로부터 정보에 입각한 동의를 얻은 경우)와 앨버타 암 위원회의 건강 연구 윤리 위원회(HREBA. CC-17-0108_REN8)를 참조하십시오. 진단 당시(치료 시작 전) 순환 모세포(골수뿐만 아니라 혈액에도 모세포)가 있는 ALL 환자가 연구에 포함되었습니다. 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.
1. 계란 부화
- 수정란을 조달하십시오. 배송 또는 균열 과정에서 손상된 계란의 수를 고려하기 위해 필요한 것보다 ~10% 더 많은 계란을 얻으십시오.
- 수정란은 생존력을 잃지 않고 12°C에서 최대 2주 동안 보관하십시오.
- 계란을 39°C에서 가습된(~50%-60%) 롤링 인큐베이터로 옮깁니다.
- 인큐베이터에서 10dpf의 알을 부화시킵니다. 1일차는 알이 인큐베이터로 옮겨질 때 시작됩니다.
2. ALL 환자의 혈액 샘플에서 급성 림프구성 백혈병 세포의 분리
- 앞서 설명한 대로 세포를 분리한다 14,15.
- B- 및 T-ALL 환자의 말초 혈액(또는 골수) 10mL를 헤파린 처리 시험관에 채취합니다.
- 혈액 샘플을 멸균 50mL 원심분리 튜브로 옮기고 137mM의 NaCl, 2.7mM의 KCl, 10mM의 Na2HPO4 및 1.8mM의 KH2PO4를 포함하는 2부피의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 세 번 희석합니다.
- 희석된 혈액 샘플 1부피를 밀도 구배 배지 1부피에 오버레이하고 브레이크 없이 실온에서 300 x g 에서 30분 동안 원심분리합니다.
- 인터페이스에서 단핵 세포(MNC)의 버피 코트 층을 수집하고 멸균 피펫을 사용하여 새로운 멸균 15mL 튜브로 옮깁니다.
- 1x PBS 10mL를 첨가하고 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 남아 있는 혈청 성분을 제거합니다(이 단계를 두 번 반복).
- 세포 펠릿에 0.8%NH4Cl 2mL를 첨가하고 부드럽게 소용돌이치고 실온에서 5분 동안 배양한 다음 300 x g 에서 5분 동안 회전시켜 적혈구를 용해시킵니다(필요한 경우 이 단계를 반복합니다).
- 2.6단계에서 설명한 대로 1x PBS에서 세포를 세척합니다.
- 10% FBS를 함유한 RPMI 1640에 세포를 재현탁하고 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
- Trypan Blue Exclusion 분석을 사용하여 세포 생존력을 평가합니다.
- 세포를 동결 배지(FBS에서 10% DMSO)에 재현탁하고 -80°C에서 동결한 후 액체 질소에 보관합니다.
3. mCherry를 운반하는 2세대 복제 무능력 렌티바이러스의 증폭
- 인간 배아 신장 세포HEK293T를 ~60%-70% 합류로 인간 배아 신장 세포를 37°C에서 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM을 포함하는 6웰 플레이트에 5%CO2가 함유된 가습 인큐베이터에 시드합니다.
- Lipofectamine 3000을 사용하여 FUW-Luc-mCherry-puro 전이, pCMVΔr8.91 패키징 및 pVSV-G 외피 벡터를 3:2:1의 비율로 세포(1.5 x 106)를 2일 동안 공형감염시켰습니다.
- 렌티바이러스 함유 상청액을 수확하고 0.45μm 필터를 통해 여과합니다.
- 제거된 바이러스 상청액을 원심분리기 튜브로 옮기고, 4°C에서 2시간 동안 20,000 x g 으로 원심분리하고, 상청액을 버리고, 펠릿을 100μL의 PBS 또는 무혈청 배지에 재현탁합니다.
- qPCR 렌티바이러스 역가 키트를 사용하여 감염 다중도(MOI)를 측정합니다.
4. mCherry를 사용한 지속적으로 성장하는 ALL 세포주 및 환자 유래 ALL 세포의 라벨링
- 플레이트1 x 10 RPMI 1640 + 10% FBS를 포함하는 6웰 플레이트의 B-(SEM) 및 T-ALL(MOLT3)16,17 세포주 및 환자 유래 B-또는 T-ALL 세포의 6개 세포/mL.
- 3.47 x 106 IU/mL의 바이러스 역가로 300 μL의 렌티바이러스 제제로 세포를 감염시켜 1 x 106 세포에 대해 1의 MOI를 얻고, 부드럽게 혼합한 다음 37°C에서 5% CO2 와 함께 2일 동안 배양합니다.
- 배양 배지에 1μg/mL 퓨로마이신을 첨가하여 2일 동안 안정적으로 형질도입된 세포를 선택합니다.
- 형광 현미경으로 mCherry 표지 세포를 시각화합니다.
5. 난자 제노 접목
- 10일째(위의 난자 부화 섹션 참조)에 빛 아래에서 병아리 배아의 맥관 구조를 검사하여 배아 생존력을 평가합니다. 그런 다음 계란을 70% 에탄올로 부드럽게 씻어 표면을 살균합니다.
- 달걀의 공기 셀에 구멍을 뚫어 핸드 드릴을 사용하여 작은(직경 ~2.0cm) 창을 만듭니다.
- 투명 접착 테이프로 밀봉하고 5% CO2 인큐베이터로 되돌립니다.
- 11일째에 34G 바늘을 사용하여 1 x 107mCherry 표지 ALL 세포를 발달 중인 배아의 혈관에 주입합니다. 동일한 위치에서 창을 여는 것이 보장되지 않기 때문에 모든 세포가 서로 다른 배아의 동일한 위치에 주입되었는지 여부를 확인하는 것이 어려운 것으로 판명되었습니다.
- 투명 접착 테이프로 창을 밀봉하고 5% CO2 인큐베이터로 돌아가 매일 배아 생존력을 모니터링합니다.
- 15일째에 배아에서 혈관을 해부하여 슬라이드 유리 위에 놓고 형광 기능이 장착된 해부 현미경을 사용하여 성공적인 이종이식편을 촬영합니다.
참고: 15dpf(깃털이 몸 전체를 덮고 알부민이 거의 사라짐에 따라) 병아리 배아 맥관 구조에서 ALL 세포의 증식 및 집락화의 변화를 평가하기 위해 면역조직화학을 수행해야 합니다.
6. 유세포 분석
- 15일째에 32G 바늘이 있는 멸균 주사기를 사용하여 닭 배아 맥관 구조에서 혈액을 채취하여 헤파린이 들어 있는 1.5mL 멸균 튜브로 옮기고 4°C에서 10분 동안 226 x g 으로 원심분리합니다.
- 상청액(혈장)을 제거하고 세포 펠릿을 1% BSA(소 혈청 알부민)를 함유한 1x PBS에 재현탁합니다.
- 2.7단계와 2.8단계를 수행하여 적혈구를 용해한다.
- B-ALL 세포를 인간 FITC-CD10 및 인간 PE-CD19 항체로, T-ALL 세포를 각각 인간 FITC-CD4 및 인간 PE-CD8 항체로 표지하여 4°C에서 어두운 곳에서 30분 동안 표지합니다.
- 표지된 세포를 1% BSA를 함유한 PBS로 2회 세척하고, 4°C에서 5분 동안 226 x g 으로 원심분리하고, 1x PBS에 재현탁하고, 유세포 분석으로 분석한다.
- 순방향 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC) 전압을 각각 400V 및 360V로 설정합니다. FITC 및 PE 채널의 검출기 이득을 각각 450-500V 및 400-450V로 조정합니다.
참고: 게이팅 전략: (a) 광산란 게이팅(FSC 대 SSC): FSC-A 대 SSC-A는 림프모세포 영역에 해당하는 중간 전방 산란(크기) 및 낮은 측면 산란(입도)을 갖는 집단을 식별합니다. 이 단계는 단핵구 또는 과립구와 같은 파편과 더 입립적인 세포를 배제하는 데 도움이 됩니다. (b) 일중항 선택(FSC-H 대 FSC-A): FSC-H 대 FSC-A, 단일 세포 이벤트만 분석되도록 보장18. - 사분면 2(Q2; FITC/PE+) 대 PE 플롯18. 현재는 3개의 독립적인 실험(n = 3)의 SEM± 의미합니다.
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결과
발달 중인 닭 배아에서 인간 ALL 세포의 생착이 성공적인지 여부를 결정하기 위해 mCherry를 운반하는 2세대 복제 무능력 렌티바이러스를 증폭하고 이를 사용하여 각각 B- 및 T-ALL 세포주, SEM 및 MOLT316,17을 표지했습니다. 그림 1A에서 볼 수 있듯이, B-(왼쪽 상단 2개 패널) 및 T-(오른쪽 상단 2개 패널) ALL 세포의 ~50%를 mCherry로 표지했습니다. 그 후, 환자 유래 B-(#1 및 #2) 및 T-(#3 및 #4) ALL 세포도 mCherry로 표지되었습니다(그림 1A, 왼쪽 및 오른쪽 하단 각각 4개의 패널). mCherry 표지 ALL 세포를 농축하기 위해 퓨로마이신으로 처리된 세포를 사용하여 인간 ALL 세포의 난자 이종 이식을 수행했으며...
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토론
미생물 오염을 방지하고 닭 배아의 생존을 극대화하기 위해 난자 내 이종 이식 중 세 가지 중요한 단계가 확인되었습니다: 즉, (1) 창을 만들기 전에 달걀 껍질 표면을 70% 에탄올로 멸균하고 (2) 배양 중 닭 배아의 함량이 증발하는 것을 방지하기 위해 셀로테이프로 달걀 껍질 창을 단단히 밀봉합니다. (3) 적절한 혈관 전달을 보장하고 기계적 파괴를 최소화하기 위해 가는 바늘(예: 34G)을 사용하고 최소 부피(예: 100μL)로 ALL 세포를 주입합니다. 우리의 문제 해결 분석 결과 100mL 부피의 1 x 107 mCherry 표지 ALL 세포가 강력한 혈관 집락화에 가장 효과적인 용량인 것으로 나타났습니다.
이종 이식 중에 직면한 한 가지 과제는 ALL 세포의 일관된 해부학적 부위 주사를 달성하는 것이었습니다. 그러나 영상 분석을 용이하게 하기 위해 배아의 혈관을 해부해야 하...
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
FUW-Luc-mCherry-puro를 제공해 주신 컬럼비아 대학의 Andrew Kung 박사에게 감사드립니다. 이 작업은 CIHR(PJT-174983)에서 KYL에 대한 보조금과 한국연구재단(NRF; RS-2023-00284121)을 KYL 및 M-YJ로 전송합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 34 G 바늘 | BD 페리세이프 | ||
| Attune NxT 유세포 분석기 | 써모 피셔 | ||
| BD Perisafe 주사기 (32 g) | BD 페리세이프 | ||
| 소 혈청 알부민(BSA) | 밀리포어 시그마 | A9647 | |
| 세포 동결 배지 | Gibco, 써모피셔 사이언티픽 | 12648010 | |
| 원심분리기(Allegra X-22R 원심분리기) | 베크만 쿨터 | ||
| 일회용 장갑 | Royal Touch300 니트릴 시험용 장갑 | ||
| 해부 현미경 | 라이카 MZ16FA | ||
| DMEM | Gibco, 써모피셔 사이언티픽 | 11965092 | |
| DMSO | Invitrogen, 써모피셔 사이언티픽 | 디12345 | |
| 계란 인큐베이터, Vevitts 120 롤링 인큐베이터 | 빅세스트 트레이딩 주식회사 | ||
| 에틸 알코올 (95 %) | VWR 인터내셔널 | BDH1158-4LP | |
| 태아 소 혈청(FBS) | Gibco, 써모피셔 사이언티픽 | 26140079 | |
| Ficoll 솔루션(Ficoll?? 파케 플러스) | 밀리포어시그마 | GE17-1440-02 | |
| FITC-CD10 항체 | 산타크루즈 바이오텍 | sc-46656 피트 | |
| FITC-CD4 항체 | 산타크루즈 바이오텍 | SC-19641 피트 | |
| 형광 현미경 | 라이카 마이크로시스템즈 | ||
| 핸드 드릴(Dremel3000) | 보쉬 | ||
| HEK293T | ATCC, 버지니아, 미국 | CRL-3216 | |
| 혈구계 | VWR 인터내셔널, Hausser Scientific | 15170-263 | |
| 돼지 장 점막에서 추출한 헤파린 나트륨염 | 밀리포어 시그마 | H3149 | |
| 헤파린 화 시험관 | BD 진공 테이너 | BD 366480 | |
| 리포펙타민 3000 | Invitrogen, 써모피셔 사이언티픽 | L3000008 | |
| Multiplex Lentivirus Titer Kit (qPCR 렌티바이러스 역가 키트) | ABM | LV900 | |
| NH4Cl(암모늄 chloride_ | 밀리포어 시그마 | A9434 | |
| Olympus IX71 도립 현미경 | 올림푸스 | ||
| PE-CD19 항체 | 산타크루즈 바이오텍 | sc-19650 PE | |
| PE-CD8 항체 | 산타크루즈 바이오텍 | sc-1177 PE | |
| 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL) | Gibco, 써모피셔 사이언티픽 | 15140122 | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | 시그마 | P3813 | |
| 피펫(용량 조절 가능) | 에펜도르프 | ||
| 퓨로마이신 | Gibco, 써모피셔 사이언티픽 | A1113803 | |
| RPMI 1640 | Gibco, 써모피셔 사이언티픽 | 11875093 | |
| 스카치 셀로테이프 | 3분 | ||
| 멸균 6웰 플레이트 | VWR 인터내셔널, 코닝 | 22250-140 | |
| 멸균 원심분리기 튜브 | Axygen Inc, 코닝 | AXYMCT-150-CS | |
| 멸균 배양 플라스크(75T) | VWR 인터내셔널 | 10062-872 | |
| 멸균 Falcon 튜브(15mL) | 사르슈테트 | 62.554.502 | |
| 멸균 Falcon 튜브(50mL) | 사르슈테트 | 62.547.254 | |
| 멸균 필터(0.45 & micro; m 필터) | VWR 인터내셔널 | 76778-974 | |
| 멸균 겸자 | VWR 인터내셔널 | 82027-404 | |
| 멸균 유리 슬라이드 | VWR 인터내셔널 | 48300-031 | |
| 멸균 피펫 팁 | VWR 인터내셔널 | 76322-136, 76322-134, 76322-154 | |
| 멸균 주사기 | BD 주사기 | 309628? | |
| 트리판 블루 | Invitrogen, 써모피셔 사이언티픽 | 티10282 |
참고문헌
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