동시 관류 매핑을 통한 Ameroid Constrictor 배치에 의한 만성 심근 허혈의 임상적으로 관련된 돼지 모델

요약

이 프로젝트의 목표는 근위 좌회선 관상동맥(LCx) 주위에 아메로이드 수축기를 외과적으로 배치하여 만성 관상동맥 질환을 유도하고 동위원소 표지 마이크로스피어를 사용하여 허혈 영역을 정확하게 매핑하는 철저하게 면밀한 프로토콜을 자세히 설명하는 것입니다.

초록

심혈관 질환 치료를 위한 의료 및 절차 요법의 획기적인 발전에도 불구하고 진단 도구와 치료 전략을 조사하기 위해 중개 대형 동물 모델의 필요성은 지속되어 왔습니다. 돼지는 심장 해부학과 생리학, 대사 및 단백질체 프로필이 인간과 매우 유사하기 때문에 인간 심혈관 질환에 대한 흠잡을 데 없이 정확하고 적절한 모델을 나타냅니다. 아메로이드 수축기를 사용하여 심근 부위에 만성 심근 허혈을 유도하는 것은 인간의 죽상동맥경화증 발달 및 후속 심근 반응의 일반적인 병태생리학적 과정을 정확하고 쉽게 모방합니다. 아메로이드 수축체는 지난 50년 동안 널리 연구되어 그 사용에 대한 엄격한 증거를 제공했습니다. 또한 우리는 이 절차를 효율적이고 균일하게 수행하는 데 20년 이상의 경험을 가지고 있습니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 동위원소 표지 마이크로스피어를 주입하여 가장 큰 허혈 영역과 허혈이 없는 영역을 결정하기 위해 관상 동맥 혈류 매핑을 수행하는 것입니다. 관상 동맥 혈류 매핑을 수행할 수 있는 능력은 관류 연구 및 허혈 영역 결정을 위해 심장 MRI 또는 PET 영상을 필요하고 노동 집약적으로 사용하는 것을 배제합니다. 이 간행물의 목표는 근위 LCx에 아메로이드 수축기의 올바른 배치와 후속 관상 동맥 관류 매핑을 자세히 설명하는 것입니다.

서론

전 세계적으로 허혈성 심장 질환(IHD)은 사망률과 환자와 의료 시스템에 대한 부담이 증가하고 있습니다. 미국심장협회(American Heart Association)에 따르면 1990년부터 2021년까지 IHD로 인한 사망자 수는 전 세계적으로 74% 증가했습니다^1. 이는 미국 내에서도 마찬가지이며, 질병 통제 센터는 성인 20명 중 1명이 관상 동맥 질환(CAD) 진단을 받았으며 사망자 5명 중 약 1명은 심혈관 질환으로 인한 것이며, 이는 33^초마다 심혈관 질환으로 사망하는 사람에 해당합니다. 이러한 질병 부담은 2019년부터 2020년까지 심혈관 질환 환자에게 2,500억 달러 이상이 지출된 의료 시스템에 스트레스를 줍니다². 심혈관 질환의 편재적 특성과 환자와 제공자 모두에게 심각한 부담을 감안할 때 혁신적이고 새로운 치료법에 대한 연구를 계속하는 것이 필수적입니다.

이러한 목표를 달성하려면 임상적으로 관련된 동물 모델을 사용해야 하지만 재현 가능하고 중개 연구의 표준을 충족하도록 면밀히 조사해야 합니다. 동물 모델은 다양한 약동학을 가진 이질적인 동물 종, 원하는 질병 상태를 유도하기 위한 서로 다른 프로토콜, 약물 투여 및 일정의 변화, 무작위 배정 동물의 열악한 표준화, 추적 기간 및 조사자의 눈가림, 마지막으로 소규모 실험 그룹³. 우리는 IHD뿐만 아니라 수술 프로토콜, 동물 무작위화, 약물 전달 및 기간, 후속 결과를 나타내기 위해 전체 동물 모델의 프로토콜을 실험적으로 개선하고 표준화했습니다. IHD와 관련하여 돼지는 심장 해부학 및 생리학에서 인간과 상당한 유사성으로 인해 최적의 동물 모델을 나타냅니다. 중요한 것은 돼지가 인간과 유사한 관상 동맥 분포와 최소한의 측부 순환을 가지고 있어 허혈 유도가 인간의 죽상동맥경화증 발병을 신뢰할 수 있게 표현한다는 것입니다. 또한 돼지는 인간과 유사한 신진대사, 단백질체 프로필 및 면역 체계를 가지고 있어 치료제의 분자적 영향을 분석하는 것이 더 의미 있습니다⁴. 이를 염두에 두고, 이 프로토콜에 사용된 동물 모델은 인간 심혈관 병태생리학을 재현 가능하게 표현하는 데 가장 적합합니다.

우리 연구실은 LCx에 아메로이드 수축제를 외과적으로 배치하여 심근 허혈의 만성 유도를 허용합니다. 이 기술을 사용하여 만성적으로 허혈을 유도하면 급성 결찰에 비해 고유한 이점이 있습니다. 하나는 이 장치를 사용한 수십 년 동안의 광범위한 연구 문헌입니다⁵. 또한, 인간의 죽상동맥경화증 발달로 인한 점진적인 관상동맥 협착에 대한 신뢰할 수 있는 임상 시뮬레이션이 가능하며, 마지막으로 완전한 혈류가 중단되었을 심근을 보존함으로써 동물 사망률을 개선할 수 있습니다⁶. 아메로이드 수축기는 티타늄 외부 링과 내부 흡습성 플라스틱 층의 두 부분으로 구성됩니다. 관상 동맥 주위에 배치하면 내부 링은 체액을 흡수하고 2-4주 동안 제한적인 강철 슬리브로 인해 안쪽으로 부풀어 오릅니다⁷. LCx 주위에 배치하는 전략은 3개의 주요 관상 동맥 중 가장 작고 심근의 약 20%에 영향을 미치기 때문에 사망률 이점을 제공합니다⁷. 허혈 부위를 균일하게 생성하려면 둔감 변연 동맥을 분기하기 전에 아메로이드를 LCx 테이크오프에 배치해야 합니다.

이 프로토콜에서 사용하는 추가 고려 사항은 허혈의 유도를 결정하고 치료제의 심근 효과를 조사할 때 올바른 영역의 사용을 결정하기 위한 확증적 관상 동맥 혈류 매핑입니다. 이를 위해 LCx가 완전히 폐색된 아메로이드 배치 시 BioPhysics Assay Laboratory, Inc.의 금 마이크로스피어 주입을 사용합니다. 금 마이크로스피어의 정량화가 가장 낮은 섹션은 가장 허혈적인 좌심실 영역을 나타냅니다. 실험적 처리에 의해 생성된 분자 변형을 결정할 때 매핑의 중요성은 아무리 강조해도 지나치지 않습니다. 또한, 동위원소 표지 마이크로스피어의 사용은 심근 관류 8 결정을 위한 심장 자기 저항 영상과 비교하여 비용 효율적인 방법을^{제공합니다.}

마지막으로, 여기에 설명된 모델은 심혈관 질환의 발달 및 후속 치료 반응에서 성별 간 잘 알려진 차이를 고려합니다. 너무 자주 전임상 동물 모델은 인간 집단의 차이를 충실하게 표현하지 못합니다. 따라서 우리는 암컷 돼지와 온전한 수컷 돼지 사이의 대조군과 실험군에서 사용되는 돼지의 성별을 일치시킵니다. 우리는 이전에 새로운 치료법에 대한 성별 기반 반응을 결정하기 위해 이것을 사용했습니다⁹. 이 프로토콜의 번역 가능성에 추가되는 것은 치료 그룹의 무작위화와 각 돼지의 심장 기능 및 심근 관류 매개변수를 분석하는 조사자의 눈가림을 사용하는 것입니다.

프로토콜

아래에 자세히 설명된 수술 절차는 로드 아일랜드 병원과 브라운 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 동물 모델

1. 어린 암컷 돼지와 온전한 수컷 요크셔 돼지를 모두 사용하며, 이상적으로는 생후 약 11주이고 일반적으로 체중이 약 15kg입니다.

2. 수술 전 절차

1. 돼지가 수술 1일 전부터 수술 후 5일까지 매일 수술 전후 아스피린(10mg/kg)을 투여받도록 합니다.
2. 수술 당일 아침에 돼지가 음식을 먹지 않았는지 확인하십시오.
3. 수술 당일 텔라졸(4.4mg/kg)과 자일라진(2.2mg/kg)을 근육주사하여 마취를 유도한다.
4. 적절한 크기(일반적으로 7-0) 커프가 있는 기관내관으로 돼지를 삽관합니다.
5. 동시에 부프레노르핀을 0.03mg/kg으로 투여하고 펜타닐 패치(4μg/kg)를 도포하여 진통을 달성합니다.
6. 20-22G 정맥(IV) 카테터를 큰 귓바퀴 정맥에 삽입합니다.
7. 5mL/kg/h의 속도로 IV 수액(0.9% 식염수)을 시작합니다.
8. 광범위한 세팔로스포린 항생제인 세프티오푸르를 투여합니다. 이것은 일반적으로 단일 용량 IM 주사로 절개 후 30분 이내에 수행됩니다.
9. 수술 부위(왼쪽 어깨에서 배꼽까지)와 리드 위치를 모니터링하는 심전도(ECG)에서 돼지를 면도합니다.
10. 돼지를 수술실로 이송하고 0.75-3.0% 이소플루란으로 마취를 유지합니다.
11. 돼지를 ECG 모니터에 연결하고 전기 소작 접지 패드를 적용합니다.
12. 돼지를 수술대에 올바르게 배치하십시오: 오른쪽이 아래로 향하게, 왼쪽 앞다리를 펴고 테이블에 묶고, 테이블의 오른쪽을 위로 기울입니다.
13. 2% 클로로헥시딘 스크럽으로 수술 부위를 준비합니다.
14. 4개의 작은 접착식 드레이프와 1개의 큰 개복술 드레이프로 절개 부위를 드레이프합니다.

3. 수술 절차

1. 예상 절개 부위에 2% 리도카인을 피하 주사하는 것으로 시작합니다.
2. 그런 다음 #10 메스를 사용하여 겨드랑이 피부 주름 근처에서 시작하여 비스듬히 약 5cm 절개를 하고 측면으로 진행합니다. 이것은 2^번째 에서 3^번째 늑간 공간 부근입니다.
3. #10 메스를 사용하여 근막층에 도달할 때까지 근육층을 통해 이 절개를 계속합니다.
4. 이때 전기 소작술을 사용하여 피부와 근육의 지혈을 달성하십시오.
5. 쇄골을 만져질 수 있을 때까지 근막 부위를 위쪽으로 뭉툭하게 엽니다.
6. 이것이 달성되면 갈비뼈 공간을 촉진하여 2^번째 갈비뼈 공간이 식별되었는지 확인합니다.
   참고: 일반적으로 2^번째 늑간 공간은 필드의 약간 우수한 시야를 달성하여 아메로이드 수축체를 더 쉽게 근위부에 배치할 수 있습니다. 때로는 돼지 해부학으로 인해 제3^늑 간강을 들어가야 하는 경우도 있습니다.
7. 전기 소작술로 늑간근에 점수를 매기고 큰 Kelley 클램프로 흉막강으로 들어갑니다.
8. 전기 소작술로 이 개구부를 내측 및 외측으로 확장하면서 큰 Kelley 클램프를 지침으로 사용하여 폐와 심낭을 보호합니다.
9. 갈비뼈를 벌리기 위해 작은 Finochietto 견인기를 도입하십시오.
10. 젖은 거즈를 놓아 폐를 왼쪽 흉막강으로 밀어 넣습니다. 이것은 심낭의 시야를 확장합니다.
11. Debakey 집게를 사용하여 심낭을 텐트하고 Metzenbaum 가위로 작은 절단을 합니다. 이것을 내측 및 측면으로 확장하여 좌심방이가 노출됩니다. 폐를 향해 측면으로 확장할 때 폐와 횡격막 신경을 식별하고 보호합니다.
12. 필요에 따라 3-0 실크 봉합사를 사용하여 심낭을 고정합니다.
13. 작은 새틴스키 클램프를 사용하여 좌심방이의 원위 부분을 잡고 0-실크 타이를 사용하여 이 부분을 결찰합니다. 작은 지혈제를 사용하여 부속기를 집어넣어 LCx와 LAD를 노출시킵니다(그림 1A).
14. 혈관이 노출되면 Gerald 겸자로 전환하고 왼쪽 주요 관상 동맥에서 이륙하는 근처의 LCx 위에 있는 심외막 지방에 Metzenbaum 가위로 작은 상처를 만듭니다.
15. Allis 클램프에 작은 직각과 땅콩 스펀지를 사용하여 LCx를 조심스럽게 해부합니다. 동맥 주위를 직각으로 돌면 혈관 루프를 배치하여 완전히 분리합니다. 양쪽 끝에 작은 지혈제를 놓습니다.
16. 이때 혈전 형성을 방지하기 위해 돼지를 80 IU/kg으로 전신적으로 헤파린화합니다.
17. 심근 관류 매핑을 수행합니다.
    참고: 이 절차에는 두 명의 도우미가 필요합니다. 2분 동안 시간을 할애할 수술실 기술자인지 확인하십시오. 다른 하나는 수술 보조원이어야 합니다.
    1. 조수에게 LCx를 완전히 폐색하기 위해 혈관 루프를 부드럽게 집어넣도록 지시합니다. ECG 모니터에서 ST 세그먼트 및/또는 T파 변화를 보고 폐색을 확인합니다.
    2. 폐색의 처음 30초 동안 28G 바늘을 사용하여 5mL의 금 마이크로스피어를 좌심방이에 주입합니다(그림 1B). 주사의 중간 지점에서 주사기를 다시 당겨 혈액을 시각화합니다. 이는 좌심방 내에서 바늘의 올바른 위치 지정과 후속 정확한 매핑을 보장하는 데 중요합니다.
    3. 주사를 마친 후 땅콩 스펀지를 사용하여 지혈이 이루어질 때까지 주사 부위에 압력을 가합니다. 압력으로 지혈이 이루어지지 않으면 6-0 폴리프로필렌 봉합사로 작은 8자 봉합사를 배치합니다.
    4. 수술 보조원에게 ECG 변화를 시각화하면서 전체 2분 동안 혈관 루프를 계속 집어넣어 LCx의 폐색을 보장하도록 지시합니다.
18. 2분 후 ECG 변화가 가라앉으면 근위 LCx 혈관 주위에 아메로이드 수축기를 배치합니다. 크기 조정은 일반적으로 2.0mm에서 2.75mm 범위의 육안 검사를 기반으로 합니다. Allis 클램프 또는 Kelly 클램프에서 아메로이드를 잡으면 더 쉽게 적용할 수 있습니다(그림 1C). 아메로이드가 잘 윤활되어 있는지 확인하십시오.
19. 수술 조수가 Gerald 집게 및/또는 땅콩 스폰지로 해부로 생성된 주머니를 집어넣어 공간을 열도록 합니다. 열쇠 구멍을 통해 아메로이드를 동맥으로 부드럽게 안내하고 열쇠 구멍이 바깥쪽으로 회전하는지 확인합니다(그림 1D).
20. 아메로이드가 위치에서 가능한 한 근위부에 있는지 확인하십시오. 이는 배치 및 후속 허혈 영역의 균일성을 유지하는 데 도움이 됩니다.
21. 혈관 루프를 제거하고 국소 니트로글리세린(~2mL)을 동맥에 분사하여 추가 혈관 경련을 방지합니다.
22. 심방이의 넥타이를 자르고 제자리로 되돌립니다.
23. 역 경사(RB) 바늘에 실행 중인 3-0 흡수성 봉합사를 사용하여 심낭을 닫습니다.
24. 젖은 거즈를 꺼내 폐를 집어넣고 부상이 있는지 검사하는 것을 잊지 마십시오.
25. 뭉툭한 끝 바늘에 0 폴리디옥사논 봉합사(PDS)를 사용하여 갈비뼈 공간을 재근사화합니다.
26. 3-0 흡수성 봉합사로 근육층을 봉합하고 거의 닫히면 흡입에 연결된 작은 빨간색 고무 카테터를 흉막강으로 삽입합니다. 주치의가 최종 봉합사를 묶을 때 숨을 참고 조수가 빨간색 고무를 구멍 밖으로 빼내도록 합니다. 이렇게 하면 흉막강 내의 모든 공기가 배출됩니다.
27. 3-0 흡수성 봉합사로 피하층을 닫고 피부를 피하 4-0 모노크릴 봉합사로 닫습니다.
28. 절개 부위에 멸균 드레싱을 놓습니다.

4. 수술 후 관리 및 회복

1. 이소플루란의 젖을 떼기 시작합니다.
2. 돼지가 깨어날 때까지 기다리는 동안 거즈와 탄성 랩으로 절개 붕대를 고정합니다.
3. 돼지가 스스로 숨을 쉬면 기관내관을 제거합니다.
4. 돼지가 열 지원이 있는 패딩 처리된 회복 케이지에서 수의사 팀의 감시 하에 회복할 수 있도록 하십시오.
5. 다시 말하지만, 아스피린은 혈전 위험을 완화하기 위해 수술 후 5일째까지 계속됩니다. 수술 전 펜타닐 패치를 부착하여 3일 동안 유지하여 진통을 달성합니다.
6. 3일 동안 돼지에 대해 하루에 두 번 수술 후 검사를 완료하십시오. 일반적으로 돼지는 이 기간 동안 부정맥이나 경색을 경험하지 않습니다.
   참고: 수술 후 14일경에는 조기 아메로이드 폐쇄 및/또는 자발성 심실성 부정맥이 발생할 가능성이 더 높다는 점에 유의하십시오. 그룹은 토론에서 검토되는 아미오다론 또는 리도카인과 같은 예방적 항부정맥제로 이 기간의 문제를 해결할 수 있습니다. 또한 지속적인 ECG 모니터링을 활용할 수 있습니다. 그러나 그것은 상당히 노동 집약적이며 돼지에서 유지하기가 어렵습니다.

결과

위의 절차를 수행한 지 20년 이상 수행한 생존율은 약 80%^{입니다10,11}. 대부분의 사망률은 수술 후 약 2주에 발생하며, 종종 아메로이드 폐쇄 시 돌이킬 수 없는 자발적인 심실 부정맥으로 인해 발생합니다. 이전의 여러 부검에서 전형적인 소견은 좌심실의 급성 흉터 형성이 최소화된 적절하게 배치된 아메로이드를 보여주어 심실성 부정맥 진단을 확인합니다. 부정맥은 심장 돌연사로 이어지며, 이는 어떤 동물에서 발생할지 예측하기가 매우 어렵습니다. 따라서 우리는 수술 후 처음 2주 동안 지속적인 ECG 모니터링을 고려했습니다. 그러나 적절한 ECG 추적을 유지하기 위한 침습적 특성과 작업량이 모니터링의 유용성보다 더 큰 것으로 확인되었습니다. 2주가 지나면 생존율은 100%에 가깝습니다.

이 절차의 가장 중요한 결과는 차등 심근 관류 매핑일 것입니다. 금 마이크로스피어 정량화를 통...

토론

아메로이드 수축기 사용의 주요 장점은 장치의 단순성입니다. 그러나 이는 관상동맥 주변의 폐쇄율이나 협착 정도를 제어할 수 없다는 한계를 나타냅니다. 이것은 심근 허혈 유도의 가변성으로 이어질 수 있습니다. 아메로이드 수축기 사용에 대한 대안에는 실크 타이, 유압 폐색기 또는 유량 프로브 12,13,14,15,16의 연속 배치가 포함됩니다. 실크 타이와 폐색기의 사용은 종종 주어진 관상 동맥의 정확한 폐색 비율을 제공하는 고정 협착 모델을 만드는 데 사용되지만 종종 더 높은 사망률로 상쇄됩니다^12,15

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
#10 메스	메드라인	MDS15310
0.9% 식염수	데크라/베티벡스	17033-492-50	속도: 케이스 중 5mL/kg
0-실크 넥타이	에티콘	SA76G	좌심방이 묶기
CT 무딘 팁의 1-0 PDS II	에티콘	Z359T	리브 공간 닫기
2% 리도카인	불사조		투약: 2– 5 mg / kg
SH 테이퍼에 2-0 실크 봉합사	에티콘	K833H	점정 심낭
28 게이지 바늘	패터슨 수의학	78032728	마이크로스피어 주입용
3 18G 바늘	패터슨 수의학	78032793	약을 그리기 위해
3-0 RB 테이퍼의 Vicryl	에티콘	VCP215H	심낭 닫기
3-0 Vicryl 리버스 커팅	에티콘	VCP442H	근육층과 깊은 진피층을 닫습니다.
4-0 모노크릴	에티콘	MCP496G	피부 닫기
6-0 폴리프로필렌 봉합사	SharePoint	JS617N	심방의 긴급 수리용
모든 수술 기구	스테리스와 메드라인	영업 담당자 필요	모두 병원 수술실에서 흔히 볼 수 있습니다.
아메로이드 뱀	연구 기기 SW, Inc.	CS-2.00-TI	종류: 티타늄 (2.0 cm에서 3.0 cm)
진통제: 부프레노르핀	호스피라	브랜드 이름: 부프레딘	투여량: 0.03mg/kg
진통제: 펜타닐 패치	코베트러스	77870	복용량: 4mg/kg
마취: 텔라졸	조에티스	(틸레타민과 졸라제팜)	투여량: 4.4mg/kg
마취: 자일라진(롬푼)	데크라	해당 사항 없음	투여량: 2.2mg/kg
클로르헥시딘 4%	BD EZ 스크럽	371073	수술 준비
커프가 있는 기관내관	러쉬	일반적으로 7-0	돼지 크기와 체중에 따라 다른 크기가 필요할 수 있습니다.
ECG 모니터링 시스템	미드마크	해당 사항 없음	다중 매개변수 모니터
전기 소작	보비 스페셜리스트 프로	1250초
초과(세프티오푸르)	코베트러스	23814	단일 용량 IM 주사
골드 STERIspheres	바이오팔, Inc.	C-15H20	양: 수술당 5cc
이소플루란, USP	데크라		투여량: 0.75%– 3.0%
미니 백색 혈관 루프(X선 감지 가능)	디로얄	30-711	LCx를 분리하려면
여러 개의 5cc 주사기	메드라인	TMOSS05L	다중 주입용
니트로글리세린	백스터	5% 포도당 주사제의 니트로글리세린(200mcg/mL)	스프레이 2– 국소 3cc
빨간색 고무 카테터	카디널 헬스	888766008	공기를 빼내기 위해 가슴에 넣으십시오
멸균 장갑	앙코르	820955
흡입 시스템	곰코	4042	자체 설비의 벽면 흡입이 더 좋습니다.
흡입 팁: Yankauer	메드라인	DYND50130
수술용 드레이프	Patterson 수의학 일반 외과 팩	78929436	작은 접착 드레이프 4개와 큰 개복술 드레이프 1개
수술용 윤활제	서지루브	0281-0205-43	멸균 상태여야 합니다.
전신 헤파린	코베트러스	82496	복용량: 80 IU/kg
요크셔 돼지	CBSET, Inc.	해당 사항 없음	이상적으로는 생후 11주 정도