신생아 돼지에 적용할 수 있도록 관상 또는 시상 절단을 절단할 수 있는 확장 가능한 뇌 매트릭스를 만드는 혁신적인 방법이 설명되었습니다. 이 저렴한 접근법은 아가로스 젤 뇌 성형 템플릿을 사용해 아크릴 판을 사용하며, 여러 종에 적용되고 뇌 성장을 수용하기 위한 확장도 허용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
신생아 발달 및 병리학 연구 모델로 신생아 돼지를 활용하는 관심 증가에 따라, 조직학적 절편을 정확히 획득하기 위한 뇌 매트릭스의 필요성이 커졌습니다. 하지만 신생아 뇌의 빠른 성장으로 인해 상업적으로 이용 가능한 매트릭스의 유용성은 제한된 발달 창에 한정됩니다. 따라서 조절 가능한 뇌 매트릭스 구성 방법이 개발되었습니다. 먼저, 유리 용기를 젖은 얼음 위에 올려놓고, 바닥에 4% 아가로스 젤을 깔았습니다. 다음으로, 포르말린 고정 뇌를 이 층에 놓고 4% 아가로스 젤을 삽입했습니다. 젤이 굳은 후, 뇌 위의 젤을 조심스럽게 제거하고 뇌를 추출했습니다. 공동은 4% 아가로스 젤과 2% 인도 잉크로 채웠습니다. 고체 후 젤 블록을 제거하여 원하는 두께(2mm 또는 5mm)와 방향(관상 또는 시상면)으로 절단하여 뇌 템플릿을 축소지에 인쇄했습니다. 템플릿은 2mm 또는 5mm 두께의 투명 아크릴 판 일련에 복사되어 밴드쏘로 절단했습니다. 마지막으로, 판을 조립하고 미리 뚫어진 정렬 구멍을 통해 세 세트의 볼트와 너트로 고정하여 맞춤형 뇌 매트릭스를 만들었습니다. 신생아 5일차 새끼 돼지 뇌에 대해 2mm 단계의 코로나 및 시상자 매트릭스의 구성이 나타났으며, 출생 후 32일차부터 38일차 뇌의 코로나 매트릭스는 5mm 단계로 구성되었습니다. 적절한 아크릴 판을 추가하거나 제거함으로써 매트릭스는 돼지 뇌의 다양한 크기에 맞게 조정되었습니다. 따라서 다양한 크기의 대형 동물에 맞춘 뇌 행렬을 맞춤화하는 간단하고 비용 효율적인 방법이 신경학 연구 커뮤니티에 소개되었습니다.
서론
돼지 새끼의 뇌 발달은 인간과 매우 유사합니다 1,2,3,4. 따라서 신경발달장애, 신생아 및 소아 질환, 부상에 대한 전임상 연구에 새끼 돼지를 활용하는 데 대한 관심이 증가하고 있습니다(그림 1A,B)5,6,7,8,9,10. 그림 1에서 볼 수 있듯이, 신생아 돼지 새끼는 대형 동물 모델로서 두개골과 뇌 크기가 조산 인간 태아에 더 가깝지만(그림 1A, B), 성체 쥐와 쥐의 두개골은 최소 두 배 정도 작다.
하지만 더 널리 사용되는 쥐 모델에 비해 생의학 연구에 더 큰 포유류를 사용하는 데는 도전 과제가 있습니다. 신생아 돼지 뇌는 출생 후 처음 3개월 동안 빠르게 성장합니다. 생후 처음 5주 동안 돼지 뇌는 무게가 거의 두 배로 늘고 부피가 세 배로 늘어납니다(그림 1C)4,11,12,13. p5부터 p38까지의 기간 동안 뇌회랑과 설랑의 성장과 발달이 두드러졌다(그림 1C). p5 새끼 돼지 뇌의 무게와 부피는 각각 29.5g과 18.9mL였고, 두 p32 뇌는 각각 51.4g과 52.6g, 49.6g과 53.5mL였다. 38일째에 뇌는 53.7g, 52.5mL로 성장했으며, 이는 p5에서 무게가 80% 증가하고 부피가 170% 증가한 수치입니다. 신생아 돼지 뇌의 이러한 급속한 성장은 단일 매트릭스를 사용하여 다양한 연령, 계통, 성별의 돼지 뇌를 정확히 조직학적으로 분리하는 데 도전 과제를 제기합니다.
새끼 돼지용 상업용 뇌 매트릭스는 대략 1,000달러에서 3,600달러 사이이며, 2주 이하 돼지용으로 설계된 한 가지 크기의 옵션만 제공됩니다. 3D 스캐닝과 3D 프린팅 기법을 활용해 제브라피시, 쥐, 새의 다양한 뇌 매트릭스를 만든 논문이 몇 개 있지만, 그 매트릭스들은 비교적 작은 규모입니다. 신생아 새끼 돼지 뇌에 대한 MRI 영상 시리즈나 상세한 성장 차트는 아직 없습니다. 특히 2주 이하의 경우에는 더욱 그렇습니다. 따라서 5일차부터 38일차 사이에 수집된 뇌를 이용해 여러 뇌 단편 템플릿을 만들었고, 이를 바탕으로 조절 가능한 뇌 매트릭스 시스템을 구축했습니다.
이 프로토콜은 신생아 돼지 뇌 템플릿을 구축하고, 아크릴 플레이트 기반의 맞춤형 뇌 매트릭스 구조를 개발하는 혁신적인 방법을 설명하며, 이는 다양한 크기의 뇌 코로나 또는 시상 절절에 사용할 수 있습니다.
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프로토콜
이 글에서는 네 마리의 새끼 돼지 뇌를 확보하여 켄터키 대학교 기관동물 보호 및 사용 위원회(IACUC)가 별도의 연구를 위해 승인한 프로토콜에 따라 인도적 안락사 후 조직학적 염색을 위해 준비했습니다. 모든 동물 대상 시술이 승인되었고, 치료나 안락사와 관련된 스트레스나 통증을 최소화하기 위해 적절한 동물 관리가 이루어졌습니다.
1. 동물
- 유전적 배경이 62.5% 랜드레이스, 25% 라지 화이트, 12.5% 요크셔 혈통을 가진 신생아 수컷 돼지 4마리(체중 1.5-1.8kg)를 확보하세요.
- 동물들을 돼지우리에 있는 전용 방에 함께 두고, 히트램프와 수건으로 덮인 바닥으로 지원합니다. 첫 주에는 우유 대체제와 함께 자유롭 게 먹이고, 2-3주쯤 되면 점차 펠릿 사료로 전환하세요.
- 생리적 활동과 체중을 모니터링하고 이소플루오란 마취 하에 매주 MRI 검사를 실시하세요.
- 펜토바르비탈 과다복용으로 안락사시키고, 경심 관류로 헤파린화된 생리식염수로 관류한 후 10% 중성 완축 포르말린을 투여합니다.
- 두개골에서 뇌를분리하고, 포르말린으로 하룻밤 고정한 후, PBS에 30% 자당을 넣어 3일간 냉동 보존합니다.
2. 아가로스 젤 몰딩
- 유리 용기를 젖은 얼음 양동이에 절반 높이까지 담가세요(그림 2A).
- 용기 안감으로 튼튼한 플라스틱 스트립을 사용하고, 바닥과 측면 벽은 완전히 덮으면서 양 끝은 상단 가장자리에서 최소 5cm 이상 위에 두세요.
- 유리 비커에 담긴 150mL의 PBS를 마그넷 저어주는 뜨거운 판에서 90°C로 가열한 후, 점차 6g의 아가로스를 추가해 녹여 PBS에 4% 아가로스 젤을 만듭니다.
- 유리 용기에 0.5-1cm 두께의 층을 부어주고(그림 2B), 굳어질 때까지 기다리세요.
- 뇌에 얇은 미네랄 오일을 국소적으로 바르고(그림 2C), 뇌를 젤 층 위에 올려놓으세요(그림 2D).
- 아가로스 용액을 50°C까지 식힙니다. 뇌에 냉각된 아가로오스 젤을 삽입하고 굳히도록 두세요(그림 2F), 젖은 얼음에서는 일반적으로 약 10분 정도 걸립니다.
- 수술 탐침으로 뇌 위의 아가로스 젤 최상층(그림 2G)을 조심스럽게 제거하고 굳어진 틀에서 뇌를 추출합니다(그림 2H,I).
- 자석 교반기와 함께 또 다른 유리 비커에 PBS 98mL를 90°C로 가열하고, 아가로스 4g과 인디아 잉크 2mL를 넣은 뒤 잘 저어주고 잘 섞습니다. 추출된 뇌가 남긴 공동에 4% 아가로스와 2% 인도 잉크를 부어 가득 차게 한 후 젖은 얼음 위에 15분간 굳히도록 합니다(그림 2K).
- 플라스틱 스트립의 돌출된 부분을 이용해 플라스틱 스트립을 들어 올려 용기에서 아가로스 블록 전체를 제거합니다(그림 2L).
3. 아가로스 블록 슬라이싱 및 템플릿 스케일 종이에 복사하기
- 슬라이스 작업 중 종이를 습기로부터 보호하기 위해 0.76mm(0.03인치) 두께의 투명 아크릴 판 두 개 사이에 한 장의 스케일 종이를 놓고(그림 3A), 라미네이트 종이-아크릴 판을 작업대 가장자리 근처에 놓습니다.
- 모서리 정사각형을 클램프로 적절한 위치에 고정하여 두께 5mm 아크릴 판 두 개를 세우고 젤 블록을 원하는 방향으로 단단히 고정합니다( 그림 3의 시상표). 각 수직 아크릴 판의 가장자리가 젤 블록 절단 기준으로 사용할 수 있도록 스케일 종이의 같은 선과 일치하도록 하세요. 젤 블록을 절단할 반대편 끝에 무게추를 사용해 고정하세요(그림 3B).
- 아래 스케일 종이를 가이드로 삼아, 원하는 단계(2 mm 또는 5 mm)에서 아크릴 판 사이에서 젤 블록을 앞으로 이동시키고, 양손으로 미세토름 날을 잡은 뒤 아크릴 판 앞쪽 가장자리 너머의 부분을 절단합니다(그림 3B).
- 각 조각을 수집하고(그림 3C), 별도의 스케일지(그림 3D)에 올려놓고, 인도 잉크 염색 주조물을 스케일지에 부드럽게 눌러 윤곽선을 옮기세요(그림 3E), 펜으로 젤 구간 전체의 윤곽을 따라 그린 후 젤 구간을 제거한 뒤 인도 잉크 인쇄물도 펜으로 윤곽선을 그리세요(그림 3F). 각 슬라이스와 복사된 템플릿의 방향을 일관되게 유지하는 데 주의하세요.
- 2.3, 2.4단계를 반복하여 모든 젤 조각을 저울 종이에 복사하고 순차적으로 번호를 매기세요. 슬라이스와 그 지문을 다시 확인해 보세요(그림 3G,H의 코로나 슬라이스 및 프린트의 대표 이미지).
4. 아크릴 판 조각
- 플렉시글라스 커팅 나이프로 큰 아크릴 판에 홈을 내고, 큰 판을 10 x 8.5cm 크기로 부숴버립니다.
참고: 총 조각 수는 뇌의 크기, 원하는 슬라이스 두께, 그리고 절단 방향에 따라 달라집니다. 일반적으로 신생아 돼지 뇌에는 관상기질 또는 시상체 매트릭스용으로 25개의 아크릴 플레이트를, 더 큰 뇌에는 다루기 쉬운 5mm 플레이트 15개를 준비합니다. - 왼쪽 하단 모서리에서 측정한 x, y 좌표에 아크릴 판에 있는 세 개의 고정 구멍(mm 단위): (11, 42); (45, 15); 그리고 (88, 42).
- 아크릴 판을 코너 스퀘어와 클램프로 드릴 프레스 플랫폼에 고정하세요. 앞서 언급한 좌표에 아크릴 플레이트 드릴 비트를 사용해 세 개의 앵커링 홀을 뚫습니다(그림 4A). 모든 판 오른쪽에 색선을 그어 방향을 표시하세요.
- 아크릴 판에서 보호막을 떼어내어 스케일 종이에 템플릿 위에 올려놓고, 아크릴 플레이트의 윗선을 스케일에 복사한 템플릿의 윗선과 일치시킵니다. 영구 마커펜으로 아크릴 판에 뇌의 윤곽을 그려보세요(그림 4B). 템플릿처럼 플레이트에 순차적으로 라벨을 붙이세요.
- 밴드 쏘로 아크릴 판을 템플릿 선을 따라 자릅니다(그림 4C). 또는 다목적 절단 키트와 목각 팁이 달린 회전 도구를 사용해 원치 않는 부분을 제거할 수도 있습니다.
- 회전 공구와 연마 샌딩 팁을 사용해 절단 도구가 남긴 가장자리를 매끄럽게 연마합니다(그림 4D).
- 아크릴 판의 절단 부위를 저울 용지의 템플릿과 비교해 다시 확인해 보세요(그림 4E). 필요하다면 다듬고 광내도 하세요.
- 절단판을 순차적으로 쌓아 매트릭스를 미리 조립하고 판의 정렬을 점검합니다(그림 4F).
5. 뇌 매트릭스의 조립 및 확장
- 아크릴 판 사이에 세 개의 와셔를 놓고, 각각 하나의 앵커링 구멍을 중심에 놓습니다(그림 5A). 조립 시간을 줄이기 위해 모든 아크릴 판의 같은 면에 순간접착제로 앵커링 구멍 주변을 붙이세요(그림 5A).
- 아크릴 판을 순차적으로 쌓고, 각 앵커링 구멍에 스테인리스 볼트를 삽입해 매트릭스를 조립하며, 너트를 조여 고정하세요(그림 5A).
- 뇌와 접촉할 절단면을 마지막으로 연마하여 판을 매끄럽게 만듭니다.
- 매트릭스 상단에 색상 코드를 표시하여 절단 시 단계를 식별하는 데 도움이 됩니다. 플레이트 상단 가장자리를 번갈아 검정, 빨강, 그리고 빈 색으로 칠해 패턴을 만듭니다. 이 과정을 반복하여 모든 번호판이 동일한 패턴으로 색상으로 구분됩니다(그림 5).
- 기하학을 조정하거나 특정 뇌에 더 적합하게 내동을 변경하려면, 특정 아크릴 판을 제거하거나 추가하여 다양한 뇌 크기에 맞게 조정해야 합니다(그림 5B). 이는 매트릭스의 유연성을 크게 높이고 재료와 노력을 절약할 수 있습니다.
6. 뇌의 관상 또는 시상 절단
- 고프로파일 크라이오스탯 블레이드의 한쪽 끝을 최소 2cm 길이의 실험실 테이프로 감아 사용자의 손을 보호하세요. 뇌를 매트릭스 공간에 단단히 넣어. 칼날의 감긴 끝을 잡고 칼날을 매트릭스의 아크릴 판 사이에 조심스럽게 놓고, 뇌를 다른 손으로 받치고 고정한 채 관상이나 시상상 절단으로 절단합니다(그림 6A,B).
참고: 주의: 1) 포르말린 고정 후 각 뇌 부위는 질감이 다르므로, 칼날에 고르게 압력을 가하는 데 주의해야 합니다. 2) 게다가 새끼 돼지의 뇌는 크기 때문에 직접적인 '밀어내기' 절단 동작보다 절단 동작을 사용하는 것이 더 낫습니다. 3) 절단 시 뇌가 매트릭스에 꼭 맞게 밀착되도록 하는 것이 중요하며, 이는 뇌의 기울기나 방향 변화를 방지하기 위함입니다. 매트릭스에 뇌에 과도한 압력을 가하는 것은 항상 피해야 합니다. - 모든 조각을 PBS가 채워진 6웰 플레이트나 스테인리스 트레이에 넣으세요. 조각을 같은 방향으로 조심스럽게 배치하고 필요에 따라 보존하거나 진행하세요.
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결과
한 마리는 p5 나이에 펜토바르비탈 과다복용으로 안락사되었습니다. 나머지 세 마리는 정상적인 생리 활동과 비슷한 체중 증가(7.44-8.4kg)를 보였습니다. 두 마리 새끼 돼지는 p32에서 안락사될 때까지 매주 이소플루란 마취 하에 MRI 스캔을 받았다. 네 번째 새끼 돼지는 38페이지에서 안락사를 받을 때까지 순진한 상태로 남아 있었습니다.
돼지와 인간 태아의 머리 크기 유사성은 그림 1A, B에서 시각화할 수 있는데, 이는 설치류보다 최소 두 자릿수 더 큽니다. 첫 몇 주 동안 새끼 돼지의 뇌 성장과 피질 발달이 유의미하게 나타나는 모 습은 그림 1C에서 확인할 수 있습니다.
그림 2
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토론
이 프로토콜은 돼지 새끼 뇌나 다른 대형 동물 종을 원하는 방향과 두께로 절단하는 데 도움을 줄 수 있는 저렴하고 쉽게 만들 수 있는 뇌 매트릭스를 만드는 방법론을 제시합니다. 중요한 점은, 제한된 뇌 크기 범위만 작동하는 상업용 '고정 크기' 매트릭스와 달리, 이 방법은 매트릭스를 다양한 뇌 크기에 편리하게 조정하거나 확장할 수 있게 해줍니다. 이 보고서에서는 30g 돼지 새끼 뇌를 위해 구축된 매트릭스가 80% 더 큰 뇌를 수용하도록 성공적으로 확장했으며, 정확한 뇌 절단을 가능하게 하는 밀착 구조를 제공했습니다. 아크릴 판의 추가나 제거는 시상 절단 매트릭스의 뇌 중앙선 방향을 유지하기 위해 대칭적으로 이루어지도록 권장되지만, 뇌 영역 간 성장 비율이 상대적으로 불균형하기 때문에 관상 매트릭스에는 반드시 그렇지 않을 필요는 없습니다. 더불어, 이 매트릭스 제작 방법은 원숭이, 양, 개, 고양이, 페럿 등 다른 대형 동물 종에도 적용할 수 있습니다.
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공개 사항
저자들은 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 국립보건원(NIH) #R21-NS114771(K.E.S.), #R56-NS117587, #R01-EB028792, #R01-HD101508, #R21-HD091118, #R41-NS122722, #R42-MH135825(G.Y.), 미국심장협회(AHA) #16GRNT30820006(G.Y.), #14SDG20480186(L.C.), 그리고 켄터키 대학교 신경과학 연구 우선 분야(L.C.)의 지원을 받았습니다. 이 순진한 수컷 신생아 돼지는 켄터키 대학교 농업대학 돼지 센터에서 실험동물자원국(DLAR)을 통해 구입되었습니다.
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재료
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