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연구 논문

Hydroxysafflor Yellow A는 TLR4/NF-ĸB 신호 경로를 조절하여 제브라피쉬의 도파민 뉴런에서 LPS 유도 독성을 약화시킵니다.

620 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68314

⸱

2025년 7월 18일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Mitochondria and Healthy Aging, College of Life Science, Yantai University, 2Research Institute of Life Sciences, Yinfeng Biological Group Co., Ltd.

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 HSYA(hydroxysafflor yellow A)가 제브라피시에서 LPS 유발 신경독성을 약화시키는지 여부를 테스트하는 것을 목표로 합니다. 운동 기능은 시각 시스템을 사용하여 평가되었습니다. 도파민성 신경 손상은 면역조직화학(immunohistochemistry)에 의해 검사되었다. TLR4/NF-κB 경로에 관여하는 분자는 웨스턴 블롯을 사용하여 분석했습니다.

초록

지질다당류(LPS)에 의한 염증은 파킨슨병(PD)을 포함한 신경퇴행성 질환을 유발하고 영속화하는 데 중요한 역할을 합니다. Hydroxysafflor 황색 A (HSYA)는 Carthamus tinctorius L.의 주요 콤포넌트입니다. 이 연구는 HSYA가 제브라피쉬의 도파민 뉴런에서 LPS 유발 독성을 개선할 수 있는지 여부를 관찰하는 것을 목표로 합니다. 제브라피쉬는 LPS에 노출된 후 HSYA로 처리되었습니다. 제브라피쉬의 운동 기능을 평가하기 위해 행동 테스트가 수행되었습니다. 도파민성 신경 세포 손상과 도파민 수치를 검사했습니다. TLR4, NF-κB, IL-1β 및 TNF-α도 측정했습니다. LPS(60μg/mL, 최종 농도)가 제브라피쉬에 독성을 유발하고 운동 기능 장애와 티로신 하이드록실라제(TH) 양성 뉴런 손상을 유발하는 것으로 입증되었습니다. LPS 노출은 도파민 함량을 감소시켰을 뿐만 아니라 IL-1β, TNF-α, TLR4 및 NF-κB 발현을 증가시켰습니다. HSYA는 LPS로 인한 운동 기능 장애를 개선했습니다. 또한, HSYA는 TH 양성 뉴런의 손실을 약화시켰으며, 이는 도파민 함량의 증가를 동반했습니다. HSYA 치료는 또한 TLR4, NF-κB의 발현과 IL-1β, TNF-α의 생성을 억제했습니다. 결론적으로, 본 연구는 HSYA가 파킨슨병의 염증성 손상 예방을 위한 실험적 근거를 제공하는 TLR4/NF-κB 경로를 조절함으로써 제브라피쉬의 도파민 뉴런에서 염증으로 인한 손상을 약화시킨다는 것을 입증했다.

서론

파킨슨병(PD)의 발병 기전은 뇌의 도파민성 뉴런 손상으로 인한 운동 활동의 저하입니다. 파킨슨병의 증상으로는 안정시 떨림, 서동증, 자세 불안정, 근육 긴장도 등의 운동 기능 장애가 있습니다. 염증은 PD의 두드러진 병리학적 특징이다. PD 환자의 뇌척수액 및 사후 흑질선조체 뇌 영역의 사이토카인 수치는 연령에 맞는 건강한 대조군에 비해 높았다1. 도파민성 신경 손상이 염증에 의해 유발되는 메커니즘은 잘 확립되어 있습니다. PD에서 중뇌 도파민 뉴런은 종양괴사인자(TNF)-ɑ2와 같은 사이토카인에 민감합니다. 지질다당류(LPS)는 박테리아의 구성 요소입니다. LPS는 톨 유사 수용체 4(TLR-4)의 리간드로 확인됩니다. TLR-4에 결합하면 LPS는 염증 반응을 일으키고 조직에 독성을 나타냅니다. TLR-4는 중추신경계의 미세아교세포에 있습니다. LPS는 TLR-4를 활성화하여 TNF-α와 IL-1β를 생성합니다. LPS에 대한 중추 또는 말초 노출은 중추 신경계에 독성을 유발합니다. LPS에 의한 독성이 PD 3,4,5를 포함한 신경퇴행성 질환을 유발하고 영속시키는 역할을 한다는 것을 입증하는 증거가 있습니다.

최근에는 제브라피시가 신경계 질환 연구의 모델로 널리 사용되고 있습니다. 제브라피시와 인간은 80%의 유전적 상동성을 가지고 있습니다. 그리고 제브라피쉬는 인간과 거의 같은 수의 염색체를 가지고 있습니다. 더욱이, 제브라피쉬의 뇌의 주요 구조와 신호 전달 경로는 포유류와 유사합니다. 제브라피시는 또한 많은 수의 투명한 배아를 생산할 수 있고, 빠르게 발달하며, 유전자 조작에 취약합니다6. 이러한 장점으로 인해 제브라피시는 PD의 발병 기전을 조사하고 PD에서 고처리량 약물 스크리닝을 개발하기 위한 훌륭한 모델입니다.

Hydroxysafflor yellow A (HSYA)는 Carthamus tinctorius L의 주성분입니다. 이전 연구에서는 HSYA가 항염증 특성을 가지고 있음을 보여주었습니다. 1차 중뇌 배양에서 20 μM - 640 μM의 HSYA는 어떠한 독성도 나타내지 않았습니다. 그리고 40μM에서 640μM 범위의 HSYA 농도는 LPS 유도 도파민성 신경 세포 손상을 감소시켰습니다7. C57BL/6J 마우스는 PD 모델을 유도하기 위해 6-하이드록시도파민에 노출되었습니다. HSYA는 손상된 신경 기능을 약화시킬 뿐만 아니라 뇌의 도파민 뉴런을 보호합니다. 또한, HSYA는 흑질(substantia nigra)8에서 cyclooxygenase-2, inducible nitric oxide synthase 및 NF-κB의 발현을 감소시켰습니다.

현재까지 HSYA가 in vivo에서 LPS의 독성을 감소시키는 특성을 입증한 보고는 없습니다. HSYA가 LPS 유발 독성을 in vitro7에서 약화시키는 것으로 나타났습니다. 그러나 세포 기반 평가가 신경 독성의 복잡한 과정의 모든 단계를 나타내는 것은 아닙니다. 제브라피시는 독성의 메커니즘을 밝히는 데 특히 가치가 있음이 입증되었습니다. 최근에는 HSYA가 단백질 키나아제 B의 발현을 감소시켜 염증 반응을 개선함으로써 NF-κB 염증 경로 활성화를 억제할 수 있으며, HSYA는 세포 증식 및 종양 괴사 인자 α 유발 염증 손상에 영향을 미치는 활성화 단백질 1 관련 염증 신호 경로도 억제하는 것으로 나타났습니다9, 10. 본 연구는 HYSA가 제브라피쉬의 도파민성 뉴런에서 LPS 유발 독성을 개선할 수 있는지 여부를 조사하는 것을 목표로 합니다.

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프로토콜

실험은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 실험동물 사용 지침(Publication 86-23, 1986년 개정)에 따라 수행되었습니다. 그리고 이 연구는 옌타이 대학교(YTDX20220623)의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구에 사용된 시약과 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 제브라피쉬의 유지 관리

AB 균주 제브라피쉬(Danio rerio)는 14/10시간의 명/암 주기로 27-28.5°C(pH 7.0)의 수온에서 재순환 수계에 보관되었습니다. 제브라피쉬는 하루에 두 번 새우를 먹였습니다. 자연 교미 후, 수정된 배아를 탈이온수, KCl, NaCl, MgSO4·7H2O 및 CaCl2가 포함된 E3 배지를 포함하는 페트리 접시에 수집했습니다.

2. 제브라피쉬의 LPS 유발 독성

수정 후 24시간(hpf)의 제브라피시 배아를 수확하여 대조군 및 LPS 그룹에 할당했으며, 각 그룹에는 60개의 배아가 있었습니다. LPS 분말을 계량하고 용해를 위해 일정량의 PBS(pH = 7.4) 용액에 첨가하고, 2mg/mL LPS 원액으로 제조하고, 보관 및 대기를 위해 -20°C에 두었습니다. 실험 중에 LPS 예비 용액을 30μg/mL, 60μg/mL 및 90μg/mL의 LPS 용액으로 희석했습니다. 최종 농도가 30μg/mL, 60μg/mL 또는 90μg/mL인 LPS 용액을 24개의 hpf 제브라피시 배아를 포함하는 페트리 접시에 첨가했습니다. 각 실험 웰에 대한 용액의 부피는 3mL였습니다. 대조군에서는 제브라피시 배아를 LPS가 없는 E3 배지에서 배양했습니다. 페트리 접시는 28°C의 항온 배양 챔버에 넣었습니다. LPS에 대한 노출은 위에서 언급한 것과 동일한 절차에 따라 5일 연속으로 반복되었습니다.

3. 제브라피쉬의 LPS 유발 독성에 대한 TLR4 억제제의 효과

24 hpf의 제브라피시 배아는 대조군, LPS 및 TAK-242 그룹에 할당되었습니다. TLR4 신호전달 경로의 조절에 대한 최종 농도 1μM에서 TAK-242의 조절 효과를 검증하기 위해 많은 연구가 수행되었으며, 그 중 일부 연구에서는 TAK-242가 LPS 유도 세포 증식 및 염증 인자의 방출을 억제함으로써 수술 후 녹내장 감소와 관련된 문제를 해결하는 새로운 방법을 제공한다는 것을 보여주었습니다11. TAK-242 그룹에서, TAK-242(1μM, 최종 농도)를 24개의 hpf 제브라피시 배아를 함유하는 페트리 접시에 첨가하였다; 각 실험 웰에 대한 용액의 부피는 3mL였습니다. 30분 후 LPS(60μg/mL, 최종 농도)를 첨가하여 독성을 유발했으며 LPS 농도는 제브라피시 폐사를 유발하지 않았습니다. 대조군의 배아는 E3 배지에서만 유지되었습니다. 페트리 접시는 28°C의 항온 배양 챔버에 넣었습니다. 위의 절차를 5일 연속으로 반복했습니다.

4. 제브라피쉬의 LPS 유발 독성에 대한 HSYA의 영향

24 hpf의 제브라피시 배아는 대조군, LPS 및 HSYA 그룹에 할당되었습니다. 20 μM, 40 μM 또는 80 μM의 최종 농도의 HSYA를 24 hpf 제브라피쉬 배아를 함유하는 페트리 접시에 첨가하였다; 각 실험 웰에 대한 용액의 부피는 3mL였습니다. 30분 후 LPS(60μg/mL, 최종 농도)를 첨가했습니다. 대조군의 배아는 E3 배지에서만 유지되었습니다. 페트리 접시는 28°C의 항온 배양 챔버에 넣었습니다. 위의 절차를 5일 연속으로 반복했습니다.

5. 행동 평가

제브라피쉬는 96웰 플레이트의 중간 60웰로 옮겨졌으며 웰당 하나의 제브라피시 유충이 있었습니다. E3 배양 배지(250μL)를 각 웰에 첨가하여 자유롭게 수영할 수 있도록 했습니다. 운동 활동은 비전 시스템을 사용하여 기록되었습니다. 어두운 상자 (30cm × 40cm × 60cm)에 순수한 물을 넣고 온도를 28 °C로 조정 한 가열 상태로 설정했습니다.

다크 박스의 온도가 28°C에 도달하면, 제브라피시가 들어있는 96웰 플레이트를 그 안에 넣고, 시각 시각 시스템을 활성화하여 운동 활동을 기록했습니다. 데이터를 저장하기 위해 새 폴더가 생성되었습니다. 실험 설정 인터페이스로 들어가기 위해 수제 비디오 파일을 비디오 소스로 선택했습니다. 실험 설정 섹션에서 관찰 구역의 수를 60으로 설정하여 60마리의 제브라피시를 동시에 관찰할 수 있습니다. 아레나 설정에서는 렌즈가 캡처한 96웰 플레이트의 이미지가 포지셔닝 서클과 함께 화면에 나타났습니다. Arrange Arenas 인터페이스의 모듈은 렌즈 캡처 영역이 각 웰과 정렬되도록 조정되었습니다. 아레나 하드웨어 매핑에서 다크 박스 라이트는 라이트 켜짐으로 설정되었습니다.

시험 대조 설정에서 10분의 준비 기간과 10분의 검출 기간으로 구성된 새로운 프로그램을 만든 다음 모든 병렬 실험에 적용했습니다. 감지 설정은 렌즈 캡처 기능이 정상적으로 작동하고 있는지 확인하는 데 사용되었습니다. Trial List에는 각 그룹에 있는 60마리의 제브라피시 데이터가 표시되었습니다. 도구 모음의 시행 횟수는 모든 실험 그룹을 포함하는 데이터 테이블을 생성하는 데 사용되어 데이터 완전성을 보장했습니다.

모든 설정이 확인되었으며 다크 박스 온도는 28°C로 유지되었습니다. 각 우물에 활력 징후가 있는 제브라피시 한 마리가 있는지 확인한 후 실험이 시작되었습니다. 실험이 진행되는 동안 행동 도구의 렌즈는 움직임 궤적, 지속 시간 및 관련 매개변수를 기록했습니다. 첫 번째 녹음이 20분 정도 진행된 후 시스템이 자동으로 종료되고 다음 시도를 준비했습니다. 어두운 상자를 열고, 후속 실험을 위해 96웰 플레이트를 제브라피시가 들어 있는 새 것으로 교체했습니다.

실험이 끝나면 분석 모듈에서 결과를 선택했습니다. 평균 속도, 거리, 최대 가속도 및 절대 조향 각도와 같은 실험 매개변수는 결과 모듈에서 추출되어 내보내졌습니다. 그런 다음 제브라피시 그룹 간의 행동 차이를 분석하기 위해 데이터를 수집했습니다12.

6. 전염증성 사이토카인 측정

제브라피쉬가 수집되었습니다. 시편의 무게를 측정하고 PBS(0.01M, pH = 7.4)를 1:9의 중량비로 첨가하고 4°C에서 균질화(5000r/min, 30초)했습니다. 균질액을 4°C, 5000 x g, 20분에서 원심분리하고, 상등액을 수확하였다. IL-1β 및 TNF-α는 제조업체가 제공한 지침에 따라 어류 ELISA 키트로 분석했습니다.

7. 면역조직화학(Immunohistochemistry)

제브라피쉬는 5mL 4%(v/v) 파라포름알데히드로 고정했습니다. 파라핀에 내장하고 5μm 두께의 단면을 절단합니다. 절편을 마이크로파에서 구연산염 완충액(200μL)으로 10분 동안 배양했습니다. 그들은 내인성 과산화효소를 차단하기 위해 0.3% 과산화수소 및 메탄올 용액에서 30분 동안 배양되었습니다. PBS로 3회, 매번 5분씩 세척합니다. 무면역 혈청을 37ºC에서 30분 동안 배양하고, 1차 항TH 항체(1:100)를 37ºC에서 30분 동안 배양하고, PBS로 3회 세척했습니다. 37ºC에서 30분 동안 horseradish peroxidase(1:200)와 연결된 2차 항체와 함께 배양합니다. 그런 다음 3,3'-디아미노벤지딘을 첨가했습니다. 절편은 명시야 현미경을 사용하여 이미지화했습니다.

8. 신경 전달 물질

HPLC-ECD는 도파민 수치를 분석하기 위해 사용되었습니다. 도파민 염산염을 0.1M 과염소산(HClO4)에 용해시켜 3.90625ng/mL, 7.8125ng/mL, 15.625ng/mL, 31.25ng/mL, 62.5ng/mL 및 125ng/mL에서 농도 구배 용액을 얻었습니다. 일련의 도파민 표준 용액을 HPLC-ECD로 분석했습니다. 선형 회귀는 도파민 농도와 도파민 피크 면적을 사용하여 수행되었습니다. 표준 곡선이 그려졌습니다. 제브라피쉬 조직은 0.1M HClO로 균질화되었습니다 4 13 . 균질산염을 4°C, 20,000 x g, 15분에서 원심분리했습니다. 다음으로, ODS2 컬럼(E2118047, 4.6 × 250mm, 5μm)에서 샘플을 분리했습니다. 완충액을 준비하였다 : 25 mmol / L 아세트산 나트륨, 25 mmol / L 구연산, 0.01 mmol / L 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 디 소듐 염, 1 mmol / L 나트륨 1- 옥탄 설포 네이트 및 아세트산, pH 3.35로 조정. 이동상은 아세토니트릴: 완충액(1:9, v/v)이었습니다. 0.22μm 필터 멤브레인으로 진공 여과한 후 10분 동안 초음파 탈기로 샘플을 탈기했습니다. 컬럼 오븐의 온도는 30°C였습니다. 유속은 1mL/분이었습니다. 샘플을 20μL의 부피로 주입했습니다. 전기 화학 검출기는 10 μA 범위의 1000 mV의 전압에서 작동되었습니다. 제브라피시 조직의 도파민 양은 회귀 방정식에 따라 계산되었습니다.

9. 웨스턴 블롯

제브라피쉬 조직에서 단백질을 추출하고 농도를 분석했습니다(최종 농도: 10mg/mL). 단백질(50 μg/5 μL)을 8% 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용하였다. 전사막은 110V에서 1시간 동안 수행되었습니다. 멤브레인을 1 시간 동안 5 % 우유로 차단했습니다. 4 °C에서 1차 항체와 함께 배양: 토끼 anti-TLR4 (1:1000), 토끼 anti-NF-κB (1:2000), 토끼 anti-lamin B1 (1:2000) 또는 토끼 anti-GAPDH (1:1000). TBST로 세척한 후(각 5분씩 3회), 멤브레인을 1시간 동안 2차 항체와 함께 배양했습니다. 밴드는 ECL Chemiluminescent Substrate Kit를 사용하여 시각화하고 겔 이미징 시스템을 사용하여 정량화했습니다. Lamin B1 및 GAPDH는 적재 제어 장치로 사용되었습니다.

10. 통계 분석

모든 데이터는 SD± 평균으로 표현되었으며 통계 소프트웨어로 분석되었습니다. 통계 분석은 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 수행된 후 Tukey의 검정을 수행했습니다. P-값 <0.05는 통계적으로 유의했습니다.

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결과

LPS가 제브라피쉬의 운동 기능에 미치는 영향
LPS(60μg/mL 및 90μg/mL) 그룹에서 제브라피시의 평균 속도, 총 거리 및 최대 가속도는 대조군에 비해 감소(P < 0.01)되었습니다. 운동 기능 장애는 또한 운동 방향의 잦은 변화로 나타났습니다. LPS 60 μg/mL 및 LPS 90 μg/mL 그룹에서 제브라피쉬의 수영 절대 회전 각도는 대조군과 비교할 때 유의하게 증가(P < 0.01)했습니다(그림 1).

IL-1β 및 TNF-α에 대한 LPS의 영향
대조군에 비해 LPS 60 μg/mL 및 LPS 90 μg/mL 그룹의 IL-1β 및 TNF-α 함량이 유의하게 증가했습니다(...

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토론

약용 식물은 항염증 및 신경 보호 응용 분야에 대한 오랜 실적을 가지고 있습니다14. 우리의 이전 연구는 HSYA가 신경독성 제제에 의한 PD 동물 모델에서 보호 효과가 있음을 보여주었습니다. 제브라피쉬에서 LPS 유도 독성을 사용하여 이 연구는 HSYA가 TLR4/NF-κB 신호 경로를 조절하여 제브라피쉬의 도파민 뉴런에서 염증 유발 손상을 약화시킨다는 것을 보여줍니다.

수면 장애와 인지 기능 장애는 PD15,16과 밀접한 관련이 있을 뿐만 아니라 운동 기능 장애도 PD17의 주요 특징입니다. 제브라피쉬의 LPS 유발 독성에서 제브라피시 거동을 조사한 결과, LPS에 노출된 제브라피시는 절대 회전 각도의 상승과 함께 평균 속도, ...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

작성자 기여:
개념화: Guirong Zhang, Bing Han. 자금 조달 인수: Guirong Zhang, Bing Han. 조사: 장후이린(Huilin Zhang). 방법론: Huilin Zhang, Mingyue Li, Xiaohan Zhang, Yang Li. 감독: Guirong Zhang, Bing Han. 글쓰기- 원고: Mingyue Li, Xiaohan Zhang, Yang Li. 쓰기-검토 및 편집: Huilin Zhang, Guirong Zhang, Bing Han.

감사의 글

이 원고를 편집해 주신 레이첼 제임스에게 감사드립니다. 이 연구는 산둥성 자연과학재단(보조금 번호)의 지원을 받았습니다. ZR2020MH377).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
BCA 단백질 농도
측정 키트		Beyotime BiotechnologyP0012S
화학발광 이미징 시스템Beijing Sage Venture Technology Co.ChampChemi 910
도파민 염산시그마– AldrichPHR1090
전자 저울Shanghai OHAUS Instrument Co.AR-2140
ELISA 키트;COIBO 생명공학CB10018-FI
ELISA 키트;COIBO BiotechnologyCB10148-FI
GAPDH 항체세포 신호 전달 기술5174S
GraphPad Prism 5.0GraphPad 통계 소프트웨어, 보스턴,
MA, USA, www.graphpad.com		Prism 5.0
고성능 액체
크로마토그래피– 전기화학
검출(HPLC– ECD)		GL Sciences, Ibaraki, JapanED723
고속 냉동 원심분리기Beijing Dalong Xingchuang
Experimental Instrument Co.		D3024R
HPLC– ECDGL 과학ED723
HSYALuye Pharma Group Ltd.LY202206
이미지 퀀트GE 헬스케어, 일본 도쿄LAS 4000
라민 B1 항체세포 신호 전달 기술13435S
LPS시그마– AldrichL2630
현미경라이카, WetzlarDM1000LED
현미경라이카, 독일DM1000LED
다기능 효소 라벨러Shanghai Meigu Molecular Instrument Co.SpectraMax 패러다임
NF-&카파; B 항체세포 신호 전달 기술8242S
놀더스 비주얼 비전 XT 시스템베이징 놀두스 생명공학 유한 회사EthoVision XT15
핵 및 세포질
단백질 추출 키트		Beyotime BiotechnologyP0028
PMSFBeyotime BiotechnologyST506
TAK-242Merck614316
ThermostatShenzhen Galaxy Instrumentation Co.12810129
TLR4 항체Abcamab13556
ZebrafishNorthern Center for National
Zebrafish Model Animals		AB 균주
제브라피쉬 재순환수 시스템Beijing Aisheng Biotechnology Co., Ltd.에센-AW-S1
염 IL-1 및 베타용 TNF-&알파용

참고문헌

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