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방법 논문

배근 신경절 배양의 체외 모델 확립: 암-신경 누화 조사를 위한 보완적 접근 방식

2.7K 조회수

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DOI:

10.3791/68552

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2025년 7월 11일

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1Division of Cancer Biology and Genetics, Sinclair Cancer Research Institute, and Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Laboratory of Mutagenesis and Oncogenetics, Department of General Biology - Center for Biological Science, State University of Londrina

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 마우스 등뿌리신경절(DRG)의 전체 마운트 및 해리 배양을 확립하는 방법과 종양-신경 상호 작용을 평가하는 데 사용하는 방법을 설명합니다.

초록

종양 미세환경에 대한 신경계의 기여와 암 전파의 경로로서 신경 침습의 중요성이 점점 더 인식되고 있습니다. 암세포와 뉴런의 상호 작용은 암 세포가 신경 주위와 신경 내부로의 침입을 촉진할 수 있으며, 이는 임상 결과가 좋지 않은 많은 암의 특징입니다. 뉴런과 암세포 간의 상호 상호작용을 연구하기 위한 체외 모델은 암 확산을 이해하고 이를 완화하기 위한 접근 방식을 식별하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

여기에서는 쥐 등뿌리 신경절(DRG) 분리를 위한 프로토콜과 시간 경과에 따른 뉴런 형태 및 신경돌기 성장을 시각화하는 데 사용할 수 있는 전체 마운트 및 해리 단층 배양물의 확립에 대해 설명합니다. Matrigel에 장착된 전체 DRG는 생체 내 신경과 더 유사한 이질적인 환경에서 신경 구조와 자극에 대한 반응을 보존하는 반면, 해리된 신경 배양을 통해 직접적인 세포-세포 상호 작용을 보다 면밀하게 평가할 수 있습니다. DRG 배양이 확립되면 암세포를 추가하여 암세포에 대한 반응으로 신경돌기 성장 및 신경 형태의 변화를 시각화하는 데 사용할 수 있는 공동 배양을 생성할 수 있습니다. 시간이 지남에 따라 또는 성장 자극 또는 억제 조건 하에서 신경 유래 신호에 반응하는 암세포의 성장 또는 운동성을 평가할 수 있을 뿐만 아니라 암세포와 신경 확장 사이의 직접 접촉의 영향을 시각화할 수 있습니다.

두 가지 공동 배양 모델을 동시에 생성할 수 있기 때문에 이 프로토콜은 암-뉴런 상호 작용의 영향에 대한 보다 포괄적인 관점을 제공하고 치료 조건의 비교와 세포 수준 및 전체 신경절의 정보 통합을 용이하게 합니다. 이 프로토콜은 신경-종양 상호 작용에 대한 연구를 용이하게 하며 세포 신호 연구, 약물 스크리닝 또는 종양-신경 환경의 이질성 및 신경을 따른 종양 전파 메커니즘에 대한 연구를 포함하여 광범위한 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

서론

국소 침입 및 국소 또는 원격 전이를 통한 종양 전파는 암 관련 사망의 주요 원인입니다. 연구는 혈관 또는 림프액 전이 경로에 초점을 맞추고 있지만, 췌장 1,2, 전립선3, 두경부4, 유방5, 결장 직장6 암을 포함한 많은 고형 종양에서 종양 세포의 신경 침입이 자주 관찰됩니다. 최근 몇 년 동안 수많은 연구에서 종양의 성장과 진행을 촉진하는 신경의 새로운 역할, 그리고 전이 발달을 주도하는 전파 경로로서의 새로운 역할을 강조하고 있습니다 7,8. 이러한 맥락에서 암 신경과학은 저명한 연구 분야로 부상했으며, 종양 세포와 이러한 과정에 기여할 수 있는 말초신경계(PNS)의 기본 구성 요소 간의 상호 작용을 규명함으로써 종양학의 새로운 관점을 제공합니다 8,9.

PNS는 말초신경(peripheral nerves)과 신경절(ganglia)로 구성되며, 이들은 다양한 크기와 기능을 가진 뉴런(neuron), 슈반(Schwann) 및 기타 신경교세포(glial cell), 섬유아세포(fibroblast), 대식세포(macrophage), 비만세포(mast cell), 멜라닌세포(melanocyte), 국소 혈관구조를 형성하는 혈관 내피 세포(vascular endothelial cell) 등 다양한 세포 유형으로 구성된 이질적인 구조이다10. PNS는 종양 미세환경(TME)의 중요한 구성 요소이며, 신체 접촉을 통해 직접 또는 신경 영양 인자, 신경 전달 물질, 성장 인자 및 기타 신호의 방출을 통해 간접적으로 암세포와 신경 사이의 상호 통신은 신경 침입을 촉진하고 보다 공격적인 표현형을 촉진할 수 있습니다8.

체외 모델은 신경 유지 및 복구에 기여하는 과정을 특성화하는 데 사용할 수 있으며 신경과 암세포 간의 세포 상호 작용을 조사하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다11,12. 자주 사용되는 체외 모델은 종양 세포와 공동 배양된 추출된 쥐 등뿌리 신경절(DRG)을 포함합니다11. 이러한 모델은 종종 해리된 DRG 세포의 2차원(2D) 단층 배양을 사용하여 in vitro 신경 생물학을 연구하고 PNS13,14에서 세포 상호 작용을 모델링하는 데 사용되었습니다. 그러나 2D 배양은 신경 미세환경의 복잡성이 부족하고 생체 내 구조를 제대로 나타내지 못합니다. 말초 뉴런 또는 신경절의 3차원(3D) 전체 마운트는 말초 신경 생리학을 보다 효과적으로 요약하여 신경-환경 상호 작용을 보다 총체적으로 표현하는 대안을 제공합니다 15,16,17,18. 그러나 이 모델의 이질성으로 인해 세포-세포 상호 작용을 시각화하거나 정량화하는 능력이 제한되며, 이러한 모델은 특정 세포 상호 작용 및 자극에 대한 기계론적 반응을 탐색하는 것보다 전반적인 말초 신경 반응을 관찰하는 데 더 효과적입니다. 따라서 해리된 신경 세포 배양과 전체 산 신경 세포 배양은 상호 보완적이며 2D 및 3D 모델을 병렬로 평가하는 것이 자극에 대한 전반적인 효과와 개별 세포 반응을 모두 평가하는 데 최적이라는 것이 분명합니다.

이 프로토콜은 세포 및 조직 수준에서 신경 및 암세포 상호 작용을 평가하는 데 사용할 수 있는 상보적 해리(2D) 및 전체 장착(3D) 신경 배양을 생성하는 방법을 설명하며, 한 가지 유형의 배양만 사용하는 방법보다 이러한 상호 작용에 대한 보다 포괄적인 관점을 제공합니다 1,13. 이러한 모델은 신경 세포 형태 및 신경돌기 성장뿐만 아니라 신경 영양 인자와 같은 신경 분비 화학주성 물질에 대한 종양 세포 반응, 감각 뉴런과 종양 세포 간의 누화를 포함한 세포 과정을 시각화하고 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 종양 세포와 면역 세포, 섬유아세포 및 신경교세포와 같은 신경 미세환경의 다른 구성 요소 간의 잠재적인 상호 작용을 탐색할 수 있습니다. 세포 상호 작용 및 반응을 평가하거나 정량화하는 접근 방식의 예로서 살아있는 세포 염색 또는 면역 형광으로 시각화된 시간 경과에 따른 신경-암 세포 상호 작용을 연구하기 위한 이러한 모델의 적용을 강조합니다. 이러한 방법의 사용으로 생성된 결과는 신경계가 암의 성장과 확산을 촉진하는 방법에 대한 이해를 증진시켜 이러한 메커니즘을 표적으로 하는 전략을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다.

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프로토콜

모든 생쥐 작업은 Queen's University의 대학 동물 관리 위원회 사무실(프로토콜 번호 2524)에서 검토 및 승인했습니다. 동물은 캐나다 동물 관리 위원회(Canadian Council on Animal Care)와 영국 국립 동물 대체, 정제 및 감소 센터(National Centre for the Replacement, Refinement & Reduction on Animals in Research)의 윤리 지침에 따라 조직 수집을 위해 유지 및 안락사되었습니다. 이 프로토콜에서는 C57BL/6 동물에서 분리한 조직을 사용했지만 Rag2IL2Rγc KO 동물을 포함한 다른 유전자형도 성공적으로 사용했습니다. 섹션 1-6은 깨끗한 환경의 표면 멸균 실험실 벤치( 그림 1 참조)에서 수행할 수 있으며, 섹션 7-9는 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다. 더 나은 이해를 위해 언급된 단계에 대한 개략적인 표현이 생성되었습니다(그림 1).

1. 원액의 준비

  1. 파파인 용액과 콜라겐분해효소 IV/디스파제 II 용액을 준비합니다. 파파인을 30 U/mL의 농도로 멸균 PBS(인산염 완충 식염수)에 용해시킵니다. -20 °C에서 1 mL 분취량에 보관하십시오. 콜라겐분해효소 IV형을 1.25mg/mL, 2.5mg/mL로 디스파아제 II를 PBS에 용해시킵니다. -20 °C에서 1 mL 부분 표본에 보관하십시오.
  2. 2% B27 보충제(50x 원액), 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Pen-Strep)(100x 원액)이 보충된 Neurobasal 배양 배지(F12)를 준비합니다.
  3. Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)을 1% 페니실린-스트렙토마이신(100x 원액)으로 준비합니다.
    참고: 초기 세포 생존 및 부착을 지원하기 위해 10% FBS가 보충된 F12 배지를 사용하여 배양 확립을 개선합니다. 그러나 FBS는 섬유아세포를 포함한 비신경 세포의 증식을 촉진하기도 합니다. 감소되거나 무혈청 배지 조건(예: B27만 보충된 F12)은 DRG 배양 및 암 공동 배양에서 비뉴런 세포 성장을 최소화하는 데 사용될 수 있지만 특히 해리된 뉴런 배양의 생존에 영향을 미칠 수 있습니다. DRG 조절 배지를 수집하여 암세포 거동에 미치는 영향을 평가할 때도 무혈청 배지를 고려해야 합니다.

2. DRG 해부를 위한 시약 및 재료 준비(그림 1A)

  1. 오토클레이브 수술 기구. 70% 에탄올로 해부 현미경을 표면 살균하고 깨끗한 벤치에 설치합니다.
  2. HBSS-Pen-Strep 6-8mL(1.3단계)를 10cm 배양 플레이트 2개에 넣고 얼음 위에 놓습니다.
    참고: 이 플레이트는 박리 후 척추를 수집하는 데 사용됩니다. 절개하는 척수의 수에 따라 추가 플레이트가 필요할 수 있습니다.
  3. 15mL 원뿔형 튜브에 HBSS-Pen-Strep 8-10mL를 넣고 얼음 위에 놓습니다.
  4. 3cm 배양 플레이트에 HBSS-Pen-Strep 3mL를 넣고 얼음 위에 놓습니다.
    참고: 2.3단계에서 준비된 15mL 튜브는 해리를 위한 DRG를 수집하는 데 사용되며, 3cm 배양 플레이트(2.4단계)는 전체 마운트 모델의 DRG를 수집하는 데 사용됩니다.

3. whole-mount DRG 배양을 위한 시약 및 재료 준비

참고: 이 섹션의 일부 단계는 하룻밤 동안 준비해야 할 수 있습니다. DRG 배양에는 모든 유형의 조직 배양 플레이트를 사용할 수 있지만, 이 프로토콜의 부피와 지침은 분석을 위한 최적의 이미징 품질을 제공하는 8웰 유리 바닥 슬라이드에 최적화되었습니다. 8웰 유리 바닥 슬라이드, 피펫 팁 및 Matrigel을 항상 얼음 위에 두십시오.

  1. 사용하기 전에 Matrigel 용액을 4°C에서 하룻밤(또는 최소 3시간) 동안 해동하십시오. Matrigel을 항상 얼음으로 덮으십시오.
  2. 피펫 팁과 8웰 유리 바닥을 -20°C에서 하룻밤 동안 냉각시켜 Matrigel이 팁에 달라붙는 것을 최소화하고 플레이트에서 Matrigel 중합을 조기에 방지하는 것을 방지합니다.
  3. 수조에서 37°C까지 보충된 매체(1.2단계)를 따뜻하게 합니다.

4. 해리된 DRG 배양을 위한 시약 및 재료 준비

  1. Papain 용액과 Collagenase IV/Dispase II 용액(1.1단계)을 37°C의 수조에서 사용할 준비가 될 때까지 해동합니다.
    참고: 해부한 각 마우스에 대해 파파인 및 콜라겐분해효소 IV/Dispase II 용액 각각 1개(1mL)를 사용합니다.
  2. 따뜻한 보충 배양 배지(1.2단계).

5. 척추 채취(그림 1B) 및 DRG 해부(그림 1C)

  1. 4-8주 된 생쥐를 이소플루란 과다 투여 후 자궁경부 탈구로 안락사시킵니다. 안락사된 동물을 복부에 눕히고 척추 위 부위를 중심으로 털을 면도합니다(그림 1B, 1,2단계).
  2. 동물의 등에 70% 에탄올을 뿌리고 느슨한 털을 제거하고 꼬리에서 두개골까지 종이 타월로 닦아 털이 해부를 오염시키는 것을 방지합니다.
  3. 멸균된 가위를 사용하여 면도한 등 표면을 따라 꼬리에서 두개골까지 똑바로 절개합니다. 뭉툭한 집게를 사용하여 절개 부위 양쪽의 피부를 수축시켜 척추를 노출시킵니다(그림 1B, 3단계).
  4. 털로 오염되는 것을 방지하기 위해 새 집게와 가위를 사용하여 척추의 기저부(꼬리 끝)를 수평으로 절개합니다(그림 1B, 4단계).
  5. 척추의 양쪽에 두 개의 평행한 세로 절개를 만들어 풀어줍니다. 집게를 사용하여 척추를 부드럽게 들어 올려 주변 결합 조직을 제거합니다(그림 1B, 5단계).
  6. 척추를 완전히 분리하려면 척추 상단(두개골 근위부)을 절개합니다. 얼음 위에서 HBSS-Pen-Strep이 들어 있는 미리 냉각된 10cm 플레이트로 척추를 옮깁니다(2.2단계)(그림 1C, 6단계).
    참고: 동일한 10cm 플레이트에 모든 척추를 모으고 추가 절제 단계를 위해 개별 컬럼을 한 번에 하나씩 별도의 플레이트로 이동하는 것이 편리합니다.

6. 등뿌리신경절(DRG) 해부

  1. 스프링 가위를 사용하여 척추 주위에 남아 있는 결합 조직을 제거하여 척추를 노출시킵니다(그림 1C, 7단계). 이를 통해 척추뼈를 보다 명확하게 시각화할 수 있고 정중선을 따라 절단하는 것이 용이합니다. 트리밍된 컬럼을 신선하고 미리 냉각된 10cm 플레이트에 수집합니다(2.2단계).
  2. 한 번에 하나씩 절단된 척수를 현미경 스테이지로 옮겨 해부합니다. 스프링 가위를 사용하여 시상면에서 척추를 조심스럽게 분할합니다(그림 1D, 8단계).
  3. 끝이 가는 집게를 사용하여 척추에서 척수를 제거하고 척추 신경의 뿌리를 따라 DRG를 양측으로 노출시킵니다(그림 1D, 9단계).
    참고: DRG를 너무 거칠게 다루면 척수와 함께 DRG를 제거할 수 있으므로 이 단계에서 각별한 주의를 기울여야 합니다.
  4. 스프링 가위로 척추 신경을 자르고 DRG 주변의 결합 조직을 제거합니다(그림 1D, 10단계).
    참고: 이 단계에서 결합 조직을 제거하면 DRG 배양에서 파편이 최소화됩니다.
  5. 끝이 가는 집게를 사용하여 DRG를 부드럽게 당겨 등쪽 뿌리에서 추출합니다. 전체 마운트 배양의 경우 DRG를 3cm 플레이트(2.4단계에서 준비)에 놓습니다(그림 1D, 11단계). 해리에 사용할 15mL 원뿔형 튜브(2.3단계에서 준비)에 나머지 DRG를 풀링합니다.
    알림: 해부 과정 내내 플레이트와 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
  6. 모든 DRG가 추출될 때까지 6.4-6.5단계를 반복합니다. 추가 척추에 대해 위의 모든 단계를 반복합니다.
    참고: 마우스는 균주에 따라 30-31쌍의 DRG를 가지고 있으며, 이는 각 동물로부터 최대 60개의 DRG를 수집할 수 있습니다. 척수의 요추 부분에서만 DRG를 채취하는 경우 10개의 DRG를 추출할 수 있습니다. 동일한 동물의 DRG를 사용하여 두 배양 모델을 모두 확립하면 실험 내 변동성이 줄어들고 상호 보완적인 실험 간에 일관되고 비교 가능한 결과를 얻을 수 있습니다.
    참고: DRG 추출 이후의 모든 단계는 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다.

7. 전체 마운트 DRG 배양(그림 2)

  1. 사전 냉각된 팁(3.2단계)을 사용하여 냉각된 Matrigel 2μL를 피펫팅하여 얼음 위에 놓인 8웰 유리 바닥 슬라이드의 각 웰에 물방울을 형성합니다(그림 2A, 1단계). DRG를 추가하기 전에 Matrigel이 조기에 중합되는 것을 방지하기 위해 한 번에 하나의 방울만 피펫팅합니다. 슬라이드 표면이 긁히는 것을 방지하려면 얼음 위에 놓기 전에 슬라이드를 10cm 접시에 넣으십시오.
  2. 끝이 가는 집게를 사용하여 DRG 하나를 드라이 플레이트로 옮기고 부드럽게 움직여 과도한 HBSS를 제거함으로써 DRG를 Matrigel 방울에 추가할 때 Matrigel이 더 이상 희석되는 것을 방지합니다. DRG를 Matrigel 드롭으로 옮깁니다(그림 2A, 2단계).
    참고: 끝이 가는 집게를 사용하여 DRG를 Matrigel 액적 안으로 부드럽게 밀어 넣어 DRG가 완전히 잠기고 액적 내 중앙에 위치하도록 합니다.
  3. Matrigel 액적에 추가된 각 DRG에 대해 7.1-7.2단계를 반복합니다.
  4. 8웰 유리 바닥 슬라이드를 37°C의 가습 인큐베이터에서 5분 동안 배양하여 Matrigel이 중합될 수 있도록 합니다(그림 2A, 3단계).
  5. 각 웰에 200μL의 따뜻한 보충 배양 배지를 조심스럽게 추가하고 37°C에서 5% CO2 로 배양합니다(그림 2B, 4단계). 72시간마다 배지를 새로 보충된 배양 배지로 교체합니다.
  6. 명시야 현미경을 사용하여 DRG를 모니터링하여 24시간마다 생존력과 신경세포 성장을 평가합니다(그림 2C 및 그림 3).
    참고: 생존력은 신경돌기의 길이와 밀도의 증가로 나타낼 수 있습니다. DRG 세포 확장의 발달을 입증하기 위해 시간이 지남에 따라 이미지를 캡처할 수 있습니다(그림 3).

8. 해리된 DRG 배양(그림 4)

참고: 모든 멀티웰 플레이트를 사용하여 해리된 DRG 뉴런을 시드할 수 있습니다. 그러나 이 프로토콜에서는 8웰 유리 바닥 슬라이드가 사용되었는데, 이는 면역형광 분석을 위해 더 나은 세포 밀도와 이미징 품질을 제공했기 때문입니다.

  1. 콜라겐으로 배양 플레이트 코팅
    1. 생물 안전 캐비닛에서 멸균 0.01M HCl에 산성화된 콜라겐 I의 50μg/mL 작업 용액을 준비합니다.
    2. 100 μL의 콜라겐 I 용액을 8-well 유리 바닥 슬라이드의 각 웰에 피펫팅합니다. 슬라이드를 기울이고 부드럽게 회전시켜 콜라겐 용액이 각 웰의 전체 바닥 표면을 고르게 덮도록 합니다. 콜라겐 I 중합을 보장하기 위해 37°C의 가습 인큐베이터에서 1시간 동안 슬라이드를 배양합니다.
      알림: 배양 시간 동안 8.2 및 8.3 단계를 진행하십시오.
    3. 배양 후, 각 웰에서 잔류 중합되지 않은 콜라겐 I 용액을 부드럽게 피펫으로 제거합니다. 100μL의 PBS로 각 웰을 헹굽니다. 과도한 PBS를 피펫으로 제거하여 콜라겐이 건조해지는 것을 방지하기 위해 얇은 잔류층을 남깁니다.
      참고: 8웰 유리 바닥 슬라이드는 해리된 DRG가 파종 단계를 위해 준비될 때까지 생물 안전 캐비닛에 남아 있을 수 있습니다.
  2. 효소 분해
    1. 추출된 DRG가 들어 있는 15mL 튜브(단계 6.5)를 실온에서 200× g 으로 5분 동안 부드럽게 원심분리하여 DRG를 펠릿화합니다. 피펫을 사용하여 HBSS를 부드럽게 제거합니다.
    2. 예열된 보충 매체로 DRG를 헹구고 튜브를 부드럽게 두드려 모든 내용물이 세척되고 있는지 확인한 다음 200 ×g 에서 5분 동안 원심분리하여 DRG를 펠릿화합니다.
    3. 배지를 피펫으로 제거하고 파파인 용액 1mL를 추가합니다(그림 4A, 1단계). 부드럽게 섞어 조직 배양 인큐베이터에서 37°C에서 20분 동안 배양합니다. 튜브를 부드럽게 흔들어 5분마다 저어줍니다.
    4. 20분 후, 4.5mL의 보충 배지를 넣고 부드럽게 섞어 파파인을 중화시킵니다. DRG를 펠릿화하기 위해 400 × g 에서 5분 동안 원심분리기 튜브. 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
    5. Collagenase IV/Dispase II 용액 1mL를 넣고 인큐베이터에서 37°C에서 20분 동안 배양합니다. 5분마다 튜브를 부드럽게 흔듭니다(그림 4A, 1단계).
    6. 20분 후, 4.5mL의 보충 배지를 추가하고 부드럽게 혼합하여 Collagenase IV/Dispase II 용액을 중화합니다. DRG를 펠릿화하기 위해 400 × g 에서 5분 동안 원심분리기 튜브. 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
    7. 2mL의 보충 배지를 추가하고 DNase I을 최종 농도 0.2mg/mL로 추가합니다. 이 시점에서 DRG는 완전히 소화되어 느슨한 덩어리로 나타날 수 있습니다(그림 4A, 2단계).
  3. 기계적 해리
    1. 1000 μL 필터 피펫 팁을 사용하여 DRG를 위아래로 4-5회 피펫팅하여 부드럽게 분쇄합니다(그림 4A, 2단계).
    2. 200μL 피펫 팁 4-5x를 사용하여 두 번째 trituration 단계를 수행합니다. 이 단계가 끝나면 샘플이 흐리고 일부 조직 덩어리가 눈에 띄게 남아 있습니다(그림 4A, 2단계).
    3. 70μm 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 50mL 코니컬 튜브로 여과합니다. 여과기를 10mL의 배지로 점차적으로 헹구어 여과기를 통해 세포가 완전히 여과되도록 합니다(그림 4A, 3단계).
    4. 1,000 × g 에서 5분 동안 원심분리기 튜브를 펠릿 세포에 주입합니다. 펠릿에서 배지를 제거하고 500μL의 보충 배지에 재현탁합니다(그림 4A, 단계 4).
    5. 8웰 유리 바닥 슬라이드의 웰에서 잔류 PBS를 제거합니다. 콜라겐으로 코팅된 웰 사이에 해리된 DRG 현탁액을 분배합니다. 37 ° C의 가습 된 인큐베이터에서 5 % CO2로 슬라이드를 배양합니다. 필요에 따라 배지를 더 추가하고 48시간마다 배지를 새로 보충된 배양 배지로 교체합니다(그림 4B, 5단계).
      참고: DRG-해리된 세포는 혈구계 또는 세포 계수 챔버 및 트리판 블루 염색을 사용하여 계수하여 웰당 일관된 세포 수를 보장할 수 있습니다. 이 프로토콜의 경우, 약 1 × 105 개의 세포가 각 웰에 파종되었습니다.
    6. 명시야 현미경을 사용하여 DRG 유래 세포를 모니터링하여 생존력과 신경 세포 성장을 평가합니다(그림 4C 및 그림 5).
      참고: 뉴런은 경계가 정의된 둥근 세포체로 나타나며 부착하는 데 24시간 이상이 걸릴 수 있는 반면, 비뉴런 세포는 일반적으로 뉴런보다 먼저 정착합니다. 일부 신경돌기 성장은 24시간 후에 관찰될 수 있으며 배양에서 시간이 지남에 따라 최대 7일까지 증가합니다. 해리된 DRG 유래 세포와 전체 마운트 DRG는 암세포를 추가하고 공동 배양을 설정하기 전에 72시간 동안 사전 배양됩니다.

9. 암세포 현탁액 준비 및 공동 배양 확립

참고: 다양한 종류의 부착성 암세포를 사용할 수 있습니다. 공동 배양을 위한 성장 배지 및 세포 수는 세포주에 따라 달라집니다. 세포 채취 시기와 최적의 세포 파종(seeding) 수를 결정하기 위해 실험 전에 예비 검사를 수행하는 것이 좋습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 인간 췌장암 세포주 PanC1 및 MiaPaCa2와 전립선암 세포주 DU-145의 사용을 기반으로 합니다.

  1. 무혈청 배지로 세포를 세척하고 2mL의 트립신/10cm 플레이트로 약 3분 동안 트립신화합니다.
  2. 6mL의 보충 배지를 추가하여 트립신을 중화하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 보장합니다. 혈구계와 트리판 블루 염색을 사용하여 세포를 계산합니다.
  3. 보충된 배지에서 암세포를 2 × 105 cells/mL의 농도로 현탁시킵니다(단계 1.2).
    참고: 최적의 세포 밀도는 세포 크기, 배가 시간 및 공동 배양 기간에 따라 달라질 수 있으며 필요에 따라 조정할 수 있습니다.
  4. 전체 마운트 DRG 및 암세포 공동 배양(그림 6B)
    1. 8웰 유리 바닥 슬라이드에서 전체 마운트 DRG 배양물에서 매체를 흡입합니다.
    2. 전체 마운트 DRG를 포함하는 Matrigel 방울 위에 암세포 현탁액(단계 9.3)의 200μL를 부드럽게 피펫팅합니다.
      참고: 이렇게 하면 비말 주위에 암세포가 균일하게 분포할 수 있습니다. 피펫 팁으로 Matrigel 방울을 방해하지 않도록 주의하십시오.
    3. 37°C의 가습된 인큐베이터에서 공동 배양 슬라이드를 5% CO2로 배양합니다. 200μL의 가열된 보충 매체로 한 번 세척한 다음 각 웰에 300μL의 보충 매체를 추가하여 매일 배지를 새로 고칩니다.
      참고: DRG-암세포 공동 배양을 방해하지 않도록 피펫을 사용하여 배지를 부드럽게 흡인합니다. 시간이 지남에 따라 공동 배양이 더욱 복잡하고 조직화됨에 따라 세포 상호 작용 및 공동 배양 무결성에 영향을 미칠 수 있는 교란에 더 취약해집니다.
    4. 명시야 또는 형광 현미경을 사용하여 24시간 간격으로 공동 배양을 모니터링하여 암세포 거동과 신경 세포 상호 작용을 평가합니다(그림 6B).
      참고: 관찰 빈도는 실험 타임라인 및 관심 있는 세포 상호 작용에 따라 조정할 수 있습니다.
  5. 해리된 DRG와 암세포 공동 배양(그림 6C)
    1. 8웰 유리 바닥 슬라이드에서 해리된 배양물에서 미디어를 흡인합니다.
    2. 200μL의 암세포 현탁액(9.3단계)을 각 웰에 부드럽게 분배합니다. 전체 마운트 공동 배양에 대해 설명된 것과 동일한 배양, 배지 다과 및 모니터링 단계를 따릅니다(단계 9.4.3 및 9.4.4).
      참고: 세포 과정 및 암세포-뉴런 상호 작용의 더 나은 시각화를 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 형광 세포 추적기를 배양에 추가할 수 있습니다.

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결과

당사의 프로토콜은 일차 마우스 DRG 유래 세포의 분리와 두 가지 상호 보완적인 배양 모델, 즉 해리 DRG 및 전체 장착 DRG 배양의 확립을 설명하며, 이를 통해 다양한 복잡성 수준에서 신경암 세포 상호 작용을 조사할 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 동일한 동물에서 분리된 DRG를 사용하여 두 가지 유형의 배양을 모두 생성할 수 있다는 것인데, 이는 동물 간 및 실험 간 변동성을 최소화하고 각 모델에서 생성된 정보를 보다 쉽게 통합하여 세포 역학 및 세포 간 상호 작용에 대한 보다 포괄적인 관점을 제공할 수 있습니다. 이러한 배양 모델은 많은 응용 프로그램에 적용할 수 있습니다. 그러나 여기서는 암-신경 상호 작용의 맥락에서 사용하는 데 초점을 맞췄습니다.

이 프로토콜은 DRG 구조를 보존하고 DRG 유래 세포의 생존율을 극대화하는 동시에 생존 가능한...

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토론

여기에 제시된 프로토콜은 2D 및 3D DRG 1차 신경 배양을 확립하는 개선된 방법과 암세포와의 공동 배양에 적용하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 두 모델을 병렬로 설정하여 이전 방법을 발전시킵니다. 동일한 동물에서 분리된 일차 신경을 사용하여 2D 및 3D 모델을 동시에 설정하므로 동물 간 및 실험 간 변이가 최소화되고 두 모델의 데이터를 보다 쉽게 비교하거나 통합하여 세포 행동 및 복잡한 조직 반응에 대한 보완적인 관찰을 용이하게 할 수 있습니다. 당사의 프로토콜은 신경 절제 및 해리 상태를 더욱 최적화하여 종양 세포를 추가하기 전에 신경 환경의 신경돌기 성장과 성숙을 극대화합니다. 또한 일반적인 기술적 문제를 해결하고, 오염을 줄이고, 배양 확립의 효율성을 높여 조건의 재현성을 보장하고 다양한 실험 모델에 걸쳐 이 프로토콜의 적용 가능성을 확장하기 위해 추가적인 방법론적 세부 정보를 제공합니다. 이와 관련하여, 당사는 이 프로토콜을 사용하여 여러 유전적 배...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 캐나다 보건 연구소(Canadian Institutes for Health Research, PJT-178274)(LMM)의 운영 보조금, 온타리오 대학원 장학금(LCBO), 고등 교육 인력 개선 조정 조정(Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel - Brazil, CAPES) - 재무 코드 001(ERP)의 장학금으로 지원되었습니다. LMM은 Queen's University의 유전학 및 분자 의학 분야의 Bracken Chair입니다. 일부 이미지는 부분적으로 Biorender를 사용하여 생성되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Tools
70 & 마이크로; m 셀 스트레이너프로진71-229483-ULT세포 현탁액 필터링에 사용
8웰 유리 바닥 슬라이드IBidi, 뮌헨, 독일80807
Dumont #5 - 고급 집게Fine Science Tools, 포스터 시티, 미국11254-20
Dumont #5 겸자Fine Science Tools, 포스터 시티, 미국11252-20
고급 가위Fine Science Tools, 포스터 시티, 미국91460-11
패턴 겸자Fine Science Tools, 포스터 시티, 미국91121-12
스프링 가위Fine Science Tools, 포스터 시티, 미국91500-09
시약
1x 인산염 완충 식염수시그마, 세인트루이스, 미국D8662-500ML효소 용해에 사용
B-27 보충제 (50x)Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠17504044F12 배지에서 2% 농도로 사용
소 I 타입 콜라겐Corning Incorporated, 미국 뉴욕354231코팅 플레이트, 작업 용액 50 및 마이크로에 사용됩니다. 0.01 M HCl의 g/mL
콜라게나제 IV형Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미국C4-바이오크PBS에 1.25 mg/mL로 용해하고 분취하고 -20 °에서 보관합니다. C
분산 IIRoche, 바젤, 스위스4942078001PBS에 2.5 mg/mL로 용해시키고, 분취하고, -20 °에서 보관합니다. C
DNase I로슈, 바젤, 스위스.11284932001최종 농도 로 첨가; 해리 중 0.2 mg/mL
태아 소 혈청(FBS)Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미국F1051F12 배지에서 10% 농도로 사용
HBSS(행크의 균형 소금 용액)시그마, 세인트루이스, 미국H6648-500ML1% 페니실린-스트렙토마이신으로 제조
마트리겔 성장 인자 감소Corning Incorporated, 미국 뉴욕3562314 °에서 해동; C 하룻밤, 얼음 위에 보관
영양 혼합물 F-12 햄Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미국N6658-500ML보충된 배양 배지의 제조를 위한 기초 배지
파파인로슈, 바젤, 스위스.10108014001PBS에 30 U/mL로 용해하고 분취하여 -20 °에서 보관합니다. C
페니실린-스트렙토마이신 (100x)Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미국P4333-100ML매체에서 1% 농도로 사용
트리판 블루 용액Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미국T8154-100ML세포 생존력을 평가하기 위해
트리플레 익스프레스Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠12605-028암세포 채취용
항체
β-Tubulin III 항체Abcam(영국 케임브리지)AB15568희석 1:200
알렉사 플루어 488Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠A-11008희석 1:2000
알렉사 플루어 594Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠A-21442희석 1:2000
알렉사 플루어 647Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠A-21245희석 1:2000
NeuN 항체Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미국MAB377희석 1:100
형광 염료 및 프로브
ActinGreen 488 ReadyProbes 시약(팔로이딘)Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠R37110희석 1:40
CellTrace 칼세인 레드-오렌지Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠C34851형광 현미경으로 뉴런을 시각화하는 데 사용되는 세포 추적기
회크스트 33342Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠H3570희석 1:5000

참고문헌

  1. Thiel, V., et al. Characterization of single neurons reprogrammed by pancreatic cancer. Nature. 640 (8060), 1042-1051 (2025).
  2. Zhu, M., Luo, F., Xu, B., Xu, J. Research progress of neural invasion in pancreatic cancer. Curr Cancer Drug Targets. 24 (4), 397-410 (2024).
  3. Zareba, P., et al. Perineural invasion and risk of lethal prostate cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 26 (5), 719-726 (2017).
  4. Fu, Y., et al. Worst pattern of perineural invasion redefines the spatial localization of nerves in oral squamous cell carcinoma. Front Oncol. 11 (766902), (2021).
  5. Hu, J., Chen, W., Shen, L., Chen, Z., Huang, J. Crosstalk between the peripheral nervous system and breast cancer influences tumor progression. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (6), 188828(2022).
  6. Li, J., Mei, S., Zhou, S., Zhao, F., Liu, Q. Perineural invasion is a prognostic factor in stage ii colorectal cancer but not a treatment indicator for traditional chemotherapy: A retrospective cohort study. J Gastrointest Oncol. 13 (2), 710-721 (2022).
  7. Schmitd, L. B., Perez-Pacheco, C., D'silva, N. J. Nerve density in cancer: Less is better. FASEB Bioadv. 3 (10), 773-786 (2021).
  8. Zahalka, A. H., Frenette, P. S. Nerves in cancer. Nat Rev Cancer. 20 (3), 143-157 (2020).
  9. Winkler, F. Neuroscience and oncology: State-of-the-art and new perspectives. Curr Opin Neurol. 36 (6), 544-548 (2023).
  10. Lanigan, L. G., et al. Comparative pathology of the peripheral nervous system. Vet Pathol. 58 (1), 10-33 (2021).
  11. Jiang, S. -H., Zhang, S., Wang, H., Xue, J. -L., Zhang, Z. -G. Emerging experimental models for assessing perineural invasion in human cancers. Cancer Lett. 535 (215610), (2022).
  12. Moysidou, C. -M., Barberio, C., Owens, R. M. Advances in engineering human tissue models. Front. Bioeng. Biotechnol. 8 (620962), (2021).
  13. Bayat, F. K., et al. Adult mouse dorsal root ganglia neurons form aberrant glutamatergic connections in dissociated cultures. PloS ONE. 16 (3), e0246924(2021).
  14. Lin, Y. -T., Chen, J. -C. Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release. J Vis Exp. (140), e57569(2018).
  15. Schmidt, H., Rathjen, F. G. Dii-labeling of drg neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. (58), e3667(2011).
  16. Klimovich, P., Rubina, K., Sysoeva, V., Semina, E. Three-dimensional model of dorsal root ganglion explant as a method of studying neurotrophic factors in regenerative medicine. Biomedicines. 8 (3), 49(2020).
  17. Neto, E., et al. Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3d organotypic cultures of adult dorsal root ganglia. PLoS ONE. 12 (7), e0181612(2017).
  18. Melli, G., Höke, A. Dorsal root ganglia sensory neuronal cultures: A tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).
  19. Du, J., Sudlow, L. C., Luzhansky, I. D., Berezin, M. Y. Drg explant model: Elucidating mechanisms of oxaliplatin-induced peripheral neuropathy and identifying potential therapeutic targets. bioRxiv. , (2023).
  20. Mo, Y. J., Kim, Y. -S., Kim, M. S., Lee, Y. -I. Advantages of adult mouse dorsal root ganglia explant culture in investigating myelination in an inherited neuropathic mice model. Methods Protoc. 5 (4), 66(2022).
  21. Nguyen, U. N., et al. Type i collagen concentration affects neurite outgrowth of adult rat drg explants by altering mechanical properties of hydrogels. J Biomater Sci Polym Ed. 35 (2), 164-189 (2024).
  22. Ito, K., et al. Histological effects of combined therapy involving scar resection, decellularized scaffolds, and human ipsc-ns/pcs transplantation in chronic complete spinal cord injury. Sci Rep. 14 (1), (2024).
  23. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L., Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to matrigel. Nat Rev Mater. 5 (7), 539-551 (2020).
  24. Berkovitch, Y., Seliktar, D. Semi-synthetic hydrogel composition and stiffness regulate neuronal morphogenesis - pubmed. Int J Pharm. 523 (2), 545-555 (2017).
  25. Carozzi, V. A., Salio, C., Rodriguez Menendez, V., Ciglieri, E., Ferrini, F. 2d vs 3d morphological analysis of dorsal root ganglia in health and painful neuropathy. Eur J Histochem. 65 (Suppl 1), 3276(2021).
  26. Smith, P. R., Meyer, A., Loerch, S., Campbell, Z. T. Protocol for the isolation and culture of mouse dorsal root ganglion neurons for imaging applications. STAR Protocols. 4 (4), (2023).
  27. Bunge, R. P. Expanding roles for the schwann cell: Ensheathment, myelination, trophism and regeneration - pubmed. Curr Opin Neurobiol. 3 (5), 805-809 (1993).
  28. Chen, Z., Fang, Y., Jiang, W. Important cells and factors from tumor microenvironment participated in perineural invasion. Cancers. 15 (5), 1360(2023).
  29. Jang, K., Garraway, S. M. A review of dorsal root ganglia and primary sensory neuron plasticity mediating inflammatory and chronic neuropathic pain. Neurobiol Pain. 15 (100151), (2024).
  30. Hanani, M., et al. Age-related changes in neurons and satellite glial cells in mouse dorsal root ganglia. Int J Mol Sci. 24 (3), 2677(2023).
  31. Martinelli, C., Sartori, P., Ledda, M., Pannese, E. Age-related quantitative changes in mitochondria of satellite cell sheaths enveloping spinal ganglion neurons in the rabbit. Brain Res Bull. 61 (2), 147-151 (2003).
  32. Niwa, H., et al. Differential age-dependent trophic responses of nodose, sensory, and sympathetic neurons to neurotrophins and gdnf: Potencies for neurite extension in explant culture. Neurochem Res. 27 (6), 485-496 (2002).
  33. Adler, J. E. Age-dependent differential regulation of sensory neuropeptides by glial cell line-derived neurotrophic factor. J Neurochem. 71 (1), 170-177 (1998).
  34. Podratz, J. L., et al. Neurotoxicity to drg neurons varies between rodent strains treated with cisplatin and bortezomib. J Neurol Sci. 362, 131-135 (2015).
  35. Lawson, S. N., Biscoe, T. J. Development of mouse dorsal root ganglia: An autoradiographic and quantitative study. J Neurocytol. 8 (3), 265-274 (1979).
  36. Monje, M., et al. Roadmap for the emerging field of cancer neuroscience. Cell. 181 (2), 219-222 (2020).
  37. Silverman, D. A., et al. Cancer-associated neurogenesis and nerve-cancer cross-talk. Cancer Res. 81 (6), 1431-1440 (2021).
  38. Vermeer, P. D., Restaino, A. C., Barr, J. L., Yaniv, D., Amit, M. Nerves at play: The peripheral nervous system in extracranial malignancies. Cancer Discov. 15 (1), 52-68 (2025).

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