종양내 금 나노로드에 의한 근적외선의 광열 변환을 통한 쥐 종양 모델에서 표적 경미한 온열요법 유도

요약

이 프로토콜은 고형 종양 모델에서 표적 온열 요법에 필요한 기술과 방법론을 제시합니다. 이 접근법은 종양 내 주입된 금 나노로드에 의한 근적외선의 광열 변환을 활용하여 종양 미세 환경 내에서 국부적인 가열을 유도합니다.

초록

경미한 온열요법(42-48°C)은 제어된 종양 세포 사멸을 유도하고 항암 면역 반응을 자극할 수 있는 잘 확립된 치료 방식입니다. 그러나 주변의 건강한 조직을 보존하면서 종양 조직에 열을 정확하게 전달하는 것은 여전히 중요한 과제로 남아 있습니다. 고립된 사지 관류와 같은 전통적인 온열요법 방법은 복잡하고 침습적인 절차가 필요하며 국소 독성 및 환자 이환율의 상당한 위험을 수반합니다. 대조적으로, 근적외선(NIR) 빛에 의해 활성화되는 금 나노입자를 사용하는 광열 요법은 국부적인 온열요법을 달성하기 위한 유망하고 덜 침습적인 전략으로 부상했습니다. 특히 금 나노로드(GNR)는 조정 가능한 광학 특성과 높은 광열 변환 효율을 나타내므로 종양 부위의 정밀한 열 변조에 이상적인 후보입니다. 이 기술은 특히 표면적이고 접근 가능한 종양에 대해 상당한 가능성을 보여주었지만 재현 가능한 전달, 공간 제한 및 안전성은 여전히 개선의 활성 영역으로 남아 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 생체 적합성 GNR의 종양 내 주사 후 단기간의 표적 NIR 레이저 노출을 사용하여 국소적이고 가벼운 온열을 달성하기 위한 검증되고 최적화된 방법을 제시합니다. 이 접근법은 치료 범위 내에서 빠르고 제어 가능한 가열을 가능하게 하여 면역원성 종양 세포 사멸을 촉진하고 선천성 면역 반응을 자극하며, 이는 특히 면역학적으로 "차가운" 종양과 관련된 메커니즘입니다. 실시간 온도 모니터링 및 현지 배송은 재현성, 안전성 및 최소한의 전신 노출을 보장합니다. 이 간소화된 프로토콜은 전임상 연구를 위한 강력하고 접근 가능한 플랫폼을 제공하여 암 면역 요법에서 온열요법을 활용하려는 광범위한 노력을 지원합니다.

서론

약물 내성, 면역 회피, 표적 외 독성 등 암 치료에는 중요한 과제가 남아 있으며, 이 모든 것이 기존 치료법의 장기적인 성공을 저해합니다. 이러한 한계로 인해 건강한 조직에 대한 부수적 손상을 최소화하면서 저항 메커니즘을 극복하도록 설계된 보완적인 치료 전략의 개발이 촉진되었습니다. 조직 온도를 42-48°C로 상승시키는 것으로 정의되는 경미한 온열요법은 오랫동안 표준 암 치료법의 효과적인 보조제로 인식되어 왔습니다¹. 역사적으로 경미한 온열요법은 종양 관류를 증가시키고, 간질 구조를 파괴하고, 악성 세포를 세포독성 물질에 민감하게 함으로써 이러한 요법의 효능을 향상시키기 위해 수술, 화학 요법 또는 방사선 요법과 함께 사용되었습니다¹. 보다 최근에는 종양학에서 면역 요법의 성공이 증가함에 따라 항종양 면역 반응을 개선하기 위해 경미한 온열요법의 고유한 면역 조절 잠재력을 활용하는 데 대한 관심이 높아지고 있습니다 ^1,2,3.

입증된 임상적 이점에도 불구하고 종양 온열요법의 광범위한 적용은 표적을 벗어난 조직 손상을 피하면서 종양의 국소적이고 제어 가능하며 재현 가능한 가열을 달성하는 데 어려움을 겪기 때문에 제한적으로 남아 있습니다⁴. 국소 사지 관류 또는 전신적으로 전달되는 나노입자 기반 접근법과 같은 현재의 임상 및 실험적 온열요법 기술은 종종 제한된 공간 정밀도, 다양한 종양 흡수 및 전신 독성 가능성으로 인해 어려움을 겪습니다 2,5,6,7,8,9 . 표적 온열 요법은 이 암 치료 분야에서 새로운 방식으로, 주변의 건강한 조직에 대한 손상을 최소화하면서 종양 온도를 선택적으로 높이도록 설계되었습니다. 보다 구체적으로, 금 나노로드(GNR)의 표적 전달은 경미한 종양 온열 정밀도 및 독성의 현재 한계를 극복할 수 있는 유망한 방법입니다. GNR은 NIR 영역에서 조정 가능한 표면 플라즈몬 공명, 높은 광열 변환 효율 및 다른 금 나노 구조에 비해 유리한 생체 분포 프로파일로 인해 광열 응용 분야에 특히 적합합니다^10,11. NIR 파장에 대한 반응성은 주변 구조에 대한 손상을 최소화하면서 더 깊은 조직에서도 효율적인 빛 흡수와 국부적인 가열을 가능하게 합니다. 따라서 GNR은 온열 요법에서 향상된 효능, 표적화 및 안전성을 제공할 수 있습니다.

이 방법의 목표는 고형 종양에서 온화한 금 나노로드 매개 온열요법을 달성하기 위한 매우 효율적이고 자원 집약적이며 재현 가능한 프로토콜을 제공하는 것입니다. GNR 매개 표적 온열 요법(THT)이라고 하는 이 기술은 직접 종양 내 GNR 주사와 외부 NIR 광 활성화를 결합하여 기존 온열 접근법의 주요 한계를 해결합니다. 이는 높은 국소 나노입자 농도를 보장하여 특히 전신적으로 전달되는 제제를 효율적으로 축적하지 못할 수 있는 작거나 혈관이 잘 형성되지 않은 종양의 경우 재현성과 안전성을 향상시킵니다. 또한 GNR을 직접 종양 내 주사한 후 근적외선(NIR) 광선에 노출하면 종양의 정확하고 제어되며 국부적인 가열이 보장되는 동시에 기존의 국소 온열 기술과 관련된 전신 노출, 독성 및 표적 이탈 효과를 최소화합니다.

많은 암은 면역 탈출의 복잡하고 다양한 메커니즘을 묘사하여 종양 미세 환경 내에서 불량한 면역 세포 침윤을 통해 다양한 수단을 통해 면역 요법에 저항할 수 있습니다 ^2,4,5. 가벼운 온열요법은 면역요법과 함께 사용할 때 시너지 효과를 발휘하는 솔루션을 제공합니다. 직접적인 세포독성 효과 외에도 경미한 온열요법은 면역원성 세포 사멸(ICD)을 우선적으로 유도하여 종양 관련 항원(TAA) 및 손상 관련 분자 패턴(DAMP^)의 방출을 유도합니다^1,2. 이러한 신호는 선천성 면역 경로를 활성화하고, 종양 항원 제시를 향상시키며, 수지상 세포 성숙을 촉진하고, T 세포 프라이밍을 강화하여 궁극적으로 종양 미세 환경으로의 면역 세포 침윤을 증가시킵니다 ^1,6,12. 우리 자신의 전임상 모델에서 이 GNR 매개 THT 기술은 국소 면역 반응을 활성화하고 종양 면역 침윤을 강화하는 기능을 했습니다¹³. 종양 내 인터루킨-2(IL-2) 요법 또는 전신 항-PD1 체크포인트 억제와 병용할 때 이 GNR 매개 THT 기술은 항종양 면역을 더욱 강화하고 유방암 및 흑색종 모델에서 단일 요법 단독보다 성능이 뛰어났습니다¹³. 이러한 결과는 유방암^14,15,16 및 뇌종양^17,18을 포함한 고형 종양에서 나노입자 매개 온열요법과 면역 요법 사이의 시너지 효과를 뒷받침하는 점점 더 많은 증거와 일치합니다. 요컨대, 면역학적으로 '차가운' 종양을 '뜨거운' 종양으로 전환함으로써 GNR 매개 THT는 체크포인트 억제제를 포함한 면역 요법에 대한 반응성을 향상시킬 수 있습니다 ^1,2,12.

여기에 제시된 GNR 매개 THT 프로토콜은 자원 집약적이고, 기술적으로 간단하며, 피하 또는 표재성 종양에 광범위하게 적응할 수 있습니다. 이 기술은 흑색종 및 유방암을 포함한 피하 또는 표재성 종양의 쥐 모델을 연구하는 연구자에게 특히 적합합니다. 그러나 약간의 수정으로 다른 종양 유형 및 해부학적 부위로 확장될 수 있습니다. 또한 이 기술은 공간적으로 제어된 온열요법을 전임상 암 연구, 특히 면역요법 강화 전략을 조사하고 면역요법 치료에 대한 치료 반응을 개선하거나 저항성을 극복하기 위해 가벼운 온열요법을 탐색하기 위한 다목적 플랫폼을 제공합니다. 또한, 이 기술을 구현하는 데 필요한 지식과 장비는 다양한 의료 환경에 접근 가능하고 적응할 수 있어 광범위한 임상 사용에서의 타당성을 향상시킵니다³.

이 원고에서는 860nm에서 작동하는 NIR 레이저 시스템을 사용하여 마우스 모델에서 GNR 매개 THT 프로토콜을 구현하기 위한 자세한 단계별 지침을 제공합니다. 이 프로토콜의 성공은 근적외선의 적절한 파장을 사용하는 금 나노로드의 효율적인 심부 조직 활성화에 달려 있습니다. 또한 시술 전반에 걸쳐 내부 종양 온도의 정확한 실시간 모니터링과 같이 쥐 종양 모델에서 일관되고 안전하며 효과적인 경미한 온열 투여를 달성하기 위한 절차적 고려 사항을 강조합니다. 이 방법은 이전에 보고된 나노입자 온열요법 접근법의 측면을 기반으로 구축되고 결합되어 전임상 암 연구를 위한 포괄적이고 검증되었으며 매우 정확하고 재현 가능한 대안을 제공합니다. 전반적으로 이 프로토콜은 종양 국소 온열요법을 전달하기 위한 생물학적으로 안전하고 비용 효율적이며 독성이 낮은 방법을 제공하며, 기존 암 면역 요법의 효능을 향상시키고 종양학에서 온열요법의 임상적 유용성을 확대할 수 있는 강력한 잠재력을 가지고 있습니다.

프로토콜

모든 실험 프로토콜은 캐나다 동물 관리 협의회 윤리 기준의 지침에 따라 Dalhousie University의 실험 동물 대학 위원회의 승인을 받았습니다. 동물의 관리 및 사용에 대해 적용 가능한 모든 국제적, 국가적, 제도적 지침을 따랐습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료에 대한 자세한 내용은 재료 표 를 참조하십시오.

1. 레이저 및 치료 시설 요구 사항

1. 최대 4,000mA의 강도로 860 ± 10 nm의 파장에서 빛을 전달할 수 있는 완전히 보정된 레이저 시스템에 안전하게 액세스할 수 있습니다. 레이저 시스템에 적절한 종료 메커니즘이 있는지 확인하십시오.
   참고: 이 연구에서는 맞춤 설계된 레이저를 활용했습니다. 이 프로토콜에 사용된 모델에는 레이저 활성화 키, 비상 정지 버튼 및 인터록 점퍼가 있습니다(연결된 점퍼는 안전 규정 준수에 사용되는 안전 스위치에도 배선될 수 있습니다. 예: 클래스 4 레이저실에 대한 도어 액세스).
2. 적절한 열전대 기록 소프트웨어를 통해 실시간 온도 데이터를 전송할 수 있는 종양 내 온도 모니터링을 위해 삽입 가능하고 보정된 온도 프로브를 부착합니다.
3. 레이저 등급에 필요한 안전 기준을 충족하는 지정된 레이저실을 준비합니다. 통풍이 잘되고 조명이 적절하며 모든 반사 표면이 덮여 있는 방해받지 않는 작업 공간이 있는지 확인하십시오. 의도하지 않은 노출을 방지하기 위해 레이저 작동 중 실내 접근을 제한하십시오. 연구에 참여하는 모든 직원이 레이저 작동 및 안전 프로토콜에 대해 완전히 교육을 받았는지 확인하고 적절한 PPE와 보안경을 착용하십시오.
4. 레이저 설정에 가까운 마취 기계를 수용할 수 있는 레이저 룸 내에 작업 공간을 설정합니다. 레이저가 단단히 장착되었지만 조정 가능한지 확인하고, 실험 대상이 레이저 빔 소스에서 약 1-2cm 떨어진 곳에 위치하여 종양 부위를 정확하게 표적으로 삼을 수 있도록 합니다.
5. 레이저 노출 내내 피사체 표면에서 온도 판독값을 캡처하도록 배치된 삼각대에 열화상 카메라를 사용합니다.

2. 세포 배양 및 접종(종양 세포 주입)

1. 표준화된 실험실 세포 배양 준비 및 유지 기술에 따라 관심 있는 종양 유형에 따라 적절한 마우스 모델을 선택합니다. 이 프로토콜을 따르기 위해 CT26 종양 접종을 위해 6-8주 된 암컷 BALB/c 마우스를 선택합니다.
   참고: 연구 요구 사항에 따라 다양한 연령 및 계통의 면역 적격 또는 면역 저하 마우스를 사용할 수 있습니다.
2. 10% 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS), 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 2 mM 글루타민이 보충된 RPMI 1640 배지에서 CT26 암세포주를 배양합니다. 5% CO_로 가습된 분위기에서 세포를 37°C로 유지합니다. 2-3일마다 배지를 재생하고 1:4 내지 1:10의 분할 비율을 사용하여 70-80% 컨플루언스에서 세포를 계대배양합니다. 초기 계대(예: ≤10개 계대) 내에서 세포를 사용하여 일관된 성장 및 접종 효율성을 보장합니다. 접종에 필요한 수의 세포를 얻기 위해 필요에 따라 배양을 확장합니다.
   참고: 마우스당 필요한 세포 수는 모델에 따라 다르며, 예를 들어 CT26 쥐 대장암 모델의 경우 마우스당 5 × 10⁵개의 세포가 필요했습니다.
3. 트립신화를 사용하여 부착 세포를 분리하고 멸균 1x PBS로 2회 세척합니다. 멸균 1x PBS 용액에 재현탁하여 원하는 농도인 5 × 10⁶ cells/mL에 도달합니다. 세포 현탁액을 얼음 위의 멸균 2mL 미세 원심분리기 튜브에 주입하기 전에 최대 1시간 동안 보관합니다.
4. 주입하기 전에, 4% 기화된 이소플루란이 있는 유도 챔버를 0.8 L/min의 유속으로 사용하여 마우스를 마취시킵니다. 마취가 완료되면 이소플루란을 2%로 줄이고 접종 절차 중 노즈콘으로 마취를 유지합니다. 통증 반응이 없는지 확인하기 위해 발가락 꼬집기 테스트를 사용하여 마취 깊이를 확인합니다. 건조를 방지하고 잠재적인 레이저 손상을 최소화하기 위해 양쪽 눈에 윤활제를 바르십시오.
5. 전기 면도기를 사용하여 주사 부위(예: 이 이소성 CT26 모델의 경우 왼쪽 옆구리)를 면도하고 알코올 물티슈로 해당 부위를 청소하여 잔해물을 제거하고 피부를 소독합니다. 주사 부위의 피부를 꼬집고 26G 바늘과 1mL 주사기를 사용하여 100μL의 세포 현탁액을 5 × 10⁶ cells/mL로 피하 주입합니다. 주사 후 노즈콘에서 마우스를 제거하고 케이지로 되돌려 따뜻한 담요 위에서 1시간 동안 회복합니다.

3. 종양 성장 및 측정

1. 종양 측정 캘리퍼스를 사용하여 일반적으로 주사 후 7일째부터 매일 종양 측정을 시작합니다. 너비, 길이 및 높이의 세 축으로 종양 치수를 측정하고 길이 × 너비 × 높이의 π/6 × 타원체 종양 부피 공식을 사용하여 종양 부피를 계산 합니다.
2. 종양이 대략적인 부피 50mm3(± 20mm3)에 도달하면 GNR 매개 THT를 시작할 계획입니다.
   참고: CT26 모델의 경우, 이 종양 부피는 종양 세포 주입 후 10일에서 12일 사이에 달성되었습니다.
3. 레이저 치료 전에 마우스를 대조군과 치료군으로 무작위로 할당하십시오. 치료군은 종양내 GNR 주사를 받은 후 레이저 노출을 받게 됩니다. 대조군은 GNR 대신 종양내 PBS 주사(GNR 주사와 동일한 부피)를 투여한 후 레이저 노출을 받게 됩니다.

4. 종양내 GNR을 이용한 NIR 광의 광열 변환

1. 멸균 생물학적 안전 캐비닛에서 31G 바늘이 있는 0.3-1mL 주사기를 사용하여 각 종양 부피에 따라 적절한 양의 GNR을 추출합니다.
2. 암세포 주사와 동일한 방식으로 마우스를 마취합니다(0.8L/min의 유속으로 2% 이소플루란을 전달하는 노즈콘을 사용하고 발가락 꼬집기 테스트를 사용하여 적절한 마취 깊이를 확인).
3. 마취가 완료되면 이소플루란을 2%로 줄이고 노즈콘을 사용하여 마취를 유지하면서 마우스를 레이저 플랫폼에 엎드린 자세로 놓습니다. 건조를 방지하고 잠재적인 레이저 손상을 최소화하기 위해 양쪽 눈에 윤활제를 바르십시오.
4. 필요한 경우 피부 표면이 레이저에 노출되도록 종양 주변의 과도한 털을 면도하십시오. 에탄올을 사용하여 종양 표면을 소독하고 털/부스러기를 닦아냅니다.
   참고: 이 연구에서는 860nm에서 흡수에 최적화된 GNR을 사용했습니다. 여기에 제안된 것과 다른 GNR 제품을 사용하는 경우 레이저 NIR 파장 전달이 GNR의 흡수 스펙트럼에 따라 최적화되었는지 확인하십시오.
5. 레이저 노출 전에 종양 부피 1μg/^mm3 의 농도로 종양 내 GNR을 주입합니다. 필요한 경우 종양 내부에 GNR을 효율적으로 분포하기 위해 두 개의 종양 내 부위 사이에 주사를 분할합니다.
   참고: 이 프로토콜 비디오에서는 2μg/μL 농도의 GNR이 사용되었습니다. 따라서 50mm³ 종양의 경우 25μL의 GNR을 종양에 주입했습니다. 각각의 주사 후 피부 표면의 과도한 GNR을 닦아내십시오.
6. 대조군 마우스의 경우, GNR 주입군(들)에 사용된 동등한 부피의 멸균 PBS를 종양내 주사합니다(예:^50mm3 종양의 경우 25μL의 PBS 주입).
7. 종양 내 온도 프로브를 에탄올로 소독하고 종양 덩어리 중앙에 부드럽게 삽입합니다.
8. 종양 표면에 약 5mm 두께의 알로에 베라 젤을 균일하게 도포하여 피부 궤양을 예방하고 치료 중 열 손상 위험을 최소화합니다.
9. 레이저가 종양 중앙 바로 위에 정렬되도록 조정되었는지 확인하십시오. 조도 조회표(표 1)를 사용하여 종양 표면적을 덮는 데 필요한 레이저 빔 직경을 기반으로 적절한 레이저 높이를 결정합니다. 종양 직경에 따라 레이저 높이를 최적화하여 일관된 에너지 전달을 보장합니다.
   참고: 본 실험에서 직경 1.3cm의 종양에는 1.5cm의 레이저 높이가 필요했습니다.
10. 레이저 및 열 전기 냉각(TEC) 소스를 켠 다음 레이저 시스템을 전원에 연결합니다(제조업체의 프로토콜에 따라 조정됨). 보온병 전기 냉각 소스를 켜십시오. 파란색 LED가 켜지고 레이저의 TEC 소스의 온도가 30초 후에 25°C에서 안정화될 때까지 기다립니다.
11. 조도 조회 테이블(표 1)을 사용하여 레이저 전류 출력을 조정하여 1W/cm² ± 0.2W/cm²의 목표 조도를 달성합니다(레이저 소스 노브를 원하는 전류 설정점으로 돌림).
    참고: 우리의 실험에서 레이저 높이 1.5cm, 빔 직경 1.3cm, 레이저 전류 1,800mA로 조사 조도 값이 0 .82 W/^cm2로 나왔으며, 이는 이 종양 모델에 최적화되었습니다.
    이 시점부터 레이저 수술실에 있는 모든 개인이 사용된 빛의 파장에 대해 인증된 레이저 보안경을 착용하도록 하십시오.
12. 레이저 시술 중 피부 표면 온도를 모니터링하기 위해 마우스를 향하는 레이저 플랫폼에 인접한 열화상 카메라를 설정합니다.
13. 열전대 기록 소프트웨어에서 새 파일을 만들고 녹음 버튼을 클릭합니다. 내부 종양 온도 대 시간 그래프가 실시간으로 표시되는지 확인하십시오.
14. 안전 키를 돌려 레이저 소스 출력을 활성화합니다. 풋 페달을 밟아 레이저 투여를 시작합니다.
    참고: 이 프로토콜에서 Raspberry Pi 컨트롤러는 풋 페달과 레이저 소스 사이의 내부 인터페이스입니다.
15. GNR 주입 종양이 레이저 빔에 노출되면 컴퓨터 소프트웨어가 종양 온도 상승을 감지하는지 확인하고 확인하십시오.
    참고: 내부 종양 온도는 레이저 시작 시간에 증가하기 시작하며, 종양 모델의 크기와 유형에 따라 목표 온열 범위인 42°C에 들어가는 데 약 15초에서 2분이 걸립니다.
16. 내부 종양 온도를 온열 범위(42°C에서 48°C 사이)에서 5분 동안 유지합니다. 내부 종양 온도를 지속적으로 모니터링하고 48°C에 가까워지면 페달에서 발을 떼고 온도가 다시 낮아지도록 합니다. 온도 대 시간 표시 그래프에서 실시간으로 이러한 온도 강하를 찾습니다. 내부 종양 온도가 ~43°C로 떨어지면 페달을 다시 밟아 레이저 투여를 다시 활성화합니다. 이 온/오프 레이저 페달 사이클링 패턴을 계속하여 내부 종양 온도를 전체 5분 동안 적절한 온열 범위로 유지하고 온도 대 시간 표시 그래프를 모니터링합니다.
    1. 5분의 온열 기간 중 어느 시점에서든 종양 온도가 42°C 이하로 떨어지면 손실된 시간을 보충하기 위해 온열 시간을 늘립니다. 예를 들어, 온도가 42초 동안 20°C 이하로 떨어지면 초기 5분 시간 끝에 20초를 추가합니다. GNR을 주입한 일부 종양은 48°C에 도달하지 못할 수 있으며 레이저 온/오프 사이클링이 필요하지 않습니다.
       참고: PBS를 종양 내 주사한 대조군 마우스에서 종양은 온열 범위에 도달하지 않습니다. 원하는 경우, 대조군 마우스에 대한 레이저의 온/오프 사이클링은 온열 반응이 부족할 것으로 예상됨에도 불구하고 GNR 치료 그룹에 대해 확립된 것과 동일한 패턴을 따라야 합니다.
17. 종양 온열요법을 유지하는 동안 피부 표면 온도를 지속적으로 모니터링하여 50°C 미만으로 유지되도록 하십시오. 종양 내부 온도에 관계없이 피부 표면 온도가 50°C에 도달하면 레이저를 꺼서 냉각합니다. 피부 온도가 50°C를 초과하지 않고 내부 온도가 원하는 온열 범위에 도달할 수 없는 경우 레이저 출력을 줄이거나 종양 부위에 알로에 베라를 추가로 도포하여 열을 발산하는 데 도움을 줍니다. 온열 범위에서 5분 후 풋 페달에서 발을 떼어 레이저 투여를 중지하고 내부 종양 온도를 ~37°C로 낮추고 레이저 안전 키를 끕니다.
    참고: 피부 온도를 50°C 미만으로 유지하여 종양 궤양으로 이어질 수 있는 피부 손상을 최소화하는 것이 중요합니다¹⁹.
18. 내부 종양 온도 프로브를 모니터링하여 종양 온도가 약 37°C까지 다시 떨어지도록 합니다. 종양에서 온도 프로브를 부드럽게 제거하고 종양 표면에 남아 있는 알로에 베라 젤을 닦아냅니다.
19. 코뿔 마취제에서 마우스를 제거하고 새장으로 되돌리기 전에 동물의 각성을 모니터링합니다. 시술 후 회복 기간 동안 케이지를 37°C 열 패드 위에 부분적으로 놓고 마우스가 체온을 조절하기 위해 필요에 따라 따뜻한 지역과 시원한 지역 사이를 이동할 수 있도록 합니다. 각 마우스를 모니터링하여 주거 시설로 돌아가기 전에 정상적인 동작으로 돌아왔는지 확인하십시오.

결과

이 GNR 매개 THT 프로토콜의 목표는 고형 종양을 42-48°C의 원하는 온화한 온열 범위로 일관되고 안정적으로 가열하는 것입니다. 이 절차의 주요 단계는 그림 1에 요약되어 있습니다. 이 프로토콜의 성공 여부는 주어진 고형 종양 모델 내에서 제어되고 재현 가능한 경미한 온열요법을 확립하고 유지하는 데 달려 있습니다. 사용된 GNR은 특허받은 CTAB 프리 방법을 사용하여 합성되었으며, 독점 계면활성제 용액에서 금염을 환원하여 막대 모양의 결정 성장을 촉진했습니다. 합성 후 천연 계면활성제는 생체 적합성을 향상시키기 위해 저분자량 PEG로 대체되었습니다. 생성된 GNR은 크기가 균일하고(51.1 ± 10.8nm x 12.2 ± 1.9nm), 최적 여기 파장이 860 ± 10nm였으며 검출 가능한 내독소가 없었습니다.

적절한 종양 가열과 정확한 온도 추적을 보장하려면 종양 내 온도 프로브를 종양 중앙에 삽입해야 합니다. 또한 열화상 카메라를 사용하여 시술 전반에 걸쳐 피부 표면 온도를 모니터링하는 것이 중요합니다. 특히 부피가 작은 종양의 경우 종양 내 주입된 GNR이 종양 주변의 종양 주위 및/또는 피하 공간으로 확산될 수 있습니다. NIR 광선에 노출되면 피부가 기본 생리적 수준 이상으로 가열될 수 있으며, 피부가 경미한 고열 수준(50°C 이상) 이상의 온도에 도달하면 딱지 및/또는 궤양과 같은 피부 손상을 유발할 수 있습니다¹⁹. 종양 표면에 알로에 베라 젤 층을 바르는 것은 피부 표면 온도를 조절하고 NIR 레이저 노출 중 열 손상을 방지하는 데 도움이 되는 중요한 예방 단계입니다. 어쨌든 THT 후 48시간 동안 궤양 징후가 있는지 치료 부위를 모니터링하는 것이 좋습니다. 그림 2 는 종양 온도 관리를 최적화하기 위해 제안된 설정의 시각적 표현을 나타내며, NIR 레이저 프로브와 관련하여 내부 종양 온도 프로브 및 알로에 베라 겔 층의 위치를 보여줍니다.

이 실험 프로토콜의 상대적 성공은 레이저 작동 전반에 걸쳐 내부 종양 온도 대 시간 그래프를 관찰하여 결정할 수 있습니다. GNR을 종양 내 주입한 마우스의 경우, 종양은 15초에서 2분 이내에 온화한 온열 범위(42-48°C)로 가열될 것으로 예상됩니다. 내부 종양 온도가 경미한 온열 범위에 들어가면 적절한 범위 내에서 정체되거나 내부 종양 온도가 48°C 이상으로 상승하지 않도록 레이저 투여의 온/오프 주기가 필요할 것으로 예상됩니다( 그림 3A 참조). 5분 동안 가벼운 온열요법을 성공적으로 유지하면 긍정적인 결과로 간주됩니다. PBS를 종양 내 주사한 마우스의 경우, 종양은 온열 범위로 가열되지 않을 것으로 예상됩니다. 860nm 파장의 NIR 광에 대한 노출만으로는 조직을 가벼운 온열 범위로 가열시키기에 충분하지 않으며, 대조군 종양은 약 39-40°C에서 정체될 것으로 예상됩니다. 그림 3B 는 5분 절차 동안 GNR과 대조군(PBS 주입) 마우스 사이의 내부 종양 온도 대 시간 그래프를 보여줍니다. GNR 주사 종양이 NIR 광에 노출되었을 때 온열 범위에 도달할 수 없거나 전체 5분 동안 적절한 온열 범위를 유지할 수 없는 경우 이는 음성 결과로 간주됩니다.

이 GNR 매개 THT 프로토콜의 성공을 결정하기 위한 추가 다운스트림 분석에는 절차 후 종양 부피의 변화를 측정하는 것이 포함됩니다. 성공적으로 수행된 GNR 매개 THT는 표적 종양 세포 사멸 및 항암 면역 반응의 활성화를 유발하여 종양 퇴행 및 관련 종양 부피 감소로 이어집니다¹³. 그림 4 는 2개의 피하 옆구리 쥐암 모델(B16-흑색종 및 CT26-이소성 대장암 모델) 및 1개의 유방 지방 패드 쥐암 모델(4T1-유방암)에 대한 GNR 매개 THT 후 종양 부피의 변화를 보여줍니다. 각 모델에서 대조군에 비해 종양 부피의 상당한 감소는 GNR 매개 THT 절차 후 48-72시간 후에 분명합니다. 시술 후 종양 부피 감소의 일정과 규모는 마우스 계통 및 암 모델에 따라 달라질 것으로 예상됩니다. 종양 감소 외에도, 우리는 STING-cGAS 경로에 관여하는 유전자의 발현 증가와 B16F10 및 4T1 모델 모두에서 수지상 세포, 대식세포 및 NK 세포의 상향 조절 및 활성화를 특징으로 하는 GNR 매개 THT 48시간 이내에 강력한 선천성 면역 반응을 관찰했습니다¹³. 특히, 양측 4T1 종양 모델에서 GNR 지원 THT는 치료되지 않은 반대쪽 종양으로의 CD8⁺ T 세포의 침윤 증가로 입증된 바와 같이 전신 면역 반응을 유도했습니다¹³. 이러한 발견은 직접적인 세포독성 및 광범위한 면역 조절 항암 효과를 모두 유도하기 위한 이 접근법의 잠재력을 더욱 뒷받침합니다.

표 1: 조도 조회 테이블. 다양한 레이저 전류 출력 설정(mA) 및 작동 거리(cm)에 대한 조도 값(W/cm²)을 제공하는 표입니다. 이 표는 종양 표면을 덮고 1W/^cm2 ± 0.2W/^cm2의 목표 조도를 달성하는 데 필요한 빔 직경을 기반으로 적절한 레이저 높이를 결정하는 데 사용됩니다. 녹색으로 강조 표시된 값은 1W/^cm2 근처의 최적 방사 조도 수준을 나타냅니다. 이 방사 조도 표는 LDX 레이저에만 해당되며 제조업체에서 제공했습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

그림 1: GNR 매개 THT 절차의 그래픽 개략도. 쥐 모델에서 피하 옆구리 종양에 대한 금-나노로드 매개 표적 온열 요법의 방법론. 만져질 수 있는 종양(약 50mm3)을 확립하고 마우스를 마취한 후, (1) GNR을 1μg/^mm3의 농도로 종양 내에 주입하고, (2) 종양 덩어리 중간에 종양 내 온도 프로브를 삽입하고, (3) 종양 표면에 ~5mm 층의 알로에 베라 겔을 도포하고, (4) NIR 레이저 투여를 시작하고, (5) 종양 내부 온도를 5분 동안 온화한 온열 범위(42°C-48°C)로 유지합니다. 약어: GNR = 금 나노로드; THT = 표적 온열 요법; NIR = 근적외선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 실험 설정의 시각적 표현. 중앙에 삽입된 종양 내 온도 프로브와 근적외선 레이저 빔에 대한 노출 바로 아래에 적용된 국소 알로에 베라 겔층이 있는 이소성 결장직장 종양을 가진 BALB/c 마우스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 실시간 내부 온도 그래프. NIR 레이저에 대한 종양 노출 전반에 걸쳐 내부 온도 프로브에 의해 기록된 시간 경과에 따른 대표적인 내부 종양 온도 프로필(ms). (A) 5분 동안 경미한 온열 범위(42°C-48°C)에서 내부 종양 온도를 유지하는 데 필요한 GNR 주사 마우스의 온/오프 NIR 레이저 사이클링 패턴. 이는 시술 전반에 걸쳐 저체온 범위를 유지하기 위해 내부 종양 온도를 면밀히 모니터링하고 레이저 투여를 주기하는 것이 중요하다는 점을 강조합니다. (B) 5분 NIR 레이저 노출 동안 GNR 주입(n = 15)과 대조군(PBS 주사) 마우스(n = 8) 사이의 내부 종양 온도의 평균 차이. PBS 주사 마우스의 종양은 종양이 42-48°C의 고열 온도에 도달하는 GNR 주사 그룹과 동일한 길이의 NIR 레이저 노출을 받았음에도 불구하고 경미한 저체온 범위로 가열되지 않고 약 39-40°C로 정체됩니다. 약어: GNR = 금 나노로드; NIR = 근적외선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: GNR 매개 THT 이후의 종양 부피 그래프. GNR 매개 THT는 치료 후 48-72시간 이내에 여러 쥐암 모델에서 종양 부피 감소를 유도합니다. (A) GNR 매개 THT(n= 24 PBS, n = 28 THT)에 따른 4T1(유방암) 모델의 종양 부피 측정. (B) GNR 매개 THT(n = 19 PBS, n = 23 THT)에 따른 B16-F10(흑색종) 모델의 종양 부피 측정. (C) GNR 매개 THT(n = 9 PBS, n = 9 THT)에 따른 CT26(대장암) 모델의 종양 부피 측정. 치료 후 48-72시간 이내에 종양 부피 성장의 감소 또는 둔화는 긍정적인 결과를 나타냅니다. '24시간 전' 시점에서 CT26 모델에 대한 종양 부피 데이터는 병합되지 않으며 값은 유사하고 겹칩니다. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. * p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

프로토콜 내의 중요한 단계
이 GNR 매개 THT 기술의 설계 및 구현은 생체 내에서 고형 종양의 표적화되고 정확하며 자원 집약적이지 않고 재현 가능한 가열을 수행할 수 있는 능력을 제공합니다. 이 시스템의 주요 장점은 공간적 정밀도와 열 제어에 있으며, 이를 통해 주변 조직을 손상시키지 않고 국소 치료가 가능합니다. 성공적인 광열 변환을 위한 중요한 단계 중 하나는 사용된 GNR과 NIR 광원 간의 호환성을 보장하는 것입니다. 본 연구에서는 860nm에서의 흡수에 최적화된 GNR을 사용하였다. 이 파장에서 빛은 조직을 효과적으로 투과하고 GNR 함유 종양에서는 열이 선택적으로 발생하는 반면 주변의 건강한 조직은 생리학적 온도 근처에 남아 있습니다²⁰. 또한, 이 프로토콜을 수행할 때 종양 내부 온도의 정확한 실시간 모니터링은 가벼운 온열 범위가 달성되고 치료가 일관되게 제공되고 있는지 확인하는 데 중요합니다. 그림 2와 같이 종양 내 온도 프로브를 배치하면 그림 3B에서 볼 수 있듯이 종양 열 선량을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다.

기술 문제 해결
생체 내 모델 및 종양 유형에 따라 결과를 최적화하기 위해 프로토콜을 약간 수정해야 할 수도 있습니다. 예를 들어, 그림 4에서 참조한 쥐 흑색종, 대장암 및 유방암 모델에서 GNR-대 종양 부피 농도를 1μg/^mm3로 최적화했습니다. 또한 이 주입 및 치료 시기를 0.5, 1, 4, 18 또는 24시간의 더 긴 간격으로 비교할 때 치료 효능의 차이가 관찰되지 않았기 때문에 GNR 주사 직후 NIR 레이저 노출을 수행하여 이 프로토콜의 효율성을 최적화했습니다. 종양 병태생리학 또는 신체 국소화 측면에서 당사 모델(들)과 다른 종양 모델의 경우, 다른 시점에 주입된 다른 GNR 농도가 온열 범위를 달성 및/또는 유지하는 데 최적일 수 있습니다. 이 절차에 따라 종양 부피의 변화를 기록하기 위해 매일 종양 부피 측정을 수행해야 합니다. 2-3일 이내의 종양 퇴행은 치료 성공의 긍정적인 지표입니다.

레이저 프로토콜의 특성으로 인해 표재성 피부 화상과 궤양은 특히 색소 침착되거나 민감한 피부에서 잠재적인 위험 요소입니다. 사용된 생체 내 모델에 따라 피부 표면과 내부 종양 온도 사이의 적절한 균형을 유지하기 위해 레이저 전류 출력에 대한 조정이 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 피부²¹, C57Bl/6 마우스의 수분 함량과 멜라닌 색소의 차이로 인해 피부 온도를 50°C 이하로 유지하기 위해 BALB/c 마우스에 비해 낮은 전류로 NIR 레이저 투여가 필요하다는 것을 발견했습니다. 레이저 전류 출력을 수정할 때 레이저 빔 직경으로 종양 표면의 대부분을 덮으면서 1W/cm² ± 0.2W/cm²의 목표 조도를 유지하도록 레이저 높이를 적절하게 조정해야 합니다. 또는 알로에 베라 젤을 추가로 바르면 내부 종양 온도에 큰 영향을 미치지 않고 시술 중 피부 온도를 낮추는 데 도움이 될 수 있습니다. 필요한 수정을 통해 적절한 피부 표면 온도를 유지하는 것은 이 치료의 잠재적인 부작용으로 관찰된 궤양의 위험을 최소화하는 데 중요합니다. 알로에 베라 겔 층을 수정할 때 NIR 레이저 빔의 투여를 일시적으로 중지하십시오. 레이저 프로토콜 후 며칠 동안 잠재적인 화상 및/또는 궤양에 대해 마우스를 면밀히 모니터링하고 있는지 확인하십시오.

GNR 매개 THT의 한계
이 절차를 수행할 때 해결해야 할 주요 안전 문제는 레이저 작동 중에 사용되는 빛의 파장에 대해 인증된 레이저 보안경을 사용하는 것입니다. 레이저 시스템에는 우발적인 활성화를 방지하기 위해 키 인터록과 같은 안전 기능이 내장되어 있어야 합니다. 그러나 반사 또는 산란된 빔으로 인한 잠재적 노출로부터 보호하기 위해 추가 개인 보호 장비(특히 적절한 레이저 보안경)가 필요합니다. 눈은 레이저 빔으로 인한 부상에 가장 취약하며, 망막 화상은 NIR 레이저의 주요 관심사입니다²². 마지막으로, 레이저를 작동하는 모든 직원은 적절한 교육을 받아야 합니다.

이 프로토콜은 시스템 독성을 최소화하고 간, 비장 및 신장과 같은 표적 외 장기의 나노입자 분포를 제한하며 온열 치료의 정확성, 효능 및 안전성 프로필을 향상시키기 위해 전신 주사보다 GNR의 종양내 주사를 선택했습니다. 그러나 이 프로토콜은 GNR의 종양내 주사를 필요로 하기 때문에 특정 종양 모델에서 온열을 유도하는 능력이 제한될 수 있습니다. 지금까지 우리는 피부 표면에 가깝게 상주하고 GNR 주입 및 NIR 광에 대한 노출 측면에서 쉽게 접근할 수 있는 피하 및 유방 지방 패드 종양에서 이 방법의 효과를 입증했습니다. 복막과 같은 체강 내부에 있는 종양을 표적으로 삼거나 원발성 종양의 전이 부위를 표적으로 삼으려고 할 때 물류상의 어려움이 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜에 대한 잠재적인 수정은 NIR 노출²³ 전에 종양 부위에 효율적인 축적을 보장하기 위해 나노입자가 설계되거나 변형되는 경우 전신 GNR 주입을 포함할 수 있습니다. 또한, 종양내 GNR 주사는 종양 내 나노입자 분포가 고르지 않아 가열 균일성에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나 이 GNR 매개 THT 프로토콜의 주요 결과가 항암 면역을 활성화하기 위한 ICD의 유도라는 점을 감안할 때 불균일한 종양 가열은 치료 효과의 정도에 큰 영향을 미치지 않을 것으로 예상됩니다. 마지막으로, 종양 내 온도 판독값은 종양 내 온도 프로브의 위치에 따라 달라집니다. 종양의 중앙은 프로브가 전체 평균 종양 온도를 정확하게 반영하는 가장 최적의 위치입니다. 그러나 종양 크기 및/또는 모양으로 인해 중앙 프로브 삽입을 확인 및/또는 확인하기 어려운 경우 서로 다른 위치에서 두 개 이상의 온도 프로브를 사용하여 기록해야 할 수도 있습니다.

기존 방법과 관련된 의의
이 원고는 고형 및 표면적으로 접근 가능한 종양에서 GNR 매개 THT에 대한 포괄적이고 최적화되며 재현 가능한 프로토콜을 제공합니다. 온열요법을 유도하는 다른 방법과 비교할 때 이 기술은 자원 집약도가 낮고 공간적으로 정확하며 전신 독성이 최소화된다는 뚜렷한 장점을 제공합니다. 광열 요법에 GNR을 사용하는 것은 잘 문서화되어 있지만 이러한 프로토콜이 구현되는 방식에는 문헌 전반에 걸쳐 상당한 차이가 남아 있습니다. NIR 조사 기간, 열 모니터링 도구(열전대 프로브 또는 열화상 카메라) 선택, GNR 용액 준비 및 GNR 주입 방법과 같은 주요 절차 요소는 종종 연구마다 다릅니다.

예를 들어, 다른 방법은 우리와 유사한 결과를 얻기 위해 더 길은(20분) ²⁴ 또는 다중 용량(4 x 15분)²⁵의 NIR 노출이 필요했습니다. 또한 대부분의 프로토콜은 열전대 프로브 또는 열화상 카메라를 사용하지만 두 도구를 결합하는 경우는 거의 없습니다^26,27. 또한, GNR 용액은 종종 CTAB^28,29,30으로 준비되며, 이들의 전달 방법은 전신 주사^(24,30)와 종양 내 주사⁽³¹) 사이에서 다양하며, 이는 TME 내의 분산/위치에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 현재 프로토콜을 최적화하고 개선하는 GNR 매개 THT에 대한 포괄적이고 적응 가능한 방법은 아직 확립되지 않았습니다.

우리의 프로토콜은 문헌에서 가장 효과적이고 재현 가능한 구성 요소를 표준화된 단일 접근 방식으로 통합하여 이러한 단점을 해결합니다. 특히, 우리는 정확하고 안전한 열 전달을 보장하기 위해 이중 열 모니터링(열전대 및 열화상 카메라 모두)을 사용합니다. 우리는 종양 국소화를 최대화하고 독성을 최소화하기 위해 CTAB가 없는 GNR의 종양 내 주사를 사용합니다. 그리고 우리는 표면적인 피부 화상으로부터 보호하기 위해 알로에 베라 젤을 사용합니다. 또한 이 프로토콜에 사용된 GNR은 860nm NIR에서 효율적인 광열 변환에 최적화되어 있어 몇 초 안에 온화한 온열 온도를 빠르게 달성할 수 있습니다. 이 온도 범위에 도달하면 5분의 치료 기간 동안 안정적으로 유지될 수 있으며, 이는 면역원성 세포 사멸 및 면역 활성화를 유도하기에 충분하다고 판단되었습니다. 860nm NIR 파장 자체는 조직 침투 깊이와 안전성 사이의 유리한 균형을 제공하여 이 방법의 치료 창을 더욱 향상시킵니다.

요약하면, 당사의 프로토콜은 기존 GNR 매개 온열요법 접근법에 대한 통합되고 검증되었으며 생물학적으로 효과적인 대안을 제공하며 전임상 암 연구 및 병용 요법 개발에 적합한 완전히 상세하고 적응 가능한 방법을 제공함으로써 해당 분야의 중요한 격차를 메웁니다.

기술의 향후 적용
마지막으로, 이 프로토콜은 다양한 암 치료와 쉽게 결합될 수 있지만, 항암 면역을 자극하는 THT의 고유한 능력을 고려할 때 면역 요법의 효과를 향상시키는 데 특히 적합합니다. 면역원성 세포 사멸을 유도하고, 종양 특이적 항원의 방출을 촉진하고, 치료 후 48시간 이내에 TME에 모집되는 선천성 면역 세포의 수를 증가시킴으로써, GNR 매개 THT는 면역학적으로 차가운 종양을 면역 체계에 의한 검출 및 공격에 '재감작'하는 데 도움이 됩니다¹³. 결과적으로, 이 기술은 이전에 내성이 발생했을 수 있는 암을 치료하는 면역 요법의 효과를 향상시키는 데 사용될 수 있으며, 암 치료 장벽과 질병 진행을 극복하기 위한 잠재적인 전략을 제공할 수 있습니다¹³.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.25% 트립신	써모 피셔 사이언티픽	25200-056
스트라이프 10mL	피셔 사이언티픽	7200574
15 mL 팔콘 튜브	코 닝	352095
1mL 주사기	BD 바이오사이언스	3331431
28 G 바늘	BD 바이오사이언스	1298811
4T1 유방암 세포주	아메리칸 타입 컬처 컬렉션	CRL-2539
스트라이프 5mL	피셔 사이언티픽	7200573
50mL 팔콘 튜브	피셔 사이언티픽	14-432-22
70% 에탄올	상업용 알코올	36195
알로에 베라 젤	라이프 브랜드	57800985495
B16-F10 흑색종 세포주	아메리칸 타입 컬처 컬렉션	CRL-6475
바이오렌더	바이오렌더	해당 사항 없음
Bisafety 캐비닛	누에르	해당 사항 없음
클래스 4 레이저 안전 고글	레이저비전	F22입니다. P5P18.5000	P22 필터와 함께 P5 프레임을 사용했습니다.
CO2 인큐베이터(37 ° C, 5% CO2)	누에르	해당 사항 없음
코닝 1-200 및 마이크로; L 유니버설 핏 랙 피펫  팁	코 닝	4865
코닝 필터링 피펫  팁, 30 및 마이크로; L	피셔 사이언티픽	07-200-265
CT26 쥐 대장 세포주	아메리칸 타입 컬처 컬렉션	CRL-2638
DPBS	써모 피셔 사이언티픽	10010-049
Eppendorf 튜브	써모 피셔 사이언티픽	3451
암컷 BALB/c 마우스	Charles River Laboratories (캐나다 몬트리올)	028
암 C57Bl/6	Charles River Laboratories (캐나다 몬트리올)	027
태아 소 세럼	Thermo Fisher 과학 인비트로젠	12483020
GNR	소나노테크 주식회사	해당 사항 없음
종양 내 온도 프로브	오메가	하이프1-30-1/2-TG-60-SMP-M	열전대 프로브 모델 HYP-1
아이소팁 1000 & 마이크로; L 범용 여과 피펫  팁	코 닝	4809
LDX 레이저 (모델 : LDX-3520-860-HHLFC)	미네트로닉스	해당 사항 없음	최대 설정점이 4600mA인 레이저 전류
Optixcare 아이 윤활유	아벤틱스	해당 사항 없음
페니실린-스트렙토마이신	써모 피셔 사이언티픽	15140148
프리즘 10.6.0	그래프패드	해당 사항 없음
RPMI 1640 중간	써모 피셔 사이언티픽	11875119
TC-08 열전대 데이터 로거 소프트웨어	피코 테크놀로지	피코로그 V5.25.3
열화상 카메라	하이마이크로	EA-1086922
조직 배양 접시 100 x 20 mm	피셔 사이언티픽	877222
트리판 블루 용액 0.4%	써모 피셔 사이언티픽	15250061
종양 측정 캘리퍼스	자일스 사이언티픽 미투토요 주식회사	500-321