방법 논문

An Olfactory Preference Test for measuring Olfactory Hedonic Biases in Mouse Models of Depression(우울증의 마우스 모델에서 후각 쾌락 편향을 측정하기 위한 후각 선호도 테스트)

DOI:

10.3791/68391

⸱

2025년 7월 11일

 ,  ,  ,  , 
1Centre National de la Recherche Scientifique, Unité Mixte de Recherche 3571, Institut Pasteur, Université Paris Cité, 2Ecole Doctorale 158 - Cerveau, Cognition, Comportement, Université Paris Cité, 3Laboratoire d’Ethologie Expérimentale et Comparée – UR 4443, Université Sorbonne Paris Nord, 4Université de Paris Cité, 5Department of Psychiatry, Service Hospitalo-Universitaire, GHU Paris Psychiatrie & Neuroscience

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 우울증의 마우스 모델에서 식욕 자극과 혐오 냄새 자극에 대한 부정적인 후각 편향을 평가할 수 있는 후각 선호도 테스트 프로토콜을 제시합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우울증은 전 세계적으로 장애의 가장 큰 원인으로, 매년 2억 8천만 명에게 영향을 미칩니다. 활동과 동기 부여의 감소를 넘어서, 우울증은 원자가의 부정적 편향과 관련이 있는 것으로 나타났습니다: 환자들은 건강한 사람에 비해 중립적이고 긍정적인 감각 자극을 덜 유쾌하게 느끼고, 부정적인 감각 자극을 더 불쾌하게 느낍니다. 특히, 후각 쾌락 편향은 환자에서 질병의 상태 마커를 나타낼 수 있으며 마우스 모델에서 쉽게 측정할 수 있습니다. 그러나 번역 방식으로 정서적 편향을 측정하기 위한 동물 검사는 거의 없습니다. 여기에서 우리는 다양한 쾌락 가치와 관련된 냄새 물질의 탐색을 통해 대조군과 우울증 유사 마우스의 냄새 원자가 속성에 대한 신뢰할 수 있는 평가를 위한 프로토콜을 제안합니다. 이 후각 선호도 테스트와 몇 가지 행동 판독을 사용하여 우리는 우울증의 두 가지 뚜렷한 마우스 모델에서 식욕 자극과 혐오 자극 모두에 대한 부정적인 후각 편향을 확인했습니다. 중요한 것은 이 방법이 남성과 여성 모두에게 적용된다는 것입니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 감정적 반응의 평가를 개선하기 위해 여러 가지 조정을 허용하며 신경 세포 활동의 실시간 모니터링을 위한 기존 도구와 쉽게 결합할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우울증은 심각한 기분 장애이며 전 세계적으로 장애의 주요 원인입니다. 세계보건기구(WHO)에 따르면 인구의 4%에 해당하는 약 2억 8천만 명이 우울증을 겪고 있습니다. 남성보다 여성에서 50% 더 흔하며, 코로나19 발병으로 팬데믹 첫해에 우울증 유병률이 25% 증가했습니다(세계보건기구, 2022). 또한 환자의 약 1/3이 고전적인 항우울제 요법에 반응하지 않고, 항우울제 효과를 관찰하는 데 몇 주가 걸리며, 기분 장애의 생리병리학은 대부분 알려지지 않았습니다.

DSM-51에 따르면, 우울증 진단은 우울한 기분, 흥미 또는 즐거움의 상실, 현저한 체중 변화, 신체적, 심리적 둔화, 피로, 무가치한 느낌, 집중력 저하, 반복되는 죽음에 대한 생각 등 여러 증상에 의존한다. 임상 연구는 또한 기분 장애가 감각 변화와 함께 발생한다는 것을 보여주었다: 우울증 환자는 대조군보다 감각 자극이 덜 즐겁다고 느낀다 2,3,4.

쾌락적 "원자가"는 어떤 것이 즐겁거나(긍정적 원자가) 혐오스럽거나(음의 원자가) 정도를 나타냅니다. 자극에 대한 원자가 할당은 접근 또는 회피를 포함한 적응된 행동을 유발할 수 있습니다5. 흥미롭게도, 이 과정은 곤충에서 인간에 이르는 종 간에 매우 보존되어 있다6. 따라서 우울증은 원자가의 부정적 편향과 관련이 있습니다. 그러나 임상 진단은 아직 감각 편향 평가에 거의 의존하지 않습니다.

감각 양식 중에서도 후각은 후각 입력이 주로 시상 릴레이를 우회하여 인간을 포함한 포유류의 변연계로 투영되기 때문에 특히 흥미롭습니다. 진화론적 관점에서 볼 때, 이 시스템은 환경 자극에 대한 일련의 1차 반응을 코딩하는 데 중요한 것으로 나타났습니다 7,8,9,10,11,12. 이러한 공유된 신경 회로와 더불어, 임상 연구는 우울증 환자가 우울증 증상을 유발하는 후각 장애뿐만 아니라 후각 변화를 경험하는 후각과 우울증 사이의 양측성 관계를 밝혀냈다13. 또한, 우울증 환자는 약물 치료나 치료를 받은 후 후각 기능이 회복된다 14,15,16,17. 이러한 결과는 후각 결핍이 질병에 대한 특성(정신 장애의 병태생리학에서 선행적이고 인과적인 역할을 하여 조기 증상 진단에 사용될 수 있는 특성)보다는 상태(환자의 임상 증상 상태)의 바이오마커일 수 있음을 시사한다18. 따라서, 우울증에서 후각 양상이 어떻게 변화하는지에 대한 더 나은 이해는 치료 반응성의 진단 및 감지를 위한 새로운 치료 도구를 향한 길을 열 수 있습니다.

그러므로, 우울증 모델에서 후각 쾌락 편향을 평가하는 것은 유도된 우울증과 유사한 표현형을 평가하고 원자가 할당의 이러한 변화 뒤에 있는 신경 메커니즘을 조사하는 도구로서 특히 흥미로울 것입니다. 이전 연구에서는 이미 생쥐의 냄새 원자가 할당을 평가하기 위해 행동 접근 방식을 사용했습니다. 그러나, 이러한 시험은 몇 가지 주의 사항을 제시한다: 그들은 주로 뚜껑으로 닫힌 상자(19,20,21)를 포함하고, 냄새 용액(20,21,22)과의 지속적인 물리적 접촉을 내포하며, 및/또는 매우 짧은 냄새 탐색 시간 21,22,23을 초래하는 정교한 장치19를 필요로 한다. 이로 인해 이러한 분석은 테더링된 마우스에서 더 긴 샘플링 기간이 필요한 신경 활동을 실시간으로 모니터링하는 기존 도구와 호환되지 않습니다.

더욱이, Malkesman 등은 암컷 쥐의 소변에 노출된 수컷 쥐의 후각 조사를 측정하여 설치류의 보상 추구 활동을 모니터링하기 위해 이미 FUST(Female Urine Sniffing Test)를 개발했습니다24. 그러나 이 테스트는 사회적 성격의 특정 긍정적 자극에 대한 행동 반응과 짧은 상호 작용 시간만 평가합니다. 또한, 이 검사는 수컷 설치류만을 위해 고안되었지만, 우울증은 남성보다 여성에게 두 배 더 널리 퍼져 있습니다.

이러한 모든 한계를 극복하기 위해 우리는 Bigot et al.14에서 채택한 후각 선호도 테스트(OPT)를 개발했으며, 여기서 수컷과 암컷 마우스 모두 다양한 중성, 긍정적 및 부정적 냄새에 노출되어 우울증의 맥락에서 쾌락 반응을 정확하게 평가할 수 있습니다. 냄새의 선택은 이전 간행물14,25에 기초할 수 있지만, 이 검사는 또한 천연 성분과 단분자 또는 특별히 설계된 화학 혼합물을 사용하여 새로운 사회적, 영양적, 감염 관련 자극을 탐색할 수 있습니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 동물 관리 및 실험 절차는 국내 및 유럽(2010/63/EU) 지침을 따랐으며 프랑스 연구부(APAFiS: #16380-2018080217358599_v1; APAFIS #51636-2024101718013761_v4). C57BL/6JRj 수컷 및 암컷 마우스(UCMS 모델) 및 C57BL/6NTac(CORT 모델) 수컷 마우스(8주령)를 사회적으로 수용하고(케이지당 4-5마리) 표준 조건(23 ± 1°C, 습도 40%)에서 14/10시간 라이트/다크 주기(오전 7시에 점등)로 음식과 물을 자유롭게 제공했습니다.

1. 실험 설정

  1. 경기장 설치
    1. 회색 플렉시글라스 벽과 흰색 바닥으로 만들어진 2개의 구획(45cm × 50cm × 25cm)으로 구성된 실험 시설을 준비합니다. 두 개의 구획 (25cm × 45cm)을 회색 플렉시 유리 벽 (37cm × 25cm)으로 나눕니다.
    2. 각 구획의 벽 바닥에 구멍이 뚫린 페트리 접시(60mm × 15mm, 직경 7개의 구멍 5개)를 놓습니다.
    3. 양면 접착제 또는 압력에 민감한 접착제(예: Blu-tack)를 사용하여 페트리 접시를 벽에 수직으로 고정합니다.
    4. 경기장 위에 카메라를 설치하여 동물의 행동을 기록하고(경기장 위 2m) 실험을 통해 동물의 움직임을 자동으로 추적합니다.
  2. 냄새의 선택
    1. 실험하기 전에 테스트할 중성, 양수 및 음의 원자가가 있는 냄새 목록을 선택합니다(예는 표 1 참조).
    2. 선택한 모든 냄새가 비슷한 증기압을 갖는지 확인하십시오. 또한 광이온화 검출기(PID)26를 사용하여 일부 냄새에 대해 경기장 전체의 확산을 평가합니다.
    3. 별도의 날에 각 냄새를 테스트하십시오.
      참고: 먼저 중성 냄새의 사용을 계획한 다음 식욕을 돋우는 냄새, 혐오스러운 냄새로 끝내는 것이 좋습니다. 이 명령은 한 테스트 날짜에서 다른 테스트 날짜로의 이월 효과를 최소화합니다. 또는 무작위 프리젠테이션을 사용할 수 있지만 모든 실험 그룹은 동일한 냄새 순서로 테스트해야 합니다.
  3. 실험군 설계
    1. 생쥐를 적어도 두 개의 실험 그룹으로 나눕니다: 대조군 생쥐와 우울증 모델을 겪을 생쥐. 같은 그룹의 동물을 같은 우리에 수용합니다.
      주의: 각 실험 그룹에는 통계적 유의성을 얻기 위해 최소 약 7-8명의 개체가 포함되어야 합니다. 케이지는 케이지 효과를 최소화하기 위해 동물 사육장 근처에 위치해야 합니다.
    2. 선택한 우울증 모델을 사용하여 관련 마우스 그룹에서 우울증과 유사한 표현형을 유도합니다.
      참고: 생쥐에서 우울증과 유사한 행동을 유도하는 프로토콜을 설명하는 것은 이 기사의 범위를 벗어납니다. 그러나 본 연구는 두 가지 다른 모델(예측할 수 없는 만성 경미한 스트레스[UCMS] 및 코르티코스테론[CORT])27,28을 사용한 실험을 이 후각 선호도 테스트의 대표적인 결과로 제시합니다. 요컨대, UCMS 모델은 몇 주에 걸쳐 다양한 환경 스트레스 요인에 대한 노출에 의존하는 반면, CORT 모델은 생쥐의 음용수에 용해된 코르티코스테론을 만성적으로 투여하는 것으로 구성됩니다(생쥐가 마시는 양에 따라 약 5mg/kg/일).

2. 습관화 단계

  1. 일반적인 습관화 및 취급
    1. 도착하면 침구를 바꾸지 않고 1주일 동안 생쥐를 방해하지 않고 그대로 두십시오. 스트레스를 줄이기 위해 케이지에 보조 면 소재와 이글루를 추가하십시오.
    2. 1 주일 후, 3-4 일 동안 매일 모든 마우스를 부드럽게 다루고 가급적이면 실험실에서 컵 취급에 익숙하게하십시오.
  2. 테스트의 실험 조건
    1. 실험 시작 30분 전에 마우스를 행동 검사실로 옮깁니다.
      참고: 이상적으로, 행동실에는 동물이 한 부분에 있고 테스트된 쥐가 다른 부분에서 수행할 수 있도록 두 개의 별도 부분이 포함되어야 합니다.
    2. 표준 주거 조건(23± 1°C, 습도 40%)이 유지되고 있으며 실내에 방해가 되는 소리, 조명, 냄새가 없어야 합니다.
    3. 조도계를 사용하여 경기장의 조명을 약 40lux로 설정합니다. 경기장에서 조명이 균일한지 확인하십시오.
  3. 경기장에 대한 습관화
    1. 깨끗한 여과지(42.5mm)를 두 페트리 접시(60mm × 15mm)에 추가합니다.
    2. 투명 테이프를 사용하여 페트리 접시의 뚜껑을 바닥에 부착합니다(수직으로 배치되기 때문에).
    3. 첫째 날에는 같은 케이지의 모든 쥐를 10분 동안 경기장에 부드럽게 배치하여 신공포증을 줄입니다.
      주의 : 꼬리로 인한 스트레스를 피하기 위해 항상 컵 핸들링으로 마우스를 경기장에 배치하십시오.
    4. 다음 날, 두 구획 사이에 있는 모든 마우스를 개별적으로 경기장에 투기하고 10분 동안 동작을 기록합니다.
    5. 2-3일 연속으로 반복합니다.
  4. 탐색 기준
    1. 페트리 접시가 놓인 두 영역(25cm, 15cm)을 정의하고 각 동물이 각 영역에서 보내는 시간을 측정합니다.
    2. 모든 개별 습관화 단계를 통해 이러한 측정값의 평균을 구합니다.
    3. 각 영역에서 보낸 평균 시간이 50초보다 높으면 기준이 충족된 것입니다. 그렇지 않은 경우 기준에 도달할 때까지 습관화 세션을 반복하거나 동물을 분석에서 제외합니다.
      참고: 하루에 최대 두 번의 습관화 세션(오전과 오후)을 수행할 수 있습니다.

3. 테스트 단계

  1. 냄새의 준비
    1. 테스트 당일에는 화학 후드 아래에 올바른 희석액으로 냄새를 준비하십시오. 화학 구조에 따라 미네랄 오일 또는 증류수에 냄새를 희석하십시오. 오염을 방지하려면 미네랄 오일을 냄새가 나는 별도의 환기 가능한 방에 보관하십시오.
      알림: 새로운 실험을 시작할 때 새 미네랄 오일 병을 사용하는 것이 좋습니다.
    2. 냄새 용액을 유리 바이알에 보관하십시오. 냄새 오염을 유발할 수 있는 플라스틱 튜브 용기를 피하십시오.
    3. 각 마우스를 테스트하기 직전에 필터 팁을 사용하여 마이크로피펫으로 냄새 용액 200μL를 수집하고 두 개의 페트리 접시 중 하나에 있는 여과지에 놓습니다.
    4. 두 번째 페트리 접시에 있는 다른 여과지는 그대로 두십시오.
    5. 시험실에서 페트리 접시를 옮기고 경기장 벽에 수직으로 고정합니다.
      주의 : 냄새 오염을 방지하기 위해 실험실에서 냄새 용액을 준비하여 버리지 마십시오. 실험 중에 장갑을 정기적으로 교체하십시오. 냄새 조작 중에 장갑이 오염되었을 수 있다고 의심되는 경우 테스트를 위해 마우스를 잡기 전에 장갑을 교체하십시오.
  2. 행동 테스트
    1. 각 마우스를 두 구획 사이의 경기장에 개별적으로 놓습니다.
    2. 10분 동안 녹음합니다.
    3. 경기장에서 마우스를 제거합니다.
    4. 페트리 접시 냄새를 제거하십시오.
    5. 소독액(예: 에탄올 70%)으로 경기장을 청소하고 건조시킵니다.
    6. 여과지를 버리고 다음 마우스를 위해 냄새 준비를 반복합니다.
    7. 이상적으로는 하루에 한 가지 냄새만 테스트하는 것이 좋습니다. 우선적으로 중성 냄새를 먼저 사용하고, 그 다음에 긍정적인 냄새를, 마지막으로 부정적인 냄새를 사용하십시오( 그림 1 참조).
      주의: 습관화 단계와 테스트 단계를 모두 실험 당일까지 하루 중 거의 같은 시간에(이상적으로는 오전 9시에서 오후 3시 사이) 수행합니다 . 동물의 수가 더 오랜 기간을 필요로 하는 경우, 낮과 시간의 편향을 피하기 위해 서로 다른 실험 그룹을 번갈아 가며 테스트하는 데 주의를 기울여야 합니다. 동일한 실험에서 수컷과 암컷을 테스트해야 하는 경우 한 성별을 차례로 테스트하는 것이 좋습니다.
      알림: 냄새 오염을 방지하기 위해 테스트 기간 동안 매일 깨끗한 페트리 접시를 사용하십시오. 참고로, 천공된 페트리 접시는 적절한 세척 및 냄새 오염 제거 후 여러 실험에 재사용할 수 있습니다.

4. 데이터 분석

  1. 행동 추적
    1. 자동 추적 프로그램을 사용하여 테스트를 통해 마우스의 위치를 기록합니다.
    2. 분석을 위해 경기장에서 별도의 구역을 정의합니다( 그림 1 참조).
      1. "냄새 영역"(25cm × 15cm)을 정의하고, 여과지가 냄새에 흠뻑 젖은 상태로 페트리 접시가 놓이는 영역(즉, 표면 구획의 약 1/3을 나타내는 냄새에 가장 가까운 영역)을 정의합니다.
      2. "냄새 영역"에 대칭이지만 페트리 접시에 냄새가 추가되지 않은 "제어 영역"(25cm × 15cm)을 정의합니다.
      3. "냄새 뒤 영역"(25cm × 30cm)을 정의하십시오. 즉, 나머지 구획은 냄새 페트리 접시가 놓이는 곳입니다.
      4. "뒤 제어 구역"(25cm × 30cm)을 정의하고, 나머지 무취 구획으로 구성된 "뒤 통제 구역"과 대칭을 이룹니다.
        참고: 생쥐 몸의 중심점을 추적하는 것만으로도 동물의 후각 선호도를 분석하기에 충분합니다. 그러나 각 쥐의 코를 구체적으로 추적하면 동물의 후각 조사를 보다 정확하게 설명할 수 있습니다.
  2. 쾌락적 반응의 판독
    1. 자동 추적을 사용하여 습관화 단계를 포함하여 모든 마우스 및 테스트의 모든 날에 대해 다음 정보를 수집합니다.
      1. 경기장에서 이동한 총 거리(m)를 기록합니다.
      2. 경기장의 각 구역에서 보낸 시간을 기록합니다.
      3. 경기장의 각 구역에 있는 엔트리 수를 기록합니다.
    2. 이동한 총 거리를 사용하여 주요 운동 효과를 평가합니다.
    3. 다양한 냄새에 대한 후각 선호도의 차이를 평가하려면 주요 판독값을 사용하십시오.
      1. 냄새 구역에서 보낸 시간을 사용하십시오.
      2. 냄새 구역의 항목 수를 사용하십시오.
      3. 습관화 중 냄새 구역에서 보낸 시간으로 정규화된 냄새 구역에서 보낸 시간으로 계산된 선호도 지수를 사용합니다(정규화는 모든 그룹의 마우스에서 수행됨). 평균은 냄새 영역에서 보낸 시간의 산술 평균을 나타내고 sd는 표준 편차를 나타냅니다.
        figure-protocol-1
      4. 다음과 같이 이동한 거리, 악취 구역에서 보낸 시간 및 악취 구역의 항목 수에 대한 정규화된 값의 평균으로 계산된 냄새 탐색 지수를 사용합니다.
        figure-protocol-2
        figure-protocol-3
        참고: 이 선호도 지수는 예를 들어 냄새 구역 과 통제 구역에서 보낸 시간을 비교하여 필요한 경우 조정할 수 있습니다. 집단이 습관화 중 "냄새 영역"을 탐색하는 데 상당한 차이를 보이는 경우, 정규화는 모든 그룹을 결합하는 것이 아니라 통제 그룹에 대해서만 수행할 수 있습니다.
    4. 대조군 및 우울증 유사 마우스에 대한 이러한 판독값을 평균 ± 표준 오차(SEM)로 시각적으로 표현합니다.
    5. 반복 측정 양방향 분산 분석(ANOVA) 후 사후 검정(여기서는 수정되지 않은 Fisher의 최소 유의차 검정)을 사용하여 실험 그룹, 냄새(반복 측정 요인) 및 상호 작용 효과 요인을 모두 고려합니다. 교호작용 계수는 그룹 간의 차이가 제시된 모든 냄새에서 일관되는지 여부를 나타냅니다.
    6. 적응 테스트(Shapiro-Wilk 테스트, Bartlett 테스트)를 사용하여 정규성과 동질성을 확인합니다. 통계적 유의성은 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001로 설정되었다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우울증 유사 마우스가 부정적인 후각 편향14,29을 나타내고 여기에서 설명하는 후각 선호도 테스트의 프로토콜을 사용하여 신뢰할 수 있게 측정할 수 있는지 확인하기 위해 두 가지 서로 다른 우울증 마우스 모델에서 서로 다른 냄새에 대한 쾌락적 반응을 평가했습니다.

먼저, 젊은 암컷 C57BL/6JRj 마우스에서 우울증과 유사한 표현형을 유도하기 위해28(자세한 프로토콜은 보충 파일 1 참조)에서 4주 동안 지속되는 예측할 수 없는 만성 경미한 스트레스(UCMS)의 마우스 모델을 사용했습니다(그림 2A, B). 이 암컷 마우스는 식욕 냄새로 수컷 마우스 소변(MU, 순수)과 혐오 냄새로 2,4,5-트리메틸티아졸(TMT, 미네랄 오일 중 5%)을 사용하여 후각 선호도 테스트에서 테스트되었습니다. 평균적으로 모든 마우스는 습관화 기간 동안 "대조군"과 "냄새" 영역 모두에서 최소 50초를 소비하여 기준을 충족했습니다(그림 2C). 그러나 습관화를 통해 UCMS 마우스는 대조군에 비해 "대조군"에서 훨씬 더 많은 시간을 보냈지만 냄새가 추가되는 구역에 대해서는 큰 차이가 없기 때문에 이 차이를 무시할 수 있습니다. 거리와 관련하여, 대조군 마우스는 MU에 노출되었을 때 UCMS보다 훨씬 더 많이 움직였지만, 습관화 중이거나 TMT가 있는 동안에는 그렇지 않았습니다(그림 2D). 마지막으로, 쾌락 반응(냄새 영역에서 보낸 시간, 냄새 영역의 항목 수 및 선호도 지수)에 대한 모든 판독값은 대조군과 UCMS 여성 간에 상당한 차이 또는 통계적 경향을 보여줍니다(그림 2E-G). 이 효과는 쾌락과 운동 반응을 결합한 척도인 전체 악취 탐색 지수(global odor exploration index)를 통해서도 볼 수 있습니다(그림 2H). 따라서 일관되게 모든 판독값은 식욕적 자극과 혐오적 후각 자극 모두에 대한 반응으로 부정적인 쾌락 편향을 보여줍니다. 흥미롭게도, 많은 양의 행동 테스트14를 기반으로 불안 및 우울증 유사 표현형의 정규화된 값으로 계산되는 정서 점수는 MU 및 TMT의 냄새 탐색 지수와 양의 상관관계가 있으며(그림 2I), 긍정적 및 부정적 냄새 물질에 대한 행동 반응과 불안 및 우울증 유사 표현형 사이의 관계를 보여줍니다.

둘째, 이번에는 수컷 마우스에서 우울증과 같은 표현형을 유도하기 위해 동일한 UCMS 프로토콜을 사용했습니다. 후각 선호도 테스트(Olfactory Preference Test)에서 이 마우스는 식욕을 돋우는 암컷 마우스의 소변(FU, pure)과 이전과 마찬가지로 부정적인 냄새로 TMT에 노출되었습니다(그림 3A, B). 습관화 중 4개 구역에서 보낸 시간이나 테스트를 통해 이동한 거리에는 차이가 없습니다(그림 3C, D). 악취 구역에서 보낸 시간은 대조군에 비해 UCMS에서 FU 및 TMT 탐색이 크게 감소한 것으로 나타났습니다(그림 3E). 또한, UCMS 마우스는 냄새 영역에 현저히 적게 들어가거나 들어가는 경향이 있으며, FU와 TMT 모두에 대해 현저히 감소된 선호도 지수를 나타내며(그림 3F, G), 우울증과 유사한 상태에서 부정적인 후각 편향을 확인시켜줍니다. 마찬가지로, 냄새 탐색 지수는 대조군(그림 3H)에 비해 UCMS 마우스의 FU 및 TMT에 대한 음의 변화된 행동 반응을 보여주며, 이는 동물의 감정 점수와 양의 상관관계가 있는 경향이 있습니다(그림 3I).

세 번째 실험에서는 수컷 C57BL/6NTac 마우스의 음용수에 코르티코스테론(CORT)을 만성적으로 투여하는 반면, 대조군 마우스는 차량(Veh) 용액(10% 2-하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린)만 투여하는 또 다른 우울증 모델에 의존했다 27. 4주간의 CORT 또는 Veh 처리 후, 마우스는 4일 동안 습관화된 후 중성 냄새(OCT: 2-트랜스 옥테날, 물 중 1%), 긍정적인 냄새(PO: 땅콩 기름) 및 부정적인 냄새(TMT: 2,4,5-트리메틸티아졸, 미네랄 오일 중 5%)에 노출되었습니다(그림 4A, B). 습관화를 통해 Veh와 CORT 사이에는 차이가 없었습니다(그림 4C). 그러나 두 그룹 모두 "대조군 구역"에 비해 "냄새 구역"에서 훨씬 더 많은 시간을 보냈습니다. Veh 마우스가 CORT보다 더 많이 움직인 긍정적 냄새(PO)를 제외하고는 이동한 거리에 대한 차이는 없습니다(그림 4D). 중요한 것은 UCMS 마우스와 마찬가지로 CORT 마우스도 중성 및 식욕 유발 냄새에 노출되었을 때 냄새 구역에서 보내는 시간이 크게 감소했다는 것입니다(그림 4E). 악취 탐색의 감소는 악취 구역의 진입 수가 현저히 감소하거나 감소하는 경향을 통해서도 볼 수 있습니다(그림 4F). 이 경우, 분석된 판독값에 따라 그룹 간의 차이가 드러나는데, 이는 아마도 사용된 동물의 수와 관련된 제한과 TMT 노출 후 관찰된 낮은 탐사 시간으로 인한 잠재적인 바닥 효과 때문일 수 있습니다. 전반적으로, 모든 냄새 자극에 대한 선호도 지수는 Veh에 비해 CORT 마우스에서 현저히 낮습니다(그림 4H). 마지막으로, 모든 냄새에 대한 냄새 탐색 지수는 동물의 감정 점수와 유의한 상관관계가 있으며(그림 4I), 이는 이 후각 선호도 테스트가 우울증의 여러 마우스 모델에서 부정적인 감정 편향을 평가하는 데 적합한 도구임을 다시 한 번 보여줍니다.

마지막으로, 관찰된 차이가 정서적 편향이 아닌 운동 활동의 감소로 인해 발생할 수 있는 가능성을 배제할 수 있습니다. 실제로, 이동은 총 이동 거리를 평가할 때 습관화 동안 그룹 간에 차이가 없습니다(그림 2D, 그림 3D, 그림 4D). 또한, 통계적 분석에 따르면, 작업 참여도의 일반적인 감소나 참신성 효과도 이러한 편향을 설명할 수 없습니다. 실제로, 선호도 지수 분석에서 냄새 요인의 유의미한 효과를 발견했으며, 실험 그룹과 냄새 사이에는 유의미한 상호 작용이 없었습니다. 이러한 결과는 우울증에 걸린 생쥐가 실제로 그 일을 수행하며, 그들의 감소된 탐색이 각 후각 신호에 따라 다르다는 것을 보여준다.

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그림 1: 후각 선호도 테스트의 타임라인 및 설정에 대한 일반적인 개략도. 생쥐는 먼저 경기장에 익숙해집니다. 습관화 첫날에는 같은 사육 케이지의 쥐를 함께 배치하여 신공포증을 줄입니다. 다음 날, 그들은 개별적으로 투기장에 배치됩니다. 습관화 후, 챔버 중 하나에 냄새가 추가됩니다. 중성 냄새가 우선적으로 먼저 테스트되고 긍정적 인 냄새와 마지막으로 부정적인 냄새가 뒤따릅니다. 분석을 위해 경기장은 4개의 다른 구역으로 나눌 수 있습니다. Biorender로 제작했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 우울증에 대한 UCMS 암컷 마우스 모델의 음의 후각 편향. (A,B) 연구의 타임라인 및 실험 그룹: 대조군 및 UCMS(예측할 수 없는 만성 경미한 스트레스) 암컷 마우스는 후각 선호도 테스트에서 양성(MU: 수컷 마우스 소변, 순수) 및 음성 냄새(TMT: 2,4,5-트리메틸티아졸, 미네랄 오일 5%)로 테스트됩니다. Biorender로 제작했습니다. (C) UCMS 마우스는 습관화 기간 동안 대조군에 비해 평균적으로 "대조군 구역"에서 훨씬 더 많은 시간을 보내고 "냄새 뒤 구역"에서 더 적은 시간을 보냈습니다(그룹: F(1, 12) = 74.03, p < 0.0001; 영역: F(2.434, 29.21) = 7.688, p = 0.0012; 교호작용: F(3, 36) = 5.148, p = 0.0046). (D) MU에 노출되었을 때 UCMS에서 총 이동 거리가 유의하게 감소했지만 Habituation(Hab) 및 TMT에서는 그렇지 않았습니다(그룹: F(1, 12) = 4.664, p = 0.0518; 냄새 : F (1.871, 22.45) = 4.846, p = 0.0195; 교호작용: F(2, 24) = 4.797, p = 0.0177). (E) UCMS 마우스는 MU 및 TMT를 탐색하는 데 훨씬 적은 시간을 소비했습니다(그룹: F(1, 12) = 24.39, p = 0.0003; 냄새 : F (1, 12) = 59.69, p < 0.0001; 교호작용: F(1, 12) = 2.267, p = 0.1580). (F) UCMS 마우스는 악취 영역보다 적게 진입하거나 (그룹: F(1, 12) = 9.279, p = 0.0102; 냄새 : F (1, 12) = 5.100, p = 0.0433; 교호작용: F(1, 12) = 1.649, p = 0.2233). (G) UCMS 마우스에서 MU 및 TMT에 대한 선호도 지수가 유의하게 감소했다(그룹: F(1, 12) = 24.39, p = 0.0003; 냄새 : F (1, 12) = 59.69, p < 0.0001; 교호작용: F(1, 12) = 2.267, p = 0.1580). (H) UCMS 마우스에서 MU 및 TMT에 대한 악취 탐색 지수가 유의하게 감소합니다(F(1, 12) = 14.71, p = 0.0024; 냄새 : F (1, 12) = 0, p > 0.9999; 교호작용: F(1, 12) = 0.02630, p = 0.8739). (I) MU와 TMT에 대한 냄새 탐색 지수는 모두 동물의 감정 점수와 양의 상관관계가 있다(MU: Pearson R2 = 0.4837, F(1,12) = 11.24, **p = 0.0058; TMT: Pearson R2 = 0.5340, F(1,12) = 13.75, **p = 0.0030). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 우울증의 UCMS 수컷 마우스 모델에서 부정적 후각 편향. (A,B) 연구의 타임라인 및 실험군: 대조군 및 UCMS 수컷 마우스는 후각 선호도 테스트에서 양성(FU: 암컷 마우스 소변, 순수) 및 음성 냄새(TMT: 2,4,5-트리메틸티아졸, 미네랄 오일 5%)로 테스트됩니다. Biorender로 제작했습니다. (C) 습관화를 통해 경기장의 다른 구역에서 보낸 시간에는 평균적으로 차이가 없습니다(그룹: F(1, 13) = 3.921, p = 0.0693; 조너 = F(1.688, 21.94) = 34.57, p < 0.0001; 교호작용: F(3, 39) = 0.7385, p = 0.5355). (D) 대조군과 UCMS 사이의 총 이동 거리에는 차이가 없습니다(그룹: F(1, 13) = 2.313, p = 0.1522; 냄새 : F (1.722, 22.38) = 1.746, p = 0.1998; 교호작용: F(2, 26) = 0.8806, p = 0.4266). (E) UCMS 마우스에서 FU 및 TMT로 악취 영역을 탐색하는 데 소요되는 시간이 크게 감소합니다(그룹: F(1, 13) = 6.808, p = 0.0216; 냄새 : F (1, 13) = 16.21, p = 0.0014; 교호작용: F(1, 13) = 0.3304, p = 0.5753). (F) UCMS 마우스는 TMT에 대한 악취 구역에 현저히 적은 횟수로 진입하고 FU에 대한 경향을 보였습니다(그룹: F(1, 13) = 6.572, p = 0.0236; 냄새 : F (1, 13) = 3.784, p = 0.0737; 교호작용: F(1, 13) = 0.2145, p = 0.6509). (G) UCMS 마우스의 선호도 지수는 FU 및 TMT에 대해 유의하게 감소합니다(그룹: F(1,13 ) = 6.808, p = 0.0216; 냄새 : F (1, 13) = 16.21, p = 0.0014; 교호작용: F(1, 13) = 0.3304, p = 0.5753); (H) UCMS의 악취 탐색 지수는 두 악취 모두에서 유의하게 감소합니다(그룹: F(1, 13) = 12.42, p = 0.0037; 냄새 : F (1, 13) = 0.002580, p = 0.9603; 교호작용: F(1, 13) = 0.5804, p = 0.4598). (I) FU와 TMT에 대한 냄새 탐색 지수는 동물의 감정 점수와 양의 상관관계를 보이는 경향이 있다(FU: Pearson R2 = 0.2573, F(1, 13) = 4.504, p = 0.0536; TMT: Pearson R2 = 0.2266, F(1, 13) = 3.809, p = 0.0729). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 우울증에 대한 CORT 수컷 마우스 모델의 부정적 후각 편향. (A,B) 연구의 타임라인 및 실험군: Veh 및 CORT 수컷 마우스는 후각 선호도 테스트에서 중성(OCT: 트랜스-2-옥테날, 물 중 1%), 양성(PO: 땅콩 오일, 순수) 및 음성 냄새(TMT: 2,4,5-트리메틸티아졸, 미네랄 오일 중 5%)로 테스트되었습니다. Veh 및 CORT 마우스는 전체 실험 기간 동안 각각 Vehicle 및 Vehicle + Corticosterone 솔루션으로 투여됩니다. Biorender로 제작했습니다. (C) 습관화 기간 동안 경기장의 다른 구역에서 보낸 평균 시간 (그룹 : F (1, 10) = 0.07588, p = 0.7886; 영역: F(2.224, 22.24) = 6.939, p = 0.0036; 교호작용: F(3, 30) = 0.7033, p = 0.5575). (D) 습관화(Hab) 및 다양한 냄새(그룹: F(1, 10) = 4.193, p = 0.0678; 냄새 : F (3, 30) = 11.80, p < 0.0001; 교호작용: F(3, 30) = 1.489, p = 0.2375). (E) CORT 마우스는 OCT 및 PO에 대해 Veh보다 냄새 영역에서 더 적은 시간을 보냅니다(그룹: F(1, 10) = 5.094, p = 0.0476; 냄새 : F (2, 20) = 28.87, p < 0.0001; 교호작용: F(2, 20) = 3.841, p = 0.0388). (F) CORT 마우스는 Veh에 비해 냄새 구역에 덜 들어가거나 경향이 있습니다(그룹: F(1, 10) = 6.832, p = 0.0259; 냄새 : F (2, 20) = 2.738, p = 0.0889; 교호작용: F(2, 20) = 0.2902, p = 0.7512). (G) CORT qmice는 OCT 및 PO에 대해 더 낮은 선호도 지수를 나타냅니다(그룹: F(1, 10) = 5.895, p = 0.0356; 냄새 : F (2, 20) = 20.83, p < 0.0001; 교호작용: F(2, 20) = 1.437, p = 0.2611). (H) 모든 악취에 대해 UCMS 마우스에서 악취 탐색 지수가 유의하게 감소합니다(그룹: F(1, 10) = 12.35, p = 0.0056; 냄새 : F (2, 20) = 0.04381, p = 0.9572; 교호작용: F(2, 20) = 0.3622, p = 0.7006). (I) 각 냄새에 대한 냄새 탐색 지수는 동물의 감정 점수와 양의 상관관계가 있다(OCT: Pearson R2 = 0.5601, F(1, 10) = 12.73, **p = 0.0051; PO: 피어슨 R2 = 0.4495, F(1, 10) = 8.165, *p = 0.0170; TMT: Pearson R2 = 0.5061, F(1, 10) = 10.25, **p = 0.0095). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이름약어희석원자가
2,4,5-트리메틸티아졸증권 시세 표시기미네랄 오일 5%마이너스
2-트랜스 옥테널10월물 속에 1%중립의
암컷 쥐의 소변푸순수한플러스
수컷 쥐 소변뮤순수한플러스
땅콩 기름포순수한플러스

표 1: 중성, 양, 음의 원자가를 가진 냄새의 예.

보충 파일 1: 4주간의 예측할 수 없는 만성 경증 스트레스에 대한 프로토콜.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

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부정적 정서적 편향은 우울 장애의 주요 특징이며 질병의 생리병리학을 더 잘 이해하는 데 특히 관심이 있습니다. 따라서 전임상 모델에서 감각 편향 평가를 포함하여 우울증과 유사한 표현형의 특성을 개선하고 어떤 생물학적 메커니즘이 감정 처리와 병리학적 조건에서의 변화의 기초가 되는지를 조사하는 것이 중요합니다. 더욱이, 후각은 정서적 편향을 연구하기 위한 선택의 감각이다. 중개(translational) 관점에서, 생쥐와 인간 모두의 감정 처리를 평가하는 것은 윤리학적으로 관련이 있습니다. 또한 후각계와 감정계는 매우 밀접하게 얽혀 있으며 진화 전반에 걸쳐 공통 신경 구조를 공유합니다. 손상된 후각과 우울증10 사이에는 강력하고 상호적인 관계가 있으며, 이로 인해 후각은 기초 연구뿐만 아니라 진단 및 치료 반응에 사용할 수 있는 유망하고 강력한 도구입니다.

여기서, 우리는 우울증에 대한 두 가지 마우스 모델에서 후각 정서적 편향을 평가하기 위한 후각 선호도 테스트를 위한 프로토콜을 개발했습니다. 중요한 것은 이 방법을 사용하면 병리학적 조건에서 값이 변경될 수 있는 중립적 자극뿐만 아니라 긍정적 및 부정적 가변 원자가를 가진 다양한 자극에 대한 반응을 평가할 수 있다는 것입니다. 이러한 나중의 자극은 테스트의 타당성에 필수는 아니지만 실험에 흥미로운 추가 정보를 제공할 수 있습니다. 이 테스트를 통해 다양한 냄새 농도를 사용하여 반응의 확장성을 평가할 수도 있습니다. 쾌락적 가치관이 다른 자극에 대한 반응을 평가하고, 우울증의 맥락에서 긍정적 감정 처리와 부정적 감정 처리를 구분하는 것이 중요하다. 실제로, 전임상 결과에 따르면 항우울제 치료는 긍정적 및 부정적 후각 처리를 균일하게 회복시키지 못할 수 있다14. 선천적으로 두드러진 식욕 자극 또는 혐오적 후각 자극에 대한 자발적인 탐색은 또한 우울증과 유사한 상태와 관련된 인지적 또는 동기 결핍으로 인한 교란 요인을 예방합니다30,31. 따라서 이 프로토콜은 기술적인 이점이 있는 긴 학습 단계가 필요하지 않습니다. 이 연구에서 사용된 두 모델 모두 성인기에 수행된 중재에 의존한다는 점에 유의하는 것이 중요하므로 이 프로토콜이 초기 삶의 역경을 포함한 다른 우울증 위험 요인을 평가하는 데에도 민감한지 평가하기 위해 향후 실험이 필요할 것입니다.

중요한 것은 이 프로토콜이 남성과 여성 모두에게 적용된다는 것인데, 이는 여성이 남성보다 우울증의 영향을 받을 가능성이 두 배 더 높기 때문에 매우 중요합니다. 그러나 남성은 사회적 기대, 수치심 또는 낙인으로 인해 우울증으로 과소 진단될 가능성이 높다.32 그럼에도 불구하고 우울증은 증상학(임상적 징후), 병인학(생물학적 원인), 치료 예측성 33,34,35 측면에서 남성과 여성이 서로 다른 것으로 보이지만, 우울증에 대한 많은 모델과 검사는 여전히 주로 남성만을 대상으로 고안되었다. 예를 들어, 표준 여성 소변 탐지 테스트24는 유사한 프로토콜을 사용하지만 고유한 사회적 냄새 신호에 의존합니다. 매우 유익하지만 이 테스트는 탐색 시간이 짧고(대조군의 경우 30초) 암컷 소변이 남녀 모두에게 동일한 윤리학적, 쾌락적 중요성을 갖지 않기 때문에 주로 수컷 마우스에 적용됩니다. 마지막으로, 후각 쾌락 반응은 항우울제 치료에 민감한 것으로 보이며,14 따라서 본 검사는 우울증과 유사한 상태를 신뢰성 있게 특성화하기 위한 선택 도구이며, 강제 수영 검사 36,37,38과 같은 다른 논란의 여지가 있는 분석을 대체한다.

중요한 것은 이 테스트가 이전에 설명된 테스트 21,22,23에 비해 자극 탐색 시간(100-200초)이 더 길다는 것입니다. 예를 들어, 이 테스트가 신경 활동의 실시간 모니터링 기술과 결합될 때 탐색 시간 증가가 특히 중요합니다. 또한 이 검사는 음식/물 부족을 필요로 하지 않아 대사 교란 요인을 피할 수 있습니다. 마지막으로, 이 테스트는 광주기 동안 수행할 수 있어 실험적 제약(역주기, 적외선 기록)을 줄일 수 있습니다.

그러나 이 프로토콜을 성공적으로 수행하려면 몇 가지 기술 단계가 중요합니다. 첫째, 실험은 매우 통제되고 스트레스가 없는 환경에서 수행되는 것이 중요합니다: 조명은 균일해야 하고 너무 밝지 않아야 하며, 실내에 방해가 되는 소리나 냄새가 없어야 합니다. 생쥐는 하루에 한 번 경기장에서 테스트할 수 있으며 테스트는 매일 거의 같은 시간에 수행해야 합니다. 또한 동물의 스트레스를 줄이기 위해 이러한 실험을 수행할 때 고유한 실험자를 사용하는 것이 좋습니다.

둘째, 습관 일 동안 경기장에 대한 충분한 탐험이 보장되어야 합니다. 생쥐가 습관화하는 동안 페트리 접시가 놓인 구역에서 평균 50초 미만을 보내는 경우, 냄새를 테스트하기 전에 하루나 이틀의 추가 습관화를 추가할 수 있습니다. 마우스가 여전히 경기장을 충분히 오래 탐색하지 않으면 분석에서 제외해야 합니다. 실험 집단 간의 습관화 중 "냄새 영역"에 대한 초기 비대칭 탐색의 경우, 선호도 지수의 계산은 예를 들어 각 그룹에 대한 습관화 중 소요된 시간 또는 습관화 중 자신의 탐색과 관련하여 정규화함으로써 차등 자발적 선호 편향을 수정하기 위해 조정될 수 있습니다. 실제로, 또 다른 어려움은 실험 집단 간의 높은 변동성일 수 있습니다. 문제가 발생하면 개체 내 변동성을 제한하기 위해 동일한 냄새로 이틀 연속으로 마우스를 테스트할 수 있습니다. 그런 다음 이틀 사이에 결과를 평균화할 수 있습니다. 중요한 것은, 후각 반응에 대한 연속적인 검사가 탐색적 행동에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 여겨진다는 것이다14.

냄새 제제와 관련하여, 용액은 테스트와 다른 방에서 준비되어야 하며, 실험자는 용액이 행동실에서 과도하게 확산되지 않는다는 것을 알고 있어야 합니다. 마지막으로, 용액은 가급적이면 테스트 직전에 준비하고 냄새가 나지 않는 유리 바이알에 보관하여 냄새가 사라지거나 오염되지 않도록 해야 합니다. 수컷 및 암컷 쥐의 소변과 같이 매우 식욕을 돋우는 것으로 추정되는 일부 냄새의 경우, 대조군 쥐가 매우 긍정적인 원자가와 관련된 탐색 판독값을 나타내지 않으면 용액을 확인해야 합니다. 특히, 쥐의 소변은 실험 직전(최대 2-3일 전)에 어린 쥐(최대 5개월)에서 갓 채취하여 4°C에서 보관해야 후각 특성을 보존할 수 있습니다. 주목할 점은 며칠 연속으로 채취하면 암컷 마우스의 발정 주기 단계로 인한 영향을 예방할 수 있습니다. 필요한 경우 장기 보관을 위해 소변을 -20°C로 보관할 수 있지만 이 절차는 냄새 강도를 현저히 줄여주므로 권장하지 않습니다. 마찬가지로, 땅콩 기름의 인지된 쾌적함도 예를 들어 배치나 브랜드에 따라 달라질 수 있습니다. 중요한 것은 두 가지 뚜렷한 냄새 또는 농도가 다른 냄새를 격실에 추가하여 무취 "제어 영역" 대신 두 가지 냄새 용액 간의 선호도를 측정할 수 있다는 것입니다.

마지막으로, 후각 선호도 테스트는 디자인을 개선하고 잠재적인 응용 프로그램을 확장하기 위해 다양한 방법으로 조정할 수 있습니다. 실제로, 운동 판독과는 별개로, 이 테스트를 통한 정서적 반응의 평가는 감정의 다양한 구성 요소를 측정하기 위해 다양한 기술을 결합함으로써 개선될 수 있습니다6. 예를 들어, 초음파 마이크를 경기장 옆에 배치하여 초음파 발성을 녹음할 수 있으며, 이는 특정 긍정적 및 부정적 자극에 대한 반응으로 방출될 수 있습니다24,39. 체온은 또한 적외선 카메라 또는 이식형 실시간 원격 측정 송신기를 사용하여 모니터링할 수 있습니다 40,41,42. 이러한 송신기 중 일부는 심장 및 호흡수에 접근할 수도 있습니다 43,44,45. 이러한 도구를 결합하면 정서적 반응에 대한 보다 정교한 행동 평가를 구축하는 데 도움이 될 것입니다. 후각 선호도 검사는 광유전학, 섬유 측광 또는 미니 스코프 라이브 이미징 또는 생체 내 전기 생리학 기록과 같은 감정 조절 장애 이면의 신경 메커니즘을 추가로 설명하기 위해 다른 기술과 쉽게 결합할 수 있습니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 인간 연구에서 감각 편향 및 쾌락적 후각 반응 평가를 통합하고 진단 또는 치료 반응 도구로도 사용함으로써 임상으로 쉽게 번역될 수 있습니다.

공개 사항

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 ANR(Agence Nationale de la Recherche)에서 관리하는 ANR(Investissements d'Avenir) 프로그램(참조 ANR-11-IDEX-0004-02 및 ANR-10-LABX-73), Agence Nationale de la Recherche(ANR-AAPG2021 "EMOKET"), 생명보험회사 "AG2R-La Mondiale", Ecole Doctorale 158(ED3C: Sorbonne Université, Université Paris Cité, Université Paris Sciences et Lettres)의 지원을 받습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2,4,5-트리메틸티아졸시그마-알드리치W332518-100G-K
2-트랜스 옥테날시그마-알드리치52464-1ML
블루택UHU해당 사항 없음
여과지피셔 사이언티픽1171012542.5 밀리미터
유리 바이알두처 도미니크958983
미네랄 오일시그마-알드리치M5904-500ML
놀두스 에토비전놀두스 에토비전버전 17.5또는 오픈 소스 ICY 소프트웨어 또는 Deeplabcut의 Single Mouse Tracker를 사용할 수 있습니다
페트리 접시송골매35100760mm x 15mm 페트리 접시, 직경 5mm의 맞춤형 구멍 7개
플렉시글라스 경기장맞춤 제작 해당 사항 없음45cm x 50cm x 25cm 플렉시글라스 경기장은 중앙에 있는 37cm x 25cm 벽으로 두 개의 방으로 나뉩니다.

참고문헌

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