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방법 논문

자유 부유 정상 인간 상피-섬유아세포 스페로이드 공동 배양 생성

1.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68440

⸱

2025년 7월 3일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Cell Biology (Cancer Research), Medical Faculty, University of Duisburg-Essen

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서는 매트릭스에 의존하지 않고 인간 폐 상피 세포와 섬유아세포의 직접 구상 공동 배양을 위한 간단하고 매우 실용적이지만 신뢰할 수 있는 프로토콜을 제시합니다.

초록

3차원(3D) 배양 시스템은 자연적인 세포 특성과 구조를 재현할 수 있는 능력으로 인해 점점 더 인기를 얻고 있으며, 이를 통해 조직과 유사한 구조를 in vitro에서 모방할 수 있습니다. 이러한 모델 중 반고체 세포외 기질(ECM)에 내장된 구형 세포 응집체(소위 스페로이드)의 배양은 세포-세포 및 세포-ECM 상호 작용의 결과, 산소 및 영양 구배의 결과로 다양한 기능적 세포 상태를 허용하기 때문에 진보된 근생체 세포 배양 모델을 나타냅니다. 스페로이드는 기술적으로 까다롭지 않고 상대적으로 저렴하기 때문에 약물 스크리닝 및 독성 테스트에 자주 사용되어 전임상 단계에서 신약 테스트를 위한 High-Content 스크리닝을 가능하게 합니다. 이를 위해 다양한 종양의 3D 구조가 주로 재현됩니다. 동시에 Matrigel은 현재 가장 널리 사용되는 ECM 중 하나이며 스페로이드 및 오가노이드 배양의 황금 표준으로 간주되지만, 일반적으로 동물 실험과 같은 추출은 주요 윤리적 문제와 관련이 있는 마우스 실험을 기반으로 하는 3D 매트릭스입니다. 여기에서는 인간 기관지 상피 세포와 섬유아세포의 직접 구상 세포의 공동 배양을 위한 매트릭스가 없는 프로토콜을 제시하며, 이는 특히 (동물 기반) 운반체 매트릭스에 의존하지 않고 각 스페로이드 내 상피-섬유아세포 통신 및 상호 작용과 관련하여 최적화된 공동 배양 방법으로 간주될 수 있습니다. 암 치료 접근법의 정상(폐) 조직 독성을 모델링하기 위한 환자 중심의 체 외 플랫폼으로서 이러한 자유 부유 상피-섬유아세포 스페로이드 공동 배양을 확립함으로써, 실험 동물의 수를 줄일 뿐만 아니라 해당 동물 실험을 적절하고 의미 있게 대체할 수 있습니다.

서론

세포 기반 연구 분석을 위해 편평한 단층 세포를 배양, 확장 및 도금하는 2차원(2D) 세포 배양은 표준 전임상 스크리닝 절차에 쉽고 편리하며 비용 효율적이고 널리 사용되는 방법으로 남아 있습니다 1,2. in vitro에서 다양한 유형의 세포 간의 상호 작용(파라크린) 누화를 연구하기 위해 다른 세포 유형의 자극을 위해 한 세포 유형의 조건화된 배지를 사용할 수 있습니다. 또한, 다양한 공동 배양 방법, 예를 들어 간접 방법, 예를 들어 공동 배양된 세포를 미다공성 멤브레인을 사용하여 물리적으로 분리하는 방법이 등장했습니다. 이러한 '트랜스웰 시스템'에는 기존의 2D 세포 배양 플레이트에 배치되는 인서트(미세다공성 멤브레인)가 포함됩니다. 그런 다음 한 세포 유형이 멤브레인에서 파종되고 성장하여 동반자 우물에서 자라는 다른 유형과 동일한 배지를 공유하여 양방향 부분비 통신을 가능하게 합니다2. 두 가지 세포 유형은 막의 양면에 파종되어 장벽 구조 조직을 조사하는 데 적합한 직접적인 세포 간 접촉 공동 배양을 더 많이 형성할 수도 있습니다 3,4.

그러나 이러한 첨단 2D 세포 배양 시스템의 세포 반응이 항상 해당 동물 실험 및 임상 연구의 결과를 반영하는 것은 아니며, 이는 무엇보다도 서로 다른 세포 유형 간의 직접 신호 부족으로 인해 생체 내 세포 조직이 부족하기 때문입니다. 따라서 3차원(3D) 배양 시스템은 자연과 유사한 세포 특성의 기능과 조직과 같은 구조를 모방한 구조로 인해 in vitro 5,6 점점 더 대중화되고 있습니다. 이러한 모델 중 반고체 세포외 매트릭스에 내장된 스페로이드(spheroid)라고 하는 구형 세포 응집체의 배양은 세포-세포 및 세포-ECM 상호 작용에 따른 다양한 기능적 세포 상태와 산소 및 영양의 구배를 달성할 수 있는 보다 발전된 세포 공동 배양 모델을 제공합니다7. 이처럼 더 복잡한 생체 내 유사 체외 배양 3D 배양은 세포 발달 및 분화를 촉진하는 동시에 세포 조립 크기에 따라 균일하게 생성되고 유지되어야 하는 동시에 효과적이고 빠르며 일관되고 편리해야 합니다 7,8.

자기 응집 및 접착의 자연적 특성을 사용하여 스페로이드(주로 종양 스페로이드)는 일반적으로 행잉 드롭 기법 9,10을 사용하여 생성됩니다. 배아체를 생성하는 데 사용되는 최초의 기술 중 하나인 행잉 드롭 분석은 마우스 기반이지만 세포 외 기질의 '황금 표준'인 Matrigel을 사용하여 ECM 포매링 전에 중력 및 표면 장력 원리를 기반으로 수많은 균질한 스페로이드를 생성하는 데 널리 사용되는 방법이 되었습니다. 스캐폴드가 없는 접근법 8,11에서 스페로이드를 생성하기 위해 상당한 노력을 기울였습니다. 예를 들어, 교반기가 있는 세포 배양 병을 사용하여 스페로이드를 생성할 수 있으므로 대규모로 스페로이드를 생산하는 가장 간단한 방법인 세포 파종을 방지할 수 있습니다12.

세포 배양을 복합화하여 실험실에서 생체 내와 유사한 시험관 내 대안과 같이 생리학적으로 가치 있는 시스템을 구축하는 데 있어 가장 어려운 것은 여러 단계(아직 확립이 필요함)가 있는 복잡한 프로토콜입니다. 예를 들어, 먼저 방법을 사용하여 세포 구조를 생성하고, 이를 수확한 다음, 매트릭스에 포함하는 것, 특히 다루기 쉽지 않은 매트릭스를 사용하는 것은 방법을 일상적으로 그리고 순차적으로 사용하기 전에 더 많은 설득력이 필요한 중요한 단계입니다. 여기에서는 폐 상피 세포와 섬유아세포의 복잡한 3D 스페로이드를 구축하기 위해 배양 기구에 세포를 거의 부착할 수 없는 96웰 형식의 초저 부착 플레이트를 사용했습니다. 생성된 스페로이드는 24시간 이내에 매우 균일하고 다소 빠르게 형성되어 실험 일정을 단축합니다. 장기간의 배양과 그에 따른 신뢰할 수 있는 세포 성장 및 분화가 전체 기간 동안 동일한 웰에서 수행되므로 초기 도금 후 전체 배양 기간 동안 배지만 교체하면 됩니다. 따라서 우리는 거의 생리학적 수준에서 기도 상피를 형태학적으로나 기능적으로 복제하는 인간 폐 스페로이드를 생성하기 위한 매우 간단하고 빠르며 매우 실용적인 프로토콜을 제시합니다. 또 다른 장점은 이 프로토콜이 다른 세포에 쉽게 적용될 수 있다는 것입니다.

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프로토콜

모든 단계는 멸균 조건(Biosafety cabinet)에서 수행됩니다. 본 연구에서 사용된 매체 조성물은 표 1을 참조한다.

1. 실험 재료의 준비

  1. 표준 인큐베이터13 을 사용하여 정상 상피 성장 배지에서 표준 플라스틱 세포 배양 접시(T75 플라스크)에서 인간 정상 폐 상피 세포(HBEC3-KT)를 배양하고 확장합니다( 표 1 참조).
    참고: 성장 개선을 위해 배지에 10% 태아 송아지 혈청(FCS)을 추가로 보충할 수 있습니다.
  2. 10% 태아 송아지 혈청과 페니실린/스트렙토마이신10,14가 보충된 RPMI 배지에서 인간 섬유아세포(HS-5)를 배양합니다(표 1 참조).
  3. DMEM/F12에 N-2, B27, 페니실린-스트렙토마이신, 소 혈청 알부민, 모노티오글리세롤, 아스코르브산, KGF/FGF7, FGF10, ATRA 및 CHIR99021를 보충하여 분지 폐 오가노이드 배지(BLO-Medium)를 준비합니다. ( 표 1 및 재료 표 참조).
    참고: 적어도 KGF/FGF7, FGF10, ATRA 및 CHIR99021를 추가하여 배지를 신선하게 준비하는 것이 좋습니다. 짧은 기간 내에 더 많은 배지가 필요한 경우 4°C에서 며칠(최대 1주일)의 짧은 보관 기간만 권장됩니다. 또는 상업적으로 이용 가능한 PneumaCult Airway Organoid Differentiation Medium을 사용할 수 있습니다.

2. 상피 세포 및 섬유아세포의 준비

참고: 세포가 약 80% 포화도에 도달할 때 두 가지 세포 유형을 모두 사용하십시오. 각 셀 유형을 개별적으로 준비합니다.

  1. 배양 배지를 제거하고 폐기하십시오.
  2. PBS 5mL로 세포층을 잠시 헹구어 세포를 세척합니다.
  3. 0.5% Trypsin-EDTA 2mL를 첨가하여 상피 세포를 트립신화한 후 37°C에서 4-8분 동안 짧은 배양합니다.
  4. 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 10% FCS가 보충된 PBS 또는 정상 성장 배지를 추가하여 둥글고 거의 분리된 세포를 수확합니다.
  5. T75 플라스크(성장 표면을 따라)에서 적절한 부피를 여러 차례 위아래로 피펫으로 주입하여 세포 덩어리를 추가로 분리하고 세포 현탁액을 15mL 튜브로 옮깁니다.
  6. TE 트립신화를 사용하여 37°C에서 3-5분 동안 HS5 섬유아세포를 각각 수확합니다.
  7. 원심분리(예: 실온[RT]에서 5분 동안 300-400 ×g )로 각 세포 유형(따라서 트립신이 없음)을 펠렛화하고 계수하기 전에 1-2mL의 정상 상피 성장 배지에 (상피 세포 및 섬유아세포 모두)를 재현탁합니다.
  8. 적절한 부피의 재현탁 세포를 사용하여 생존 가능한 세포 수를 결정하고; 각각 0.4% Trypan Blue Stain을 사용하여 1/5을 희석하여 현미경으로 Neubauer 계수 챔버에 넣었습니다.

3. 상피-섬유아세포 3D 스페로이드 배양의 생성

  1. 15mL 튜브를 사용하여 정상 상피 성장 배지에서 원하는 수의 세포를 희석합니다. 96개의 웰 플레이트의 각 웰에 대해 100μL의 배지에 50개의 섬유아세포가 있는 2,000개의 상피 세포를 계산합니다. 하나의 96 웰 플레이트에 적합한 결과 세포 수는 10mL의 정상 상피 성장 배지에 있는 200,000개의 HBEC 세포와 5,000개의 HS5 섬유아세포입니다.
  2. 10mL 멸균 혈청학 피펫을 사용하여 부드럽게 혼합합니다.
  3. 세포 현탁액을 다중 채널 마이크로피펫을 위한 멸균 시약 저장소로 옮깁니다.
  4. (12 채널) 멀티채널 피펫을 사용하여 100 μL의 세포 현탁액을 각 웰로 전달하여 세포를 초저 부착 플레이트에 파종합니다.
  5. 가습된 분위기에서 37°C 및 5% CO2 의 표준 세포 배양 조건으로 배양합니다.
    참고: 스페로이드 형성은 도립 현미경을 사용한 정기적인 현미경 검사와 원하는 각 시점에 대한 스페로이드 촬영을 통해 평가됩니다.
  6. 4일 후, 생성된 스페로이드에 웰당 100μL의 BLO-Medium을 첨가합니다.
  7. 가습된 분위기에서 37°C 및 5% CO2 의 표준 세포 배양 조건에서 추가로 배양합니다.

4. 정기적인 미디어 변경 수행

  1. 7-8일 후에 정기적인 미디어 변경을 수행합니다. 따라서 플레이트를 약간의 각도로 배치하여 스페로이드가 중력에 따라 기울어지는 방향으로 가라앉도록 합니다.
  2. 100-200 μL 피펫 팁으로 상층액을 조심스럽게 최대한 흡입합니다.
  3. 플레이트를 수평으로 재배치하고 웰당 100-150 μL의 BLO 배지를 채웁니다(멀티채널 피펫 사용).
  4. 가습된 분위기에서 37°C 및 5% CO2 의 표준 세포 배양 조건에서 추가로 배양하거나 실험/처리를 시작합니다.
    참고: 스페로이드는 더 오랜 기간(최대 21일) 동안 배양할 수 있습니다. 그런 다음 일주일에 최소 두 번 완전한 매체 변경을 수행해야 합니다.

5. 다운스트림 분석(스페로이드 수확)

  1. 스페로이드 크기 측정 및 부피 계산과 함께 사진을 촬영하여 정기적인 현미경 검사 및 문서화를 수행하여 최종적으로 스페로이드 성장 및 치료 후 잠재적 성장 변화를 정량화할 수 있습니다.
  2. 원하는 시점에서의 살아있는 세포 이미징을 위해 핵 염색을 위해 1 μg/mL Hoechst 33342(또는 DAPI)로 스페로이드를 추가로 15분 동안 배양하고 형광 현미경으로 분석합니다.
  3. 수확은 직경을 증가시키기 위해 배출구가 차단된 상태에서 200μL 피펫을 사용하여(멸균 유지) 원하는 시점에 생성된 스페로이드를 생성했습니다. 따라서 스페로이드를 포함하는 매체도 흡인하십시오. 2-5mL 튜브에 스페로이드를 결합하고 수집합니다. 2-5분 후 중력으로 인해 스페로이드가 가라앉으면 상층액을 제거하고 다운스트림 분석을 진행합니다.
  4. 전체 스페로이드 단백질 용해물을 생성하기 위해 수확된 스페로이드가 들어 있는 튜브에 얼음처럼 차가운 용해 완충액(150mmol/L NaCl, 1% NP40, 0.5% 나트륨-데옥시콜레이트, 0.1% 나트륨-도데실설페이트, 50mmol/L Tris/HCl, pH 8, 프로테아제 억제제 칵테일 보충)을 직접 첨가합니다. 2-3회의 동결 및 해동 주기 후에 용해물의 단백질 함량을 측정하고 다운스트림 분석(예: 웨스턴 블롯 분석15)을 진행합니다.
  5. 전체 스페로이드 RNA 용해물을 생성하려면, 수확된 스페로이드가 들어 있는 튜브에 RNA 용해 완충액을 직접 추가하고 사용된 각 RNA 분리 키트의 제조업체 지침에 따라 RNA 분리를 수행합니다.
  6. 면역조직화학(IHC) 및 면역형광 염색의 경우 5.6.1-5.6.3단계를 수행합니다.
    1. 수확된 스페로이드를 1-2mL의 4% 파라포름알데히드/인산염 완충 식염수(PBS)로 30분 동안 처리한 후 파라핀 포매 및 절단(3-5μm)을 실시합니다.
    2. 면역형광 염색 전에 일련의 내림차순 알코올을 사용하여 샘플을 준비하고 표적 회수 용액으로 배양합니다. 그 후, 차단 용액(2% 일반 염소 혈청/PBS)으로 슬라이드를 차단하여 불특이적 상호 작용을 줄이고 4°C에서 하룻밤 동안 1차 항체를 배양합니다.
    3. 형광 표지된 2차 항체로 항원을 검출합니다. DAPI로 핵을 counterstain합니다. 조직학적 평가를 위한 제조업체의 프로토콜에 따라 추가 염색(예: PAS 염색 키트)을 수행합니다.
  7. 단일 세포 현탁액의 경우 5.7.1 및 5.7.2 단계를 수행합니다.
    1. 수확된 스페로이드를 100 U/mL DNase I을 함유한 1-2 mL의 TrypLE에 재현탁시킨 후 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 2-5% FCS, 2mM EDTA 및 DNAse I을 함유한 PBS를 첨가하여 분해를 중지합니다.
    2. 다운스트림 분석(예: 유세포 분석 또는 단일 세포 분석) 전에 70μm 세포 스트레이너를 통해 세포 용액을 새로운 원뿔형 튜브에 전달합니다.
  8. 단일 세포 RNA 염기서열분석 분석의 경우 5.8.1-5.8.3 단계를 수행합니다.
    1. 제조업체의 지침에 따라 (human) single-cell multiplexing kit를 사용하여 서로 다른 시점 또는 처리를 나타내는 다양한 single-cell suspension에 라벨을 부착합니다.
    2. 나중에 샘플을 결합하고 10,000-40,000 셀을 목표로 단일 셀 카트리지의 레인에 로드합니다.
    3. 단일 세포를 검색하고, 제조업체의 지침에 따라 역전사 및 라이브러리 준비를 수행하고, 분리된 RNA의 염기서열을 분석합니다.

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결과

이 간단한 프로토콜은 초저 부착 플레이트와 함께 인간 기관지 상피 세포와 섬유아세포의 매트릭스가 없는 구상 배양을 가능하게 합니다(그림 1A). 배양 과정에서 초기에 생성된 스페로이드에서 더 복잡한 폐 스페로이드가 점진적으로 형성되며, 살아있는 세포 이미징(그림 1B), 면역조직화학(그림 1C) 및 면역형광(그림 1D)을 사용한 형태학적 분석을 통해 밝혀진 바와 같이 직접적인 세포 상호 작용을 나타내는 다양한 상피 및 섬유아세포 구조의 효율적인 생성이 이루어집니다). 공동 배양된 상피 세포와 각각의 세포를 구별하기 위해, Turquoise2(청록색) 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 발현하는 ('빈') 렌티바이러스 SIN 벡터를 사용하여 형광 표지된 인간 HS5 섬유아세포를 사용하였다1...

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토론

3D 세포 배양 모델은 2D 배양과 생체 내 연구 간의 격차를 해소하기 위해 제안되었는데, 이러한 유형의 (공동) 배양은 생체 내와 유사한 세포-세포 상호 작용, 세포-ECM 상호 작용, 자극에 대한 반응, 유전자 발현, 단백질 발현 및 분화가 더 많이 존재하기 때문에 생체 내에 존재하는 생리학적, 형태학적, 병리학적 특성을 더 잘 모방하기 때문입니다17, 18. 수많은 때로는 매우 복잡한 종양 스페로이드10,15,19,20 외에도 이러한 스페로이드는 정상 조직 검사 11,21,22에도 점점...

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공개 사항

저자는 개인적 또는 제도적 이해 상충이 없다고 말합니다.

감사의 글

훌륭한 기술 지원을 제공해 주신 Mohammed Benchellal, Eva Gau, Sabine Senkel, Olga Kruse에게 감사드립니다. 이 작업은 연방교육연구부(BMBF) (LuOrgNTT: 16LW0293 to D.K., SeniRad: 02NUK086C to V.J., D.K.) 및 DFG Research Training Group 2762의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
멸균 혈청학적 피펫 10mL ThermoFischer170356NNunc 멸균 혈청학적 피펫 또는 동급
15mL 원뿔형 튜브Corning430052또는 동급
37 ° C/ 5% CO2 가습  인큐베이터
5mL 멸균 혈청학적 피펫 ThermoFischer170355NNunc 멸균 혈청학적 피펫 또는 동등한 50
mL 원뿔형 튜브CorningCLS430829또는 동등한 ATRA
(All-Trans Retinoic Acid)StemCell TechnologiesCat#7226250 nM
B-27 보충제(50x), ThermoFischer/GibcoCat#175040441x
BD Rhapsody WTA Amplification KitBD BioscienceCat#633801제조업체의 지침에 따라 사용 생물
안전 캐비닛
혈청 알부민RocheCat#BSAVHS-RO0.4%(v/v)
셀 스트레이너Corning352350팔콘 70 & 마이크로; m 세포 스트레이너, 흰색, 멸균, 개별 포장
원심분리기Eppendorfhttps://www.fishersci.com/shop/products/eppendorf-5804-series-centrifuge-rotor-packages-9/p-4119001예: Eppendorf Centrifuge 5804 - 탁상용 원심분리기
DMEM/F12InvitrogenCat#11330-032500 mL
DNase I, RNase 없음(1  U/&무; L)ThermoFischerCat#EN0521100 U/mL 
EDTA(0.5 M), pH 8.0, RNase-freeThermoFischerAM9260G2 mM
Eppendorf Research 플러스 12채널 멀티채널 피펫 예를 들어 Eppendorf#3125000044 (10– 100 & 마이크로; L) 또는 #3125000060(30– 300 & 마이크로; L)
송아지 태아 혈청ThermoFischer/GibcoCat#A525670110% (v/v)
HBEC3-KT ATCCCRL-4051인간 정상 폐 상피 세포주 
헤파린 용액(0.2%)StemCell TechnologiesCat#79800.8mL
Hoechst 33342 써모피셔Cat#H13991 & 마이크로; g/mL
HS-5 ATCCCRL-3611인간 간질 섬유아세포
Hu Recom FGF-10 (KGF-2) ACFStemCell TechnologiesCat#78173.110 ng/mL
Hu Recom FGF-7 (KGF) ACF StemCell TechnologiesCat#78186.110 ng/mL
인간 단일 세포 다중 키트BD BioscienceCat#633781제조업체의 지침에 따라 사용
하이드로코르티신 원액 StemCell TechnologiesCat#7926500mL당 0.5mL
Laduviglusib(CHIR-99021)Biozol/SelleckchemCat#S12633 µ M
L-아스코르브산시그마-알드리치고양이#A9290250 µ g/mL
현미경ZEISS
모노티오글리세롤시그마-알드리치Cat#M61450.4 µ M
N-2 보충제(100x)ThermoFischer/GibcoCat#175020481x
Neubauer 계수 챔버MerckBR718605예: BRAND ); 계수 챔버 BLAUBRAND  Neubauer 패턴
일반 염소 혈청ThermoFischerCat#31873PBS
NP-40Merck/MilliporeCat#492016NP-40-Alternative, 1 %
PAS 염색 키트Sigma AldrichCat#1016460001제조업체의 지침에 따라 사용
PBSThermoFischerCat#100100231x
페니실린-스트렙토마이신(10.000  U/mL), 100xThermoFischer/GibcoCat#151401221x
PFAThermoFischerCat#J61899. AK파라포름알데히드, PBS
PneumaCult 기도 오가노이드 분화 배지(ODM)StemCell Technologies#05060PneumaCult 기도 오가노이드 기저 배지 (#05061, 360 mL) 및 PneumaCult 기도 오가노이드 분화 보충제* (#05063, 40 mL)
PneumaCult Ex Plus 배지StemCell TechnologiesCat#5040PneumaCult-Ex Plus Basal Medium(#05041, 490 mL) 및 PneumaCult-Ex Plus 50X Supplement*(#05042, 10 mL)로 구성된 키트
프로테아제 억제제 칵테일Merck/RocheCat#46931320011 탭/10 mL
Rhapsody cDNA 키트BD BioscienceCat#633773제조업체의 지침에 따라 사용
RPMI 1640 배지ThermoFischer/GibcoCat#11875093500 mL
염화나트륨머크/시그마-알드리치S9625150mmol/L
구연산나트륨머크/시그마-알드리치Cat#1613859-1G0.10%
데옥시콜레이트나트륨머크/시그마-알드리치Cat#309700.50%
도데실 황산나트륨 Merck/Sigma-AldrichCat#116672890010.10%
다중 채널 마이크로피펫용 멸균 시약 저장소(예: 60ml)ThermoFischer9510037또는 동등한
TC-Platte 96well BIOFLOAT a 4 Stü ckSarstedt (또는 facellitate)83.3925.400 (또는 F202003)초저 부착 플레이트
Tris / HClThermoFischerCat # AM9855G50 mmol / L, pH 8
Triton & nbsp; X-100시그마-알드리치고양이#X100-5ML0.05% 
판 블루 염색제(0.4%)ThermoFischerCat#152500611/5(v/v) NGM 함유
TrypLEThermoFischerCat#126040131x
Trypsin-EDTA(0.5 %)ThermoFischerCat#154000540.05% 트립신-EDTA(TE) 용액을 인산염 완충 식염수(칼슘 및 마그네슘 없음)를 사용하여 1X로 무균적으로 희석됨
WST-1 시약CELLPRO-RO, RocheCat#5015944001세포 증식 시약 
소 , ( Cat트리

참고문헌

  1. Rasouli, M., Safari, F. Principles of indirect co-culture method using Transwell. Methods Mol Biol. , (2024).
  2. Fontoura, J. C., et al. Comparison of 2D and 3D cell culture models for cell growth, gene expression and drug resistance. Mater Sci Eng C. 107, 110264(2020).
  3. Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Lab Invest. 84 (6), 736-752 (2004).
  4. Huang, X., et al. Current advances in 3D dynamic cell culture systems. Gels. 8 (12), 829(2022).
  5. Badr-Eldin, S. M., Aldawsari, H. M., Kotta, S., Deb, P. K., Venugopala, K. N. Three-dimensional in vitro cell culture models for efficient drug discovery: progress so far and future prospects. Pharmaceutics. 15 (8), 926(2022).
  6. Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World J Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
  7. Baarsma, H. A., et al. Epithelial 3D-spheroids as a tool to study air pollutant-induced lung pathology. SLAS Discov. 27 (3), 185-190 (2022).
  8. Shah, D. D., Raghani, N. R., Chorawala, M. R., Singh, S., Prajapati, B. G. Harnessing three-dimensional (3D) cell culture models for pulmonary infections: state of the art and future directions. Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol. 396 (11), 2861-2880 (2023).
  9. Ketteler, J., et al. Caveolin-1 regulates the ASMase/ceramide-mediated radiation response of endothelial cells in the context of tumor-stroma interactions. Cell Death Dis. 11 (4), 228(2020).
  10. Wittka, A., et al. Stromal fibroblasts counteract the caveolin-1-dependent radiation response of LNCaP prostate carcinoma cells. Front Oncol. 12, 802482(2022).
  11. Budeus, B., Kroepel, C., Stasch, L. M., Klein, D. Matrix-free human lung organoids derived from induced pluripotent stem cells to model lung injury. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 468(2024).
  12. Białkowska, K., Komorowski, P., Bryszewska, M., Miłowska, K. Spheroids as a type of three-dimensional cell cultures-examples of methods of preparation and the most important application. Int J Mol Sci. 21 (17), 6225(2020).
  13. Hansel, C., et al. Metformin protects against radiation-induced acute effects by limiting senescence of bronchial-epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (13), 7064(2021).
  14. Panic, A., et al. Progression-related loss of stromal caveolin 1 levels fosters the growth of human PC3 xenografts and mediates radiation resistance. Sci Rep. 7, 41138(2017).
  15. Sentek, H., Braun, A., Budeus, B., Klein, D. Non-small cell lung cancer cells and concomitant cancer therapy induce a resistance-promoting phenotype of tumor-associated mesenchymal stem cells. Front Oncol. 14, 1406268(2024).
  16. Steens, J., et al. Direct conversion of human fibroblasts into therapeutically active vascular wall-typical mesenchymal stem cells. Cell Mol Life Sci. 77 (17), 3401-3422 (2020).
  17. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: a powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncol Lett. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  18. Arora, S., et al. Spheroids in cancer research: recent advances and opportunities. J Drug Deliv Sci Technol. 100, 106033(2024).
  19. Chen, S., et al. 3D co-culture of lung cancer cells with CAFs: An in vitro model system to study tumor progression. J Vis Exp. , e20235(2025).
  20. Hey, S., Linder, S. A macrophage-tumor spheroid co-invasion assay. JoVE. (215), (2025).
  21. Miranda, G., et al. Cost-effective 3D lung tissue spheroid as a model for SARS-CoV-2 infection and drug screening. Artif Organs. 48 (7), 723-733 (2024).
  22. Celis, T., Bullens, D. M. A., Hoet, P. H. M., Ghosh, M. Development and validation of a human bronchial epithelial spheroid model to study respiratory toxicity in vitro. Arch Toxicol. 98 (2), 493-505 (2024).
  23. Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of normal human bronchial epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies. Sci Rep. 9 (1), 500(2019).
  24. Basil, M. C., et al. The cellular and physiological basis for lung repair and regeneration: past, present, and future. Cell Stem Cell. 26 (4), 482-502 (2020).
  25. Klein, D. Lung multipotent stem cells of mesenchymal nature: cellular basis, clinical relevance, and implications for stem cell therapy. Antioxid Redox Signal. 35 (3), 204-216 (2021).
  26. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. J Clin Invest. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  27. Shakir, S., Hackett, T. L., Mostaço-Guidolin, L. B. Bioengineering lungs: an overview of current methods, requirements, and challenges for constructing scaffolds. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1011800(2022).
  28. Budeus, B., Kroepel, C., Stasch, L. M., Klein, D. Free-floating human lung organoids derived from induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. , (2025).
  29. Li, C., et al. Establishing human lung organoids and proximal differentiation to generate mature airway organoids. JoVE. (181), e63684(2022).

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