비특이적 조직 형광을 최소화하기 위해 스펙트럼 공초점 현미경을 사용한 하이플렉스 이미징

요약

IBEX(Spectral Iterative Bleaching Extends Multiplexity)는 헤파린 차단을 추가하여 비특이적 결합을 최소화하고 스펙트럼 검출과 전산 혼합 해제를 활용하여 자가형광을 억제함으로써 기본 IBEX 기술을 기반으로 합니다. 이 접근 방식은 배경 소스를 줄이면서 이미지 획득을 가속화하여 강력한 다라운드, 고파라미터 공간 단백질체 분석을 가능하게 합니다.

초록

고도로 다중화된 이미징을 통해 기능적으로 다양한 세포와 천연 조직 환경 내에서 틈새를 연구할 수 있습니다. IBEX(Iterative Bleaching Extends Multiplexity)는 동일한 조직 절편에서 여러 마커를 시각화할 수 있는 순환 면역표지 및 형광단 비활성화 기술입니다. 캡처된 이미지를 이후에 분석하여 단일 세포 데이터를 획득하여 세포 클러스터, 국소화 및 인접 세포 유형을 정의할 수 있습니다. 이러한 데이터를 해석하는 것은 형광 현미경에 내재된 배경 소스와 실제 마커 발현을 구별하는 능력에 의존합니다. IBEX 프로토콜의 적응인 스펙트럼 IBEX는 스펙트럼 공초점 검출과 전산 언믹싱을 통합하고 헤파린 차단을 통합하여 전하 기반 오프 타겟 결합을 줄입니다. 이 조합은 신호 대 배경 비율을 개선하고, 조직 자가형광을 억제하며, 블리드스루를 최소화하는 동시에 기존의 다중 트랙 공초점 이미징에 비해 획득 시간을 단축합니다. 높은 호산구 함량과 강한 자가형광을 특징으로 하는 모델인 인간 비용종 조직에 적용한 결과, 6번의 이미징 라운드에 걸쳐 구조, 면역 및 세포 상태 구획에 걸쳐 26개의 마커에 대한 신뢰할 수 있는 이미징을 입증했습니다. 결과 워크플로우는 복잡한 조직 구조와 세포 틈새를 포착하는 고차원의 공간적으로 분해된 단백질체 정보를 생성합니다. 이 최적화된 접근 방식은 다중 이미징을 위한 강력하고 광범위하게 적용 가능한 전략을 제공하며, 특히 자가형광 및 비특이적 염색이 기존 접근 방식을 제한하는 조직에 적합합니다.

서론

조직은 3차원 구조로 조직되고 상호 작용을 통해 생명에 필요한 생물학적 과정을 조정하는 특수한 기능을 가진 다양한 세포 세트로 구성됩니다. 병리학은 세포 구성 또는 조직 구조의 파괴가 이러한 상호 작용을 방해하고 조직 항상성을 손상시킬 때 발생합니다¹. 인간의 건강과 질병의 기초가 되는 생물학을 이해하려면 수많은 특수 세포 유형이 조직 내에서 어떻게 국소화되고 상호 작용하는지에 대한 지식이 필요합니다.

전사체, 후성유전체학 및 단백질체 수준에서 단일 세포 프로파일링 기술의 발전으로 특수 세포 유형의 예외적인 다양성이 밝혀졌습니다. ^2,3 단일 세포 RNA 시퀀싱 및 스펙트럼 유세포 분석과 같은 기술은 이러한 이질적인 집단을 특성화하는 데 필요한 매개변수 수를 측정할 수 있습니다. 그러나 이러한 접근법에는 세포가 천연 조직 환경에서 단일 세포 현탁액으로 해리되어야 하기 때문에 공간 정보가 부족합니다 ^4,5. 따라서 다양한 질병 맥락과 관련된 세포 유형이 확인되었지만 조직 내 상호 작용과 질병 영속화에 대한 기여도는 불분명합니다.

이러한 한계 중 일부를 해결하기 위해 각 세포의 위치를 보존하면서 조직 내에서 세포 이질성을 포착하기 위해 여러 공간 오믹스 기술이 개발되었습니다⁶. 예를 들어, 유전자 전사는 조직 절편을 가로지르는 래스터화된 지점(예: Visium)에서 RNA를 증폭하거나 단일 세포 해상도(예: Xenium^)로 이미지화된 특정 유전자의 패널을 표적으로 하는 RNA 혼성화 프로브를 사용하여 측정할 수 있습니다^7,8. 이러한 방법은 조직 내 전사 패턴과 조절 메커니즘을 추적하는 데 효과적입니다. 그러나 전사 프로파일은 종종 단백질 발현과 잘 연관되지 않으며, 이는 세포의 기능적 능력을 보다 직접적으로 반영합니다⁹. 단백질 발현은 형광단에 접합된 특정 항체를 사용하여 식별할 수 있으며, 이는 형광 현미경^10,11에 의해 검출될 수 있다. 전통적인 형광 현미경을 사용하면 6개 이상의 항체 접합 형광단을 개별 이미징할 수 있습니다. 그러나, 이들 형광단의 겹치는 여기 및 방출 프로파일은 임의의 주어진 채널⁽¹²)에서 형광 신호의 기원에 대한 불확실성을 초래한다.

IBEX(Iterative Bleaching Extends multipleXity)는 형광 현미경 13,14,15의 이러한 한계를 극복하기 위해 개발된 고함량 이미징 방법입니다. IBEX는 리튬수소화붕소(LiBH₄)를 사용하여 이미징 후 형광단을 화학적으로 비활성화하여 재이미징 전에 동일한 조직 샘플을 후속 형광단 접합 항체로 재염색할 수 있습니다. IBEX는 조직 무결성을 보존하여 동일한 조직 절편에서 이론적으로 무제한의 마커를 시각화할 수 있는 여러 차례의 이미징을 가능하게 합니다. 획득한 이미지의 계산 정렬은 단일 세포 해상도에서 오믹스 수준의 특성화를 제공하는 동시에 공간 데이터를 보존하여 세포 틈새를 드러냅니다. 이 데이터는 또한 추정되는 세포 상호 작용을 밝힐 수 있지만 이는 다른 기술을 사용하여 검증되어야 합니다¹⁶. IBEX는 상업적으로 이용 가능한 형광단과 호환되는 오픈 소스 방법이며 접근성, 신속한 채택 및 고품질 데이터 생성을 촉진하기 위해 시약을 검증하고 데이터를 공개적으로 공유한 국제 연구자 커뮤니티의 지원을 받습니다^17,18.

이 작업에서 IBEX의 수정된 프로토콜은 기술의 두 가지 주요 과제인 조직 자가형광 및 형광단 접합 항체 프로브의 비특이적 결합(총칭하여 배경이라고 함)을 극복하도록 설계되었습니다. 자가형광은 조직에 내인성 형광 분자의 여기가 항체 접합 형광단으로부터 얻은 원하는 신호와 겹치는 빛을 방출할 때 발생합니다^19,20. 형광단 접합 항체의 표적 외 또는 비특이적 결합은 표적 단백질을 발현하지 않는 세포 또는 구조로부터 형광을 초래합니다^21,22. 이러한 아티팩트로 인해 세포가 실제로 발현하지 않는 마커를 발현한다는 부정확한 결론이 내려져 계산 분석과 정확한 세포 유형 할당이 복잡해질 수 있습니다. 오프 타겟 신호의 헤파린 기반 전하 중화와 전체 스펙트럼 획득 및 계산 혼합 해제를 결합함으로써 스펙트럼 IBEX는 블리드스루를 현저하게 줄이고 신호 대 백그라운드 비율(SBR)을 개선하며 라운드당 획득 시간을 절반으로 줄입니다.

프로토콜

이 연구에 사용된 비용종 조직은 Hamilton Integrated Research Ethics Board의 윤리적 승인을 받아 Hamilton Health Sciences에서 부비동 수술 중에 수집되었습니다. 모든 참가자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다.

1. 샘플 수집

1. 만성 비부비동염 환자에게 수행되는 일상적인 용종 절제술 절차 중에 샘플을 채취하십시오. 외과적 제거 시 샘플을 얼음 위에 담긴 의료용 식염수가 들어 있는 바이알에 넣어 운반하고 조직 무결성을 보존하기 위해 이미징을 위해 즉시 처리합니다.

2. 시약 준비

1. 얻어진 고정 및 투과화 용액을 PBS에서 1:4로 희석하여 고정 및 투과화 용액을 준비합니다. PBS에서 30% 자당으로 냉동 보존 용액을 준비합니다. PBS에서 0.1% v/v Triton X-100으로 희석 완충액을 준비합니다.
2. 희석 완충액에서 BSA 블록 시약을 1% w/v 소 혈청 알부민으로 준비합니다. 헤파린 블록 시약을 PBS 1mL에 10KU 헤파린 나트륨염으로 준비합니다. BSA 블록 시약에서 헤파린 블록 시약(1:50)과 Fc 블록 시약(1:100)을 혼합하여 블로킹 완충액을 준비합니다.
3. 블로킹 완충액에서 적절한 희석액으로 적정된 항체로 염색 혼합물을 준비합니다. 초순수 10mL에 LiBH₄ 10mg을 첨가하여 표백액을 준비합니다.

3. 조직 가공 및 총괄

1. 해부 현미경(일반적으로 ~15배 배율, 샘플과 현미경에 따라 다를 수 있음)으로 조직을 검사하고 겸자와 메스로 지방과 뼈를 제거합니다. 조직을 가장 잘 보존하려면 깨끗한 기구를 사용하고 차갑고 젖은 표면에서 작업하고 처리 시간을 최소화하십시오.
2. 메스로 0.5cm 두께의 총 조직을 4-5mm 조각으로 >²³. 슬라이스를 고정 및 투과 용액에 담그고 °C에서 16시간 동안 회전시킵니다.
   참고: 이 용액과 3.3단계의 다른 용액의 부피는 적절한 크기의 튜브에서 샘플 부피의 약 20배여야 합니다.
3. 티슈를 PBS로 옮기고 5분 동안 헹굽니다. 조직을 냉동 보존 용액에 담그고 °C에서 16시간 동안 배양합니다. 이 단계 이후에는 조직에 물이 다시 유입될 수 있으므로 세척하지 마십시오.

4. 조직 동결

1. 각 웰 위에 실험 및 샘플 세부 정보가 있는 6웰 플레이트에 라벨을 붙이고 -20°C 냉동고에 넣어 최소 20분 동안 식힙니다.
2. 적절한 크기의 크라이오몰드에 최적 절단 온도(OCT) 컴파운드로 채웁니다. OCT에서 기포가 생기지 않도록 하십시오. 바늘이나 피펫 팁을 사용하여 큰 기포를 크라이오몰드 가장자리로 드래그합니다.
   알림: 크라이오몰드는 바닥이 평평한 작은 바이알이나 튜브를 감싼 알루미늄 호일을 사용하여 만들 수 있습니다.
3. 냉동 보존 용액에서 조직을 제거합니다. 보푸라기가 없는 티슈 물티슈에 티슈를 가볍게 두드려 과도한 액체를 제거하면 동결이 손상될 수 있습니다.
4. 250mL 비커에 약 100-150mL의 이소펜탄을 흄 후드에 채우고 부분적으로 액체 질소로 채워진 폼 상자 또는 쿨러에 넣습니다.
   참고: 이소펜탄은 2시간 이상 열어 두면 증발합니다. 개봉 후 즉시 사용하십시오. 이소펜탄은 조직의 균일하고 빠른 동결을 촉진합니다. 이소펜탄은 시간이 지남에 따라 천천히 얼 수 있습니다. 고체가 얼면 액체 질소에서 비커를 제거하고 해동시키십시오. 이소펜탄은 뚜껑이 달린 유리병에 부어 최대 5배까지 재사용할 수 있습니다. 이소펜탄의 수준은 비커가 뜨거나 기울어지는 것을 방지하기 위해 액체 질소보다 높아야 합니다.
5. 해부 현미경으로 OCT 내에서 원하는 대로 조직의 방향을 조정합니다.
   참고: 비용종 조직의 경우, 일반적으로 가능한 가장 큰 단면적을 포착하는 대칭 단면을 얻기 위해 장축을 따라 샘플의 방향을 지정합니다. 최적의 포매 방향을 위해 관심 조직에 대한 조직학 매뉴얼을 참조하십시오.
6. 크라이오몰드의 바닥을 이소펜탄에 담그십시오. 조직의 중심이 완전히 흰색이고 불투명할 때 이소펜탄에서 cryomold를 제거합니다. 극저온 몰드를 완전히 잠기지 마십시오. 블록이 깨져 절편이 손상될 수 있습니다.
7. 뒷면에 압력을 가하여 크라이오몰드에서 블록을 부드럽게 꺼내 -20°C에서 미리 냉각된 6웰 플레이트에 넣습니다. 모든 샘플을 동결한 후 장기 보관을 위해 플레이트를 -80°C 냉동고로 옮깁니다.
   참고: 이것은 일시 중지 지점입니다. 조직은 -80°C에서 수년 동안 보관할 수 있습니다.

5. 슬라이드 준비 및 냉동 절편

1. 10-1μL의 크롬 명반 젤라틴 접착제를 슬라이드에 피펫팅합니다. 고르게 펴 바르고 15분 동안 자연 건조시킵니다. 최적의 접착력을 위해 크롬 명반 젤라틴 접착제를 챔버 커버 유리에 2x-3x, 도포당 5μL(총 15μL)를 추가합니다.
2. 건조 후 슬라이드를 80°C의 오븐에 1시간 동안 넣어 완전히 건조되도록 합니다. 챔버형 커버 유리를 사용하는 경우 플라스틱이 80°C에서 녹을 수 있으므로 37°C에서 밤새 건조시키십시오.
   참고: 슬라이드를 코팅하고 건조시킨 후에는 사용할 때까지 며칠 동안 실온에서 보관할 수 있습니다. 먼지를 피하기 위해 덮어야 합니다.
3. 조직을 -80°C에서 -20°C(또는 절단 온도의 극저온 조절기로)로 옮겨 평형을 이루고 절편하기 전에 1시간 동안 미리 냉각합니다. 극저온 조절기에서 10-2μm 절편을 절단합니다²⁴.
   1. 챔버가 있는 커버 유리로 절편하는 경우 롤 방지 플레이트를 들어 올린 후 집게를 사용하여 섹션을 부드럽게 들어 올립니다. 붓을 사용하여 챔버 내부의 유리 위에 평평하게 놓습니다. 엄지손가락으로 덮개 유리 바닥의 샘플 아래를 눌러 섹션을 유리에 녹입니다.
4. 슬라이드를 3°C에서 1시간 동안 또는 실온에서 24시간 동안 건조시킵니다.
   알림: 슬라이드를 즉시 사용하는 경우 슬라이드 상자에 실온에서 임시로 보관하여 염색을 준비하는 동안 먼지로부터 보호할 수 있습니다. 단, 바로 사용하지 않을 경우 -80°C에서 보관하여 조직 무결성을 보존하십시오. 이것은 일시 중지 지점입니다. 슬라이드가 -80°C에서 보관된 경우 여기에서 프로세스를 일시 중지할 수 있습니다.

6. 차단 및 항체 면역표지

1. PAP 펜을 사용하여 조직 주위의 유리에 원을 그려 염색 또는 기타 단계에서 액체를 포함하는 소수성 장벽을 만듭니다. OCT가 녹으면 소수성 잉크가 씻겨 나가므로 OCT 위에 그려가지 마십시오.
   알림: 벽이 웰에 액체를 고정하기 때문에 챔버 커버 유리에는 이 단계가 필요하지 않습니다.
2. 각 조직에 ~100 μL의 PBS를 첨가하고 실온에서 ~2분 동안 배양하여 조직을 재수화하고 OCT를 씻어냅니다. 챔버 커버 유리에 ~1 mL의 PBS를 사용합니다.
   알림: 유리에서 조직이 들어 올리는 것을 방지하려면 액체를 샘플에 직접 피펫팅하지 마십시오.
3. PBS를 흡인하고 100μL의 차단 완충액을 추가합니다. 뚜껑이 있는 습도 챔버에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 챔버형 커버 유리에 ~400 μL의 차단 완충액을 사용합니다.
4. 블로킹 완충액을 흡인하고 염색 혼합물 100μL를 첨가합니다. 뚜껑이 있는 습도 챔버에서 밤새 냉장고 내부(4°C)에 넣어 배양합니다. 챔버 커버 유리에 ~400 μL의 염색 혼합물을 사용합니다. 형광단의 스펙트럼과 조직의 자가형광을 정의하기 위해 패널의 형광단 중 하나로만 염색된 절편과 염색이 없는 음성 대조군을 준비합니다.
   참고: 항체 희석액은 1:50, 1:100 및 1:200 또는 필요에 따라 다른 희석액으로 적정하여 실험적으로 최적화되어야 합니다. 최적의 신호를 생성할 수 있는 항체의 최소 양을 선택하십시오. 스펙트럼 혼합 해제 효과를 극대화하기 위해 패널에 있는 모든 항체의 강도가 거의 동일하도록 하십시오. 형광단의 광표백을 최소화하기 위해 이 단계 이상의 빛으로부터 샘플을 보호하십시오.
5. 염색 혼합물을 흡인하고 PBS(10μL, 각 2분)로 3회 세척하고 각 세척 사이에 액체를 흡인합니다. 챔버형 커버 유리에 ~1mL의 PBS를 사용합니다.
6. 각 섹션에 ~10 μL의 마운팅 미디어를 추가합니다. 이미징하는 동안 광학 수차를 생성하는 기포를 피하기 위해 천천히 피펫팅하십시오. 피펫을 사용하여 형성된 기포를 흡인합니다. 챔버형 커버 유리의 경우 각 웰에 1mL의 마운팅 미디어를 추가합니다.
   참고: 다음 단계인 6.7 및 6.8은 챔버 커버 유리에 필요하지 않습니다.
7. 1번 22mm x 50mm 커버 유리를 시편 위에 부드럽게 놓습니다.
   알림: 커버 유리의 한쪽 끝을 장착 매체에 단단히 누르고 유리가 샘플 위에 떨어지도록 하여 매체를 고르게 퍼뜨려 기포를 최소화할 수 있습니다. 커버 유리의 두께는 대물 렌즈의 사양과 일치해야 합니다(예: 대부분의 높은 개구수 대물렌즈의 경우 #1.5 커버슬립). 대물 렌즈에 보정 칼라가 있는 경우 올바른 커버슬립 크기로 조정되었는지 확인하십시오. 잘못된 두께 또는 칼라 설정을 사용하면 구면 수차가 발생하여 이미지가 흐릿하거나 왜곡될 수 있습니다.
8. 슬라이드를 뒤집고 보푸라기가 없는 물티슈를 부드럽게 눌러 여분의 마운팅 매체를 밀어냅니다.
   알림: 슬라이드에 너무 많은 힘을 끼워 아래로 누르지 마십시오. 과도한 힘을 가하면 조직이 손상되거나 변형되어 이미징 라운드 간의 정렬에 영향을 미칠 수 있습니다.

7. 현미경 설정 및 이미징

참고: 이 프로토콜은 특히 ZEISS LSM980 및 기타 ZEISS 시스템을 나타냅니다. 이러한 단계는 다른 시스템에서는 다를 수 있습니다. 두 가지 워크플로가 자세히 설명되어 있습니다: 전통적인 공초점 + 언믹싱(전산 스펙트럼 언믹싱 사후 믹싱을 통한 다중 트랙 획득), 스펙트럼 검출기를 사용할 수 없을 때 사용할 수 있지만 획득 시간이 더 길고 약간의 잔류 블리드스루가 있습니다. 전체 스펙트럼 감지(단일 패스, 34채널 스펙트럼 획득)는 최고의 SBR, 거의 0에 가까운 누화 및 가장 빠른 이미징 시간을 제공하기 때문에 선호하는 방법입니다.

1. 전통적인 공초점 현미경
   1. 이미징 약 30분 전에 현미경 시스템(레이저, 검출기 및 컴퓨터 포함)의 전원을 켭니다.
   2. 현미경 > 대물렌즈를 클릭하여 도달한 현미경 제어 화면에서 적절한 대물 렌즈(예: 20x 0.8 NA)를 선택하고 필요한 경우 렌즈 안전 물티슈로 청소합니다.
   3. 샘플을 스테이지에 단단히 장착합니다. 연속 라운드의 XY 정렬을 용이하게 하기 위해 유리 또는 덮개 유리 챔버를 슬라이드 홀더의 동일한 모서리/끝에 정렬하십시오. 이것은 설치된 홀더에 따라 다릅니다.
   4. GFP, YFP 또는 RFP 조명의 접안렌즈를 사용하여 샘플에 초점을 맞춘 다음 컴퓨터 화면의 획득 탭으로 전환합니다.
      참고: DAPI 얼룩을 UV 광선에 노출시키면(DAPI 필터 큐브 사용) 녹색 형광 분자로 광변환되기 때문에 접안렌즈를 사용하여 샘플에 초점을 맞출 때 DAPI 필터를 사용하지 마십시오(보충 그림 1A).
   5. 중첩 및 교차 레이저 여기를 최소화하는 이미징 트랙을 구성합니다(보충 표 1, 보충 표 2는 여기에 표시된 기존 공초점 현미경 실험에 대한 획득 설정을 보고합니다).
      참고: 이상적인 조합에는 AF594, AF647 또는 AF700과 함께 DAPI 또는 AF488과 같은 뚜렷한 여기 및 방출 피크가 포함됩니다.
      1. 각 트랙에 최적의 여기 레이저를 할당합니다. 최적의 광학 절편을 위해 각 트랙에 대해 핀홀 크기를 1 AU 또는 Airy Unit으로 조정하십시오.
      2. 트랙의 형광단에 따라 트랙의 각 조정 가능 검출기에 대한 획득 파장 범위를 개별적으로 조정합니다.
      3. 레이저 출력 및 검출기 게인 설정을 조정하여 SBR을 최대화합니다. 최대 강도에 도달하는 픽셀이 거의 없는지 확인합니다.
         알림: 검출기의 광표백 및/또는 과다 노출을 방지하려면 레이저 출력을 가능한 한 낮게 유지하십시오. 항체 희석을 최적화하여 배경 위에서 강한 신호가 검출되도록 합니다.
   6. 연속 스캔 모드 버튼을 눌러 샘플을 미리 보고 스캔 매개변수(필요한 경우 스캔 속도, 해상도 및 평균화)를 설정합니다.
      알림: 작은 타일의 경우 배경을 최소화하려면 0.2-0.3μs 사이의 체류 시간과 1-2개의 평균 라운드를 사용하는 것이 좋습니다. 분할 및 단일 셀 해상도를 유지하면서 속도를 최대화하려면 평균화 없이 가장 빠른 스캔 속도와 0.2-0의 픽셀 크기를 사용합니다. μm/픽셀. 예를 들어, 20x/0.80 NA 대물렌즈를 사용하여 타일당 2048 x 2048 픽셀로 이미징하면 424.26 x 424.2 μm² 필드에서 0.20 μm/픽셀이 생성됩니다.
   7. 각 트랙에 대한 테스트 스캔을 수행하여 누화 또는 블리드스루를 확인합니다.
      1. 모든 마커로 염색된 슬라이드에서 연속 스캔 모드에서 각 레이저를 저전력으로 시작하고 채도 없이 마커가 명확하게 보일 때까지만 레이저를 올립니다(LUT/채도 표시기 사용).
         참고: 가능하면 실험 샘플을 이미징하기 전에 복제 샘플 또는 원하지 않는 영역을 사용하여 현미경 설정을 최적화하는 것이 좋습니다. 이는 DAPI(광전환의 위험을 피하기 위해) 또는 광표백이 빠르게 이루어지는 형광단(예: PE)으로 염색할 때 특히 중요합니다.
      2. 해당 형광단에 대한 단일 염색 대조군으로 이동합니다. 신호가 밝고 불포화되도록 레이저 출력과 검출기 게인을 조정합니다.
      3. 동일한 단일 염색 슬라이드에서 다른 모든 검출 채널을 스캔합니다. 오프 채널 강도가 배경을 초과하면 감지 창을 좁히거나 여기/게인을 낮춥니다.
      4. 각 형광단에 대해 7.1.7.1-7.1.7.2를 반복합니다. 조정 후에는 이전에 최적화된 염색을 간략하게 확인하여 특히 공동 국소화되는 마커의 경우 강도를 비교할 수 있도록 합니다.
   8. 타일 기능을 사용하도록 설정하고 타일 획득 영역을 정의합니다.
      1. 조직 중앙의 타일 획득 영역에 초점을 최적화합니다. 이후 라운드에서 정렬하기 위한 참조로 고유한 기능(특정 배열의 셀 집합)을 찾습니다.
   9. Z-stack 기능을 활성화하고 Z-stack 탭으로 이동합니다. 가운데 탭으로 이동합니다. Z-스택의 슬라이스 수를 슬라이스 사이에 최소 1μm의 간격으로 최소 6개로 설정합니다. 그런 다음 중앙 버튼을 클릭하여 현재 초점 포인트(6.1.8.1단계에서 결정됨)를 스택의 중간 슬라이스로 배치합니다.
   10. 실험 시작 버튼을 클릭하여 이미지 획득을 시작합니다. 이미지 썸네일을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 다른 이름으로 저장을 선택하여 획득 설정을 저장하고 이미지 데이터를 백업합니다. 그런 다음 파일 위치를 선택하고 이미지 이름을 지정합니다.
   11. 타일 영역 획득에서 동일한 최적화된 설정을 사용하여 이미지를 언믹스하고, 각 단일 염색 컨트롤에서 Snap을 캡처하여 실제 신호 스펙트럼을 얻고, 염색되지 않은 컨트롤에서 Snap을 캡처하여 6.4단계에서 준비한 배경/자가형광을 캡처합니다.
       1. 이 이미지는 스펙트럼 혼합 해제에 사용됩니다. 다중화된 샘플에서 True Signal을 선택하지 마십시오. 먼저 염색되지 않은 대조군에서 강도/형태가 없거나 배경과 동등한지 확인한 다음 마커의 예상 국소화(예: 막 대 핵 대 세포질 대 분비 패턴)를 일치시켜 선택한 영역이 실제로 신호를 나타내는지 확인합니다.
       2. 스냅 이미지를 엽니다. Unmixing 탭을 클릭합니다. Unmix tools 탭에서 영역 선택 도구 중 하나를 사용하여 양의 신호 주위에 ROI를 그립니다(해당 영역의 스펙트럼이 나타남). 각 형광단의 각 스냅 이미지에 대해 이 작업을 반복하여 혼합 해제를 위한 참조 스펙트럼을 생성합니다.
          1. 이 스펙트럼을 형광단의 이론적 스펙트럼과 비교하여 선택한 영역이 실제 신호를 대표하는지 확인합니다. 각 형광단에 따라 스펙트럼의 이름을 지정하고 스펙트럼 데이터베이스에 저장합니다.
             참고: 자가형광에 대한 스펙트럼은 다른 신호와 혼합되지 않도록 별도의 형광단으로 식별 및 처리할 수 있습니다. 패널 최적화가 완료되면 동일한 프로토콜과 조직 유형을 사용하는 한 동일한 설정을 재사용할 수 있으므로 새로운 참조를 획득할 필요가 없습니다.
       3. 타일 이미지를 로드하고 Unmixing 도구로 이동합니다. + 버튼을 사용하여 각 형광단에 대한 참조 스펙트럼을 언믹싱 목록에 추가한 다음 선형 언믹싱 버튼을 클릭합니다.
   12. 나중에 분석할 수 있도록 혼합되지 않은 이미지를 저장합니다.
       참고: 출력은 모든 마커에 대한 채널이 있는 다중 타일 이미지입니다. 계속하기 전에 여기에서 실험을 일시 중지할 수 있습니다.
   13. 음영 참조 이미지 획득
       1. 샘플을 이미지화하는 데 사용된 것과 동일한 설정을 사용하여 DAPI 보정 슬라이드의 이미지를 수집합니다. 이미지를 저장한 다음 음영 참조 역할을 할 DAPI 채널만 추출합니다. 출력은 평평한 필드 이미지입니다(보충 그림 1B).
          참고: 모든 샘플에 대해 참조 이미지를 획득할 필요는 없습니다. 동일한 설정을 가진 동일한 기기를 사용하는 한 참조는 동일해야 합니다. 보충 그림 1C와 같이 획득한 이미지에 음영 아티팩트가 없는 경우 이 참조가 필요하지 않습니다.
2. 스펙트럼 공초점 현미경
   1. 현미경 시스템(레이저, 검출기 및 컴퓨터 포함)의 전원을 켭니다. 적절한 대물 렌즈(예: 20x 0.8 NA 또는 기타 대물렌즈)를 선택하고 필요한 경우 청소하십시오.
   2. 샘플을 스테이지에 단단히 장착합니다. 커버슬립이 대물렌즈를 향하고 있는지 확인하십시오.
   3. 명시야 또는 DIC를 사용하여 샘플에 초점을 맞춘 다음 형광 모드로 전환합니다. 스펙트럼 획득을 구성합니다. 보충 표 3은 여기에 표시된 스펙트럼 공초점 현미경 실험에 대한 획득 설정을 보고합니다.
      1. 올바른 레이저를 할당합니다.
         참고: 일부 레이저는 여러 형광단을 여기시킬 수 있습니다. 따라서 각 형광단에 대해 고유한 레이저가 필요하지 않을 수도 있습니다.
      2. 사용 중인 레이저 라인에 적합한 빔 스플리터를 선택하십시오. 모든 검출기가 가능한 한 많은 스펙트럼을 캡처할 수 있도록 합니다. 최적의 광학 절편을 위해 핀홀 크기를 1 AU로 조정하십시오.
   4. 레이저 설정 최적화
      1. 모든 마커로 염색된 섹션을 사용하여 저전력으로 레이저로 연속 스캔 모드를 시작합니다. 좋은 SBR에서 마커를 식별할 수 있을 때까지 각 레이저의 강도를 조정합니다.
         참고: 이렇게 하면 스펙트럼적으로 겹치는 형광단에 대한 정밀한 조정이 가능하지는 않지만 단일 염색 슬라이드를 현미경으로 전환해야 하는 횟수를 최소화하는 데 도움이 됩니다.
      2. 단일 염색 섹션을 사용하여 각 형광단에 대한 레이저 강도를 미세 조정합니다. 각 마커의 신호가 과포화 없이 시각화될 수 있을 때까지 단일 염색 섹션에서 모든 마커가 있는 섹션으로 반복적으로 전환합니다.
         알림: 레이저 강도 또는 게인 설정이 조정될 때마다 이전에 최적화된 단일 염색 슬라이드를 다시 방문하여 신호가 최적으로 유지되는지 확인하십시오. 가장 최적의 혼합 해제를 위해 신호 강도 수준은 마커 간, 특히 공국소화되는 마커 간에 가능한 한 유사해야 합니다. 가능하면 실험 샘플을 이미징하기 전에 복제 샘플 또는 원하지 않는 영역을 사용하여 현미경 설정을 최적화하는 것이 좋습니다. 이는 DAPI(광전환의 위험을 피하기 위해) 또는 광표백이 빠르게 이루어지는 형광단(예: PE)으로 염색할 때 특히 중요합니다.
   5. 7.1.8 - 7.1.14단계를 수행합니다.

8. 커버슬립 제거(챔버 커버 유리가 아닌 슬라이드에만 적용됨)

1. 슬라이드를 PBS에 담그고 커버슬립이 분리되도록 합니다. 커버슬립을 강제로 떼어내면 조직이 변형되어 후속 이미징 라운드에서 정렬 문제가 발생하거나 슬라이드에서 완전히 분리될 수 있으므로 사용하지 마십시오. 슬라이드에 맞을 만큼 큰 용기를 사용하고 PBS에 완전히 잠길 수 있는지 확인하십시오.

9. 형광단 표백 및 순환

1. 챔버 커버 유리 전용: 조직이 손상되지 않도록 주의하면서 피펫을 사용하여 가능한 한 많은 장착 매체를 흡인합니다.
   알림: 챔버를 옆으로 기울이면 흡인이 용이할 수 있습니다.
2. 마운팅 미디어가 완전히 제거될 때까지 ~1mL(챔버형 커버글라스) 또는 ~100μL(슬라이드)의 PBS로 2분 동안 3회 세척합니다.
3. 흄 후드에 표백액을 준비합니다. 마이크로 주걱을 사용하여 10mg LiBH₄ 를 마른 비커에 직접 무게를 잰다. LiBH₄ 가 들어 있는 비커에 초순수 10mL를 조심스럽게 직접 넣고 완전히 녹을 때까지 혼합하여 표백 용액을 만듭니다.
   알림: 최대 반응성을 위해 사용하기 직전에 준비하십시오.
   주의: LiBH₄ 는 가연성이 매우 높으므로 이 단계에서는 흄 후드를 올바르게 사용하고(예: 적절한 높이의 새시, 적절한 PPE 등) 한 번에 <10mg의 LiBH₄ 로만 작동하도록 각별한 주의가 필요합니다. LiBH4를 추가하기 전에 비커가 완전히 건조되었는지 확인하십시오 - 그렇게 하지 않으면 화재가 발생할 수 있습니다.
4. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 ~100μL의 표백 용액을 각 조직 절편에 첨가하고 훈기 후드에서 실온에서 15분 동안 배양합니다. 챔버 슬라이드에 표백액 2mL를 사용합니다.
5. BV 염료(예: BV421, BV510 등)를 표백하는 경우 웰을 현광 현미경으로 조심스럽게 옮깁니다. DAPI 필터를 선택하고 샘플에 초점을 맞추고 최대 전력으로 조명합니다.
   1. 더 넓은 조명 필드를 위해 5x 대물렌즈를 사용하십시오. 대물렌즈와 하우징의 손상을 방지하기 위해 스테이지를 가능한 한 낮게 내립니다.
6. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 LiBH₄ 용액을 웰에서 디캔팅하고 LiBH₄ 용액의 비커에 다시 추가합니다.
   참고: 이것은 이제 LiBH₄ 폐기물입니다. 용액은 나중에 사용할 수 있도록 저장할 수 없습니다.
7. 슬라이드를 희석 완충액으로 3회 세척하고 ~3분 동안 배양합니다. 챔버 슬라이드의 총 부피는 2mL입니다.
8. 항체 혼합물을 추가하고 일반 프로토콜에 따라 염색합니다(6.3 - 6.8단계).
9. 2N H₂SO₄ 를 연기의 폐기물 LiBH₄ 에 적가하여 정기적으로 혼합합니다.
   주의: LiBH₄는 공격적으로 기포가 발생합니다. 이 기포는 LiBH₄에서 방출되는 H₂ 가스입니다. H₂는 가연성이 매우 높으므로 이 단계에서 각별한 주의를 기울이고 H₂SO₄를 매우 천천히 첨가하십시오.
10. 용액이 더 이상 거품이 나지 않으면 흡수성 언더패드에 붓습니다. 비커를 초순수로 헹구고 흡수성 언더패드에 붓습니다.
    주의 : 흡수성 언더패드를 화학/생물학적 위험 백에 넣고 고정한 다음 현지 화학적 위험 지침에 따라 폐기하십시오.

10. 이미지 사후 획득 처리

1. Zen 소프트웨어에서 파일 > 열기 > 참조 이미지 선택을 클릭하여 참조 이미지(7.1.14단계부터)를 엽니다.
   참고: 획득 후 이미지 처리 단계는 오픈 소스 소프트웨어 패키지에서 수행할 수도 있습니다. (예: ImageJ).
2. 밝기와 대비를 조정하여 다이내믹 레인지를 최적화하려면 처리 > 강도 > 대비 스트레치 > 자동 > 적용을 클릭합니다.
3. 이미지 처리 > 픽셀 유형 변환 > 픽셀 유형 변환 > 32비트(부동 소수점)를 클릭하여 픽셀 유형을 32비트로 변경합니다.
4. > 강도 처리 > 정규화(채도 픽셀 = 0%) > 적용을 클릭하여 참조 이미지를 정규화합니다.
5. 처리 > 가우스 > 스무딩을 클릭하여 참조 이미지를 매끄럽게 > 반경(예: 2-5px) > 적용을 입력합니다(보충 그림 1B).
   참고: 다른 값을 시도하여 가우스 흐림 반경을 최적화합니다. 올바른 값을 알기 위해서는 원시 참조 이미지를 처리된 이미지로 나누고(이미지 계산기> 처리하고, 결과 이미지의 강도가 균일해야 합니다(모든 픽셀이 거의 동일한 값).
6. 파일 > 열기를 클릭하여 수정할 다중 타일 이미지를 열고 다중 타일 이미지를 선택합니다> 선택합니다.
7. 다음 매개변수와 함께 처리 > 스티칭을 클릭하여 처리된 참조를 사용하여 스티칭 및 음영 보정을 적용합니다.
   1. 블렌드 상자를 선택합니다. 올바른 음영 상자를 선택하고 드롭다운 메뉴에서 처리된 참조 이미지를 선택합니다(10.5단계). 다른 모든 매개변수는 동일하게 유지합니다.
      알림: 최상의 결과를 얻으려면 매개변수를 조정해야 할 수 있습니다.
   2. 입력/출력 메뉴에서 다중 타일 이미지를 입력으로 선택하고 음영 참조를 참조로 선택합니다.
   3. 상단의 적용 버튼을 누르면 스티칭과 음영이 수정된 새 이미지가 생성됩니다(보충 그림 1D).
      참고: 스티칭 보정(보충 그림 1I-J)은 프로세스 후반에 이미지 정렬의 정확성을 보장하기 위해 필요합니다.
   4. 파일 > 저장> 폴더 선택을 클릭하여 수정된 이미지를 저장합니다.

11. 이미지 정렬

1. Imaris 파일 변환기 도구를 사용하여 처리된 이미지를 형식(.czs, .tif 등)에서 Imaris 형식으로 변환합니다.
   알림: 이 도구는 이 웹 사이트(https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter)의 지침에 따라 다운로드하여 설치할 수 있습니다.
2. Imaris 확장 등록 도구를 실행하여 모든 라운드의 이미지를 모든 채널이 있는 하나의 이미지로 등록(정렬)합니다.
   알림: 도구를 설치하고 이미지를 성공적으로 정렬하려면 다음 웹 사이트(https://github.com/niaid/imaris_extensions)의 지침을 따르십시오.
3. Imaris 확장 단추를 클릭합니다. SimpleITK 유틸리티 > 채널 설정을 CSV로 내보내기를 선택합니다.
4. 찾아보기를 클릭하고 라운드 중 하나에서 .ims 이미지로 이동하여 선택한 다음 열기를 클릭합니다.
5. 내보내기를 클릭하고 CSV 파일을 저장할 위치를 선택합니다. 이름을 입력하고 저장을 클릭합니다.
6. 저장된 CSV 파일을 열고 채널 이름이 올바른지 확인합니다. 필요한 경우 편집합니다.
7. 편집이 이루어진 경우 Imaris Extensions > SimpleITK Utilities > Batch Configure Channel Settings로 이동합니다.
   참고: 이전 단계에서 편집하지 않은 경우에는 이 단계가 필요하지 않습니다.
8. 찾아보기를 클릭하고 CSV 파일로 이동하여 선택한 다음 열기를 클릭합니다. 다음을 클릭한 다음 찾아보기를 다시 클릭하여 동일한 .ims 이미지를 선택하고 열기를 클릭합니다.
9. 구성을 클릭하여 변경 사항을 적용합니다. 다른 라운드의 모든 이미지에 대해 11.3-11.8단계를 반복합니다.
10. 채널 이름이 올바르게 지정되면 공통 채널을 사용하여 Z-Stacks의 아핀 등록을 > SimpleITK 알고리즘 > Imaris Extensions로 이동합니다.
11. 찾아보기를 클릭하고 모든 라운드가 포함된 폴더로 이동한 다음 모든 이미지를 선택한 다음 열기를 클릭합니다.
12. 다음을 클릭하고 등록 채널(기준 채널)을 선택합니다. 이 프로토콜의 경우 DAPI 채널이 사용되었습니다. 그런 다음 고정 이미지를 선택합니다.
    참고: 라운드 전반에 걸쳐 일정하게 유지되고 화학적 또는 광표백(예: DAPI와 같은 핵 염료)에 대한 내성이 있는 채널/마커를 선택하십시오. 그런 다음 고정 이미지를 선택합니다.
13. 고급 등록 설정을 클릭하고 자동 마스크를 제외한 모든 상자를 선택한 다음 가우스 스무딩 시그마를 5.0으로 설정합니다.
14. 완료를 클릭한 다음 등록을 클릭하여 정렬을 수행합니다. 등록이 완료되면 Resample(리샘플링) 및 결합된 이미지 저장(Save Combined Image)을 클릭합니다.
15. 리샘플링 후 기준 채널을 선택하고 상 관 계산을 클릭합니다. 출력 파일에는 정렬된 output.ims 이미지, 등록 전후의 정렬 품질을 보여주는 두 개의 PDF, 등록에 사용된 설정이 포함된 JSON 파일, 전체 프로세스의 로그가 포함된 TXT 파일이 포함됩니다.

12. 이미지 정렬

1. CellPose를 사용하여 셀/객체 분할(v2.5)²⁵
2. 각 단일 염색 데이터 세트에 대해 마커의 자체 검출 채널에서 하나의 분할 마스크를 생성합니다(예: CD20 단일 염색의 경우 AF488 검출 채널(CD20의 의도된 채널)에서 마스크를 생성합니다).
3. 2단계의 분할 마스크를 동일한 데이터 세트의 모든 채널에 적용합니다(CD20 예에서 AF488에서 파생된 마스크는 실제 신호를 측정하기 위해 AF488에 적용되고 블리드스루를 측정하기 위해 다른 모든 감지 채널에 적용됩니다).
4. scikit-image(regionprops_table) 및 NumPy를 사용하여 Python에서 객체별 강도 및 영역을 추출합니다.
5. 신호 대 백그라운드 비율(SBR)
   1. 마커의 의도한 감지 채널에서 분할된 모든 ROI에 걸쳐 평균 객체 강도를 계산합니다.
   2. 배경 강도를 동일한 시야에서 ROI 외부의 모든 픽셀의 평균 강도로 정의하며, 0 값 패딩 또는 범위를 벗어난 픽셀을 제외합니다.
      SBR을 다음과 같이 계산합니다.
      
   3. 바이올린 플롯으로 SBR 분포를 시각화하여 객체별 값을 점(또는 표시된 경우 필드별 값)으로 표시합니다.
6. 블리드스루 정량화
   1. 의도하지 않은 각 채널에 대해 12.2단계에서 마스크에서 동일한 ROI를 사용하여 블리드 스루(%)를 계산합니다.
      
   2. 참고: 단일 염색 이미지의 의도된 채널에서 분자와 분모가 동일하기 때문에 대각선 항목은 100%와 같습니다(자체 채널에서 측정된 실제 마커 신호).

결과

면역형광 이미징 기술이 직면한 두 가지 근본적인 과제는 형광단 접합 항체 프로브의 비특이적 결합과 조직 자가형광입니다. 이 프로토콜은 다중화된 면역형광 기술을 최적화하기 위해 실제 신호와 배경을 구별하는 데 도움이 되도록 설계되었습니다.

헤파린 차단은 신호를 보존하면서 비특이적 형광단 결합을 감소시킵니다.

과립구는 마커^26,27의 예상 형태학적 분포와 일치하지 않는 고강도 표적 외 형광으로 악명이 높습니다. 예를 들어, 만성 비부비동염 환자의 비용종 조직에서 막 ...

토론

IBEX 프로토콜을 채택한 Spectral IBEX는 면역형광 이미징의 두 가지 주요 문제인 비특이적 결합과 자가형광을 성공적으로 해결합니다. 호산구성 조직을 헤파린으로 처리하고 스펙트럼 혼합 해제를 사용하여 채널 간의 자가형광 및 스펙트럼 중첩을 제거하면 배경 위의 실제 신호 검출이 크게 증가했습니다. 단일 패스로 모든 마커를 캡처하면 획득 시간이 단축되어 IBEX 사이클링 속도가 증가할 수 있습니다. 스펙트럼 검출기를 사용할 수 없는 경우 전산 언믹싱을 통한 기존의 공초점 획득을 사용할 수 있지만, 감도를 극대화하고 블리드스루를 사실상 제거하며 라운드당 이미징 시간을 절반으로 단축하므로 전체 스펙트럼 검출이 권장됩니다. 다양한 연구 환경에서 여러 IBEX 양식의 구현을 지원하기 위해 제안, 고려 사항 및 데이터가 포함된 Spectral IBEX에 대한 자세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다.

조직 자가형광은 형광 이미징...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2N 황산(H2SO4) 용액	해당 없음	해당 없음	실험실에서 사용 가능하거나 사용하는 모든 것을 다
500 mL 비커	해당 없음	해당 없음	실험실에서 사용 가능하거나 사용하는 모든 것을 다
6웰 플레이트	해당 없음	해당 없음	실험실에서 사용 가능하거나 사용하는 모든 것을 다
Bcl-6 - 알렉사 플루어 647	BD 생명과학	561525	희석 계수 1:100
BD 세포고정/세포 고정/투과화 키트	BD 생명과학	554722
벤치탑 해부 현미경	해당 없음	해당 없음	실험실에서 사용 가능하거나 사용하는 모든 것을 다
소 혈청 알부민 (BSA)	시그마-올드리치	A4503
CD11c - 알렉사 플루어 700	BD 생명과학	561352	희석 계수 1:100
CD138/Syndecan-1 - PE	바이오레전드	356503	희석 계수 1:200
CD20 - 알렉사 플루어 488	인비트로젠	53020282	희석 계수 1:100
CD21 - 알렉사 플루어 532	노버스바이오	NBP2-60733AF532	희석 계수 1:100
CD23 - PE	바이오레전드	338507	희석 계수 1:200
CD3 - 아이플루오 594	AAT 바이오퀘스트	100320C0	희석 계수 1:100
CD31 - 알렉사 플루어 700	바이오레전드	303134	희석 계수 1:100
CD34 - 아이플루오 594	AAT 바이오퀘스트	103400C0	희석 계수 1:100
CD38 - 알렉사 플루어 700	바이오레전드	303523	희석 계수 1:100
CD4 - 알렉사 플루어 647	바이오레전드	300520	희석 계수 1:100
CD45 - 알렉사 플루어 532	서모피셔 사이언티픽	58045942	희석 계수 1:100
CD54/ICAM-1 - 알렉사 플루어 647	바이오레전드	353113	희석 계수 1:100
크롬 알룸-젤라틴 접착제	신입 공급	1033A
크라이오몰드	피셔 사이언티픽	NC9511236	또한, 더 큰 샘플을 위한 카탈로그 번호 50-465-347도 참고하세요
DAPI 보정 슬라이드	아가르 사이언티브	AG2273
DAPI 용액, 1 mg/mL	서모피셔 사이언티픽	62248	희석 계수 1:3000
E-카데린/CD324 - 알렉사 플루어 647	바이오레전드	147307	희석 계수 1:100
EpCAM/CD326 - 알렉사 플루어 594	바이오레전드	324228	희석 계수 1:100
에펜도르프/매 튜브	해당 없음	해당 없음	실험실에서 사용 가능하거나 사용하는 모든 것을 다
플루오로몬트-G	서던바이오텍	0100-01
겸자	해당 없음	해당 없음	실험실에서 사용 가능하거나 사용하는 모든 것을 다
폭스P3 - e플루오 660	서모피셔 사이언티픽	50577382	희석 계수 1:100
서리 끝 현미경 슬라이드	켐사이언스	GEW45-2575-W
GL7 - 알렉사 플루어 488	서모피셔 사이언티픽	53590282	희석 계수 1:100
헤파린 나트륨 염	시그마-올드리치	H3393	10KU
HLA-DR - PE	노버스바이오	NB100-77855PE	희석 계수 1:200
휴먼 트루스테인 FcX (Fc 수용체 차단 솔루션)	바이오레전드	422302	희석 계수 1:100
습도 챔버	해당 없음	해당 없음	실험실에서 사용 가능하거나 사용하는 모든 것을 다
뚜껑 달린 얼음통	해당 없음	해당 없음	실험실에서 사용 가능하거나 사용하는 모든 것을 다
IgD - 알렉사 플루어 488	바이오레전드	348215	희석 계수 1:100
IL4Ra/CD124 - PE	바이오레전드	144803	희석 계수 1:200
이마리스 파일 변환기	옥스퍼드 악기	해당 없음	이미지 파일 형식을 .ims 포맷(https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter)으로 커버하기
이소펜탄 (2-메틸부탄)	해당 없음	해당 없음	실험실에서 사용 가능하거나 사용하는 모든 것을 다
Ki-67 - 알렉사 플루어 488	BD 생명과학	558616	희석 계수 1:100
킴벌리-클라크 프로페셔널 킴텍 사이언스 킴와이프 섬세한 작업 와이퍼, 1층	킴텍 사이언스	06-666
크고(즉, 길이 25cm) 겸자	해당 없음	해당 없음	실험실에서 사용 가능하거나 사용하는 모든 것을 다
액체 질소	해당 없음	해당 없음	실험실에서 사용 가능하거나 사용하는 모든 것을 다
붕화리튬(LiBH4)	시그마-올드리치	222356
MECA-79 - 알렉사 플루어 488	인비트로젠	53603680	희석 계수 1:100
현미경 슬라이드 커버 유리 No.1 22x50 mm	피셔 사이언티픽	12-542A
밀리-Q 물	해당 없음	해당 없음	실험실에서 사용 가능하거나 사용하는 모든 것을 다
MUC2 - 알렉사 플루어 488	노버스바이오	NB120-11197AF488	희석 계수 1:100
Nunc Lab-Tek 챔버드 커버글라스	서모피셔 사이언티픽	155380
PAP 펜	ABCAM	AB2601
인산염 완충 식염수(PBS) 용액	해당 없음	해당 없음	실험실에서 사용 가능하거나 사용하는 모든 것을 다
메스	해당 없음	해당 없음	실험실에서 사용 가능하거나 사용하는 모든 것을 다
SimpleITK Imaris 확장	해당 없음	해당 없음	서로 다른 라운드의 이미지를 정렬하는 데 사용된 소프트웨어 (https://github.com/niaid/imaris_extensions)
자당	시그마-올드리치	S0389
티슈텍 O.C.T. 복합물	사쿠라 파인텍 USA	4583
트리톤 X-100	시그마-올드리치	X100
자이스 LSM 980	자이스 현미경	해당 없음	이 연구에 사용된 영상 시스템
젠 블루	자이스 현미경	해당 없음	포스트 획득 이미지 처리에 사용되는 소프트웨어