방법 논문

동적 및 3차원 형광 현미경 사진을 통한 미토콘드리아 형태의 변화 이해

DOI:

10.3791/68478

⸱

2025년 8월 15일

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Stellenbosch University, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Electrical and Electronic Engineering, Stellenbosch University

이 논문에서

요약

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여기에서는 시간 경과에 따른 미토콘드리아 분열 및 융합 활동의 3차원 변화를 정량화하는 데 유용한 ImageJ 플러그인인 미토콘드리아 이벤트 로컬라이저(MEL)를 설명합니다. 또한 ImageJ에서 분석하기 전에 현미경 사진을 정리하는 데 유용한 이미지 처리 파이프라인에 대해서도 설명합니다.

초록

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미토콘드리아는 모든 동물의 생존에 필수적인 매우 역동적인 소기관으로, 숙주의 필요나 스트레스에 반응하여 규칙적인 분열 및 융합 사건을 겪어 미토콘드리아 네트워크의 지속적인 리모델링으로 이어집니다. 이 때문에 미토콘드리아 네트워크를 3차원으로 그리고 시간이 지남에 따라 평가할 수 있다는 것은 시스템이 스트레스나 약물 개입과 같은 요인에 어떻게 반응하는지 이해하는 데 이점을 제공합니다. 세포의 미토콘드리아 네트워크의 형광 이미징을 통해 이러한 변화를 시각화하고 모니터링할 수 있습니다. 그러나 미토콘드리아 네트워크는 종종 표준화되지 않은 메트릭으로 정의되는 2차원 및 정적 구조로 설명됩니다. 따라서 우리는 사용자가 미토콘드리아 네트워크의 핵분열 및 융합 이벤트를 시간 경과에 따라 3차원 방식으로 감지하는 ImageJ 플러그인 도구인 미토콘드리아 이벤트 로컬라이저(MEL)에 대한 이미지를 준비할 수 있는 파이프라인을 설명하기 시작했습니다. 또한 미토콘드리아 수의 변화와 형태학적 변화에 비추어 핵분열과 융합을 이해하는 것의 이점을 설명합니다.

서론

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미토콘드리아는 모든 진핵 세포에 존재하는 매우 역동적인 소기관으로, 진핵 세포에 에너지를 공급하고 신진대사를 조절합니다. 따라서 미토콘드리아는 세포 사멸과 생존의 교차로에 있습니다. 미토콘드리아는 리소좀 산성화 및 분자 운동 작용에서 근육 수축 및 시냅스 발화에 이르기까지 다양한 과정에 필수적인 것으로 나타났습니다 1,2.

미토콘드리아는 세포의 대사 요구와 스트레스에 반응하여 ATP를 효율적으로 생성하는 미토콘드리아 네트워크를 유지하기 위해 규칙적인 분열 및 융합 사건을 겪습니다. 실제로, 미토콘드리아는 미토콘드리아 단편의 선택적 제거인 미토파지를 촉진하기 위해 핵분열을 겪는 것으로 나타났습니다. 따라서 활발하게 호흡하고 탈분극되지 않은 미토콘드리아만 세포계에 남습니다 3,4. 그러나 융합은 수요가 증가할 경우 네트워크의 ATP 출력을 증가시키는 수단으로 발생합니다 5,6....

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프로토콜

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1. 세포 처리 및 현미경 획득

  1. 10% FBS 및 1% Penstrep(완전 배지)이 보충된 DMEM에서 8개의 챔버 접시에서 GT1-7 세포를 배양합니다. 세포가 하룻밤 동안 부착되도록 한 다음 10% FBS가 포함된 DMEM에서 만든 2.5mM 메트포르민 염산염으로 72시간 동안 처리하고 24시간마다 배지를 교체해야 합니다. 이미징 6시간 전에 10μM CCCP로 세포를 공동 처리하고 이미징 4시간 전에 400nM의 바필로마이신 A1(Baf)으로 세포를 공동 처리합니다.
    참고: 이것은 선택한 진핵 세포주로 수행할 수 있습니다.
  2. 이미징하기 전에 5 nM Hoechst 및 100 nM TMRE를 포함하는 예열된 완전 배지 칵테일을 준비합니다.
  3. 세포 처리 배지를 이미징 칵테일로 교체하고 이미징 전에 10분의 배양 시간을 허용합니다.
    참고: 미토콘드리아의 동적 활동으로 인해 배양 챔버가 37°C 및 5% CO 2로 설정된 현미경을 사용하여 세포를 이미지화해야 합니다.

2. 이미징

  1. 1.4 NA<....

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결과

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적절한 셀 선택
사용자는 미토콘드리아 네트워크가 세포의 유사분열 상태에 따라 변한다는 것을 알고 있어야 합니다. 핵이 덤벨 또는 U자형으로 보이거나 형광 신호가 부족한 핵 근처에 공간이 있는 경우 세포가 유사분열에 가까워지고 있음을 나타낼 수 있습니다. 이 상태에서 미토콘드리아는 치료 개입 및 네트워크에 미치는 영향 때문이 아니라 세포 분열로 인해 분열을 겪을 가능성이 높습니다(보충 그림 S8).

메트포르민은 미토콘드리아 융합을 유도하는 것으로 나타난 항당뇨병제입니다22. GT1-7 마우스 시상하부 세포를 미토콘드리아 분해를 억제하기 위해 400 nM의 바필로마이신 (Baf)로 4 시간 동안 처리하고, 미토콘드리아 탈분극을 유발하기 위해 6 시간 동안 10 μM CCCP 및 5 mM 메트포르민 염산염 (Metf)을 72 시간 동안 처리한 후 DMEM에서 TMRE 및 Hoe.......

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토론

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미토콘드리아 형태를 설명하기 위한 접근법이 점점 더 많아지고 있지만, 미토콘드리아 역학을 정량적 방식으로 적절하게 포착하는 데는 제한된 기술을 사용할 수 있습니다. 또한 미토콘드리아 네트워크 형태와 이 형태를 지배하는 메커니즘은 본질적으로 다양하다는 점에 유의해야 합니다. 그 결과 향상된 에너지 출력을 위한 분지 형성부터 미토파지를 촉진하기 위한 시간적으로 뚜렷한 분열 영역에 이르기까지 세포의 요구와 연결된 네트워크가 생성됩니다24,25. 이 프로토콜은 세포에서 미토콘드리아 분열 및 융합 사건의 변화를 측정하여 3D 및 시간 경과에 따른 동적 미토콘드리아 변화에 대한 통찰력을 제공하는 것을 목표로 합니다. 획득 및 분석 파이프라인은 TMRE로 염색된 미토콘드리아의 잠재적인 광표백을 보상하여 필요한 경우 이미징 시간을 연장하려는 시도를 제시했습니다.

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공개 사항

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저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 남아프리카 공화국 스텔렌보스 대학교, 남아프리카 의학 연구 위원회(SAMRC), 남아프리카 국립 연구 재단(NRF), 캐나다 보건 연구소(CIHR) 및 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회(NSERC)의 자금 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
8 챔버 접시써모피셔#Z734853
조정된 임계값https://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold
바필로마이신 A1LKT 연구소#B0026
카르보닐 시안화물 클로로페닐히드라존(CCCP)머 크#C2759
공초점 현미경칼 자이스 AGLSM780 ELYRA PS.1 초고해상도 플랫폼
Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)써모피셔#341956062
태아 소 혈청(FBS)시그마-알드리치#F0679
깃허브 링크https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin
그래프패드 프리즘 v7.06
GT1-7 셀ATCCSCC116 시리즈
회쉬트시그마-알드리치H6024
이미지J v1.53t피지
매크로https://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections
메트포르민유럽 약전M06050000
페니실린/스트렙토마이신(PenStrep)시그마-알드리치#P4333
T25바이오 스마트 사이언티픽#70025
TMRE써모피셔#T669
트립신시그마-알드리치#T4049

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
  2. Bhabha, G., Johnson, G. T., Schroeder, C. M., Vale, R. D. How dynein moves along microtubules. ....

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재인쇄 및 허가

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태그

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