연구 논문

사이토카인 처리된 치주인대 줄기세포에서 치주염과 관련된 후보 바이오마커의 생물정보학 규명

DOI:

10.3791/68863

⸱

2026년 3월 31일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Periodontology and Oral Mucosa, The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, 2Department of Preventive dentistry, Heilongjiang Provincial Stomatological Disease Prevention and Treatment Hospital, 3Department of Stomatology, The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University

이 논문에서

요약

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본 연구는 사이토카인 처리된 치주인대 줄기세포에서 생물정보학 분석을 통해 조절 이상이 있는 유전자를 탐구하는 것을 목표로 합니다. 상향 조절된 ERC2-IT1과 하향 조절된 EPB41L4A-AS1이 이 세포 내 핵심 분자로 확인되었으며, 이는 치주염과 잠재적으로 연관된 후보 바이오마커로 작용할 수 있습니다.

초록

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본 연구의 주요 목적은 사이토카인 유도 치주 인대 줄기세포(PDLSCs)의 분자 기전을 조사하는 것이었습니다. GSE260558 데이터셋의 마이크로어레이 데이터는 유전자 발현 옴니버스(GEO) 데이터베이스에서 가져왔습니다. 정규화 후에는 조절 이상이 있는 유전자가 확인되었습니다. 그 후, 다양한 발현된 mRNA(DE-mRNA)는 유전자 온톨로지(GO)와 교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG) 증축 분석을 받았습니다. 이후 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크를 기반으로 허브 유전자를 선별하였습니다. 마지막으로, ENCORI 웹사이트를 통해 허브 유전자를 포함하는 경쟁 내인성 RNA(ceRNA) 조절 네트워크가 확립되었습니다. 총 739개의 서로 다른 발현된 lncRNA(DE-lncRNA)와 809개의 서로 다른 발현된 mRNA(DE-mRNA)가 R 프로그래밍 언어의 limma 패키지를 사용하여 확인되었습니다. 이후 GO와 KEGG 분석을 통해 DE-mRNA가 사이토카인 처리 PDLSC에서 염증 및 세포외기질 형성과 밀접하게 연관되어 있음을 입증하였습니다. DE-mRNA에 대한 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크가 구축되었고, 그 정도를 평가하여 허브 유전자를 얻었습니다. 총 12개의 상향 조절 중심 유전자와 12개의 하향 조절 중심 유전자가 선별되었습니다. 이러한 상향 및 하향 조절된 허브 유전자들은 각각 ceRNA 조절 네트워크를 구축하는 데 사용되었습니다. 이 네트워크에서는 상향 조절된 ERC2-IT1과 하향 조절된 EPB41L4A-AS1이 치주염의 핵심 lncRNA로 간주되었습니다. 결론적으로, 생물정보학 분석 결과, 사이토카인 유도 PDLSC의 진행에 관여하는 여러 주요 유전자와 ceRNA 조절 네트워크가 밝혀졌습니다. 이 연구에서 치주염과 관련된 여러 후보 바이오마커가 확인되었지만, 동물 모델이나 임상 샘플에서의 추가 실험적 검증이 필요합니다.

서론

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세계보건기구(WHO)에 따르면, 치주염은 인간 중 여섯 번째로 흔하고 어디에나 있으며 되돌릴 수 없는 만성 염증성 질환으로 인정받고 있습니다 1,2. 현재 전 세계 인구의 거의 15%에 영향을 미치고 있습니다 1,2,3. 치주염은 연령, 성별, 구강 위생 습관, 흡연 여부, 민족, 낮은 사회경제적 지위, 그리고 다양한 전신 질환과 강한 상관관계를 보인 것으로 보고되었습니다 2,3,4,5. 치주염은 노인층에서 유병률이 높으며, 치아에 부착하는 치은하 미생물군의 불쾌한 변화에 의해 병리적으로 유발됩니다 6,7. 치료하지 않으면 이 상태는 결국 뼈 파괴, 치아 이동, 그리고 불행히도 치아를 잃는 것으로 이어집니다8. 따라서 치주염의 분자적 기전과 질병의 진단 지표 식별에 대한 포괄적인 이해가 시급히 필요합니다.

치주 조직의 구조적·상호작용적 복잡성은 치주 재생 과정에서 발생하는 상당한 어려움에 기여하는 중요한 요인 중 하나로 널리 인정받고 있습니다 9,10. 치주 재생을 목적으로 사용되는 다양한 간엽 줄기세포(MSC) 중에서 치주 인대 줄기세포(PDLSCs)는 생체 내에서 새로운 시멘텀 유사 구조 형성에 매우 신뢰할 수 있는 공급원임이 입증되었습니다11,12. 최근 수행된 전임상 연구들에서 PDLSC 기반 치료법은 조직 재생 분야에서 매우 유망한 결과를 보였습니다13,14. 환자 치은조직과 비교했을 때, PDLSCs의 전사체학 분석은 더 강한 기능적 지향성과 치료적 전환 잠재력을 보였다13,14.

생물정보학 기술과 생물정보학 분석 방법은 연구자들이 단백질체학, 유전체학, 대사체 통계와의 잠재적 생물학적 과정과 연관성을 식별할 수 있도록 힘을 실어줍니다.15,16. 또한, 생물정보학 기술의 고처리량 특성은 차세대 시퀀싱과 마이크로어레이 실험에서 생성된 대규모 생물학적 데이터 세트를 분석할 수 있게 합니다17,18. 이 능력은 질병 진단과 예후를 위한 잠재적 바이오마커를 식별할 수 있게 합니다19,20. 예를 들어, 디인테그린 및 금속단백효소 28(ADAM28)과 혈전척체 유형 I 모티프-유사 3(ADAMTSL3)를 가진 디인테그린 유사 및 메탈로프로테아제 도메인이 치주염 환자의 치은염 조직에서 생물정보학 기술을 기반으로 한 포괄적인 분석을 통해 새로운 바이오마커로 확인되었다21. 또한, 핵수용체 코활성화자 4(NCOA4), 용질 운반체 1A5(SLC1A5), 열충격 단백질 B1(HSPB1) 등 여러 철융증 관련 유전자가 치주염22에서 더 나은 진단 가치를 가진 것으로 보고되었습니다. 그러나 치주염의 분자적 기전은 더 깊이 탐구할 필요가 있습니다. 본 연구에서는 연구자들이 생물정보학 기술을 활용해 사이토카인 유도 PDLSC의 허브 유전자를 조사하고, 치주염과 관련된 잠재적 생물학적 과정과 경로를 규명하고자 노력합니다. 사이토카인 처리 PDLSC의 생물정보학 분석은 PDLSC 기능 장애와 관련된 염증 유발 전사 프로그램을 포착하여 PDLSC 기능 장애와 치주염 사이의 격차를 해소합니다. 이러한 사이토카인 유도 PDLSC의 핵심 유전자와 경로는 치주염의 통합된 기전을 이해하는 데 귀중한 통찰을 제공합니다.

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프로토콜

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1. 데이터셋

이 분석은 공개된 데이터를 사용했으며, 기관 및 JoVE 윤리 지침을 준수하여 인간이나 동물 대상자를 포함하지 않았습니다. 사용 플랫폼과 관련된 모든 정보는 재료표에서 확인할 수 있습니다.

  1. GSE260558 데이터셋(국립생명공학 정보 발현 옴니버스, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE260558)에서 총 6개의 샘플(GSM8119437, GSM8119438, GSM8119439, GSM8119440, GSM8119441, GSM8119442)을 생물정보학 분석을 위해 선택하세요.
  2. 이 샘플들에서 치주 인대 줄기세포(PDLSCs)를 정상 배지 또는 염증성 사이토카인이 함유된 배지에서 7일간 배양합니다.
  3. PDLSC에서 전체 RNA를 추출하여 고처리량 시퀀싱에 적용합니다23. 생물정보학 분석 과정은 그림 1에 나와 있습니다.

2. DEG의 식별

  1. 앞서 설명한 대로 limma 소프트웨어(버전: 3.46.0)를 사용하여 lncRNA와 mRNA의 발현 프로필을 분석합니다.
  2. 사이토카인과 정상 그룹 간의 쌍별 비교를 수행합니다.
  3. 표준 컷오프 < 0.05의 거짓 발견률(FDR) 보정을 사용하여 유의미하게 차이 있는 유전자를 식별합니다. 조정 p-값(FDR)을 사용하여 통계적으로 유의미한 결과 중 거짓 양성 비율을 조절합니다.
  4. 조정된 P값 컷오프 < 0.05와 접수 변화 임계치를 > 1로 사용하여 유의미하게 조절 장애가 있는 lncRNA 또는 mRNA를 식별합니다.
  5. R 소프트웨어(버전 4.0.4)를 사용해 생성된 화산 플롯(ggplot2: 버전 3.4.1)에서의 차등 유전자 발현을 제시합니다.
  6. 표에 상위 10가지 조절 이상이 있는 lncRNA와 mRNA를 나열하세요.

3. 기능 풍부도 분석

  1. DAVID 온라인 데이터베이스(주석, 시각화 및 통합 발견 데이터베이스, https://david.ncifcrf.gov/)를 사용하여 DE-mRNA의 GO 농축 분석을 수행합니다.
    1. 조절 이상이 된 유전자를 웹사이트에 제출하고, 분자 기능(MF), 생물학적 과정(BP), 세포 구성 요소(CC) 등 GO 용어를 선택하여 GO 분석을 수행하세요.
    2. 조절 장애가 있는 유전자를 Cytoscape(버전: 3.8.2) 플러그인 ClueGO [16]+ 및 Cluepedia 앱에 제출하세요.
    3. 다중 비교에 대해 벤자미니-호흐버그 보정을 적용하고, 유의치 임계치를 조정된 P값 0.05< 설정합니다.
    4. Cytoscape에서 결과를 다운로드하세요. P-값을 기준으로 농축 요소를 내림차순으로 순위 매기고, 각 범주별 상위 5가지 농축물을 제시합니다.
  2. 교토 유전자 및 유전체 백과사전(KEGG)은 생물학적 시스템의 고수준 기능과 영향을 이해하는 데 유용한 데이터베이스 자원입니다(http://www.genome.jp/kegg/).
    1. 웹사이트에서 KEGG-PATHWAY를 선택하여 KEGG 분석을 수행하세요.
    2. 유의성 임계값을 조정 P값 0.05< 설정하고, 본 연구에서 상위 10가지 농축을 제시합니다. 보고된 연구에 따라 이러한 농축 분석을 수행하세요 25,26.

4. PPI 네트워크

  1. 상호작용 유전자 검색 도구(STRING, 버전 12.0)를 사용하여 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크를 예측하고 구축할 수 있습니다.
  2. 318개의 상향 상향 mRNA 또는 465개의 하향 발효 mRNA를 STRING 웹사이트에 제출하여 PPI 네트워크를 구축하세요.
  3. PPI 네트워크에서 상호작용 데이터를 내보내 Cytoscape 소프트웨어에 제출합니다.
  4. 개별 노드를 PPI 네트워크 내에 숨기세요. 이 연구에 포함된 PPI 네트워크를 다운로드하세요.
  5. Cytoscape의 플러그인인 CentiScaPe 앱을 사용하여 네트워크 토폴로지컬 특성, 등급 분포를 계산하세요.
  6. 각 유전자의 인접 유전자 수를 합산하여 국소 위상을 정량화하고, 주어진 노드의 상호작용을 세는 것입니다.
  7. PPI 네트워크의 모든 유전자를 연결 정도에 따라 내림차순으로 순위를 매기세요.
  8. 이 순위 목록에서 상위 12개의 상향 및 상위 12개의 하향 유전자를 허브 유전자로 선택하세요.

5. miRNA-mRNA 조절 네트워크

참고: ENCORI 데이터베이스(버전 12.0, https://rnasysu.com/encori/)는 마이크로RNA(miRNA)와 DE-lncRNA(허브 유전자) 간의 조절 연관성을 예측하는 데 사용되었습니다.

  1. 상향 조절된 허브 유전자 또는 하향 조절된 허브 유전자를 ENCORI에 제출하고, 예측 분석을 위해 PITA, RNA22, miRmap, miRanda, PicTar, TargetScan을 포함한 총 6개 프로그램 중 컷오프 기준 프로그램 ≥5를 설정하세요.
  2. 예측된 miRNA를 다운로드하여 ENCORI에 제출하여 잠재적인 lncRNA를 얻으세요.
  3. 예측된 lncRA를 다운로드하고 5.2단계와 그림 2 사이에 겹치는 lncRNA를 식별합니다.
  4. 허브 유전자, 5.1절에서 얻은 miRNA, 5.3단계에서 얻은 lncRNA를 Cytoscape 소프트웨어(버전 3.4.0)에 제출하여 ceRNA 네트워크를 구축합니다.

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결과

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DEG의 식별
limma R 소프트웨어를 사용하여 lncRNA와 mRNA의 차별 발현 프로필을 분석하였습니다. 두 그룹 간의 차이는 비쌍 t-검정으로 결정되었습니다. 화산 도표(그림 2)에 나타난 것처럼, 총 739개의 서로 다른 발현된 lncRNA(DE-lncRNA, p 값<0.05, |log2FC|>1)가 확인되었습니다. 이 DE-lncRNA 중 정상군에 비해 사이토카인군에서 상향 상향 제한 lncRNA는 340개, 하향 조정된 399개는 확인되었습니다. 또한 총 809개의 서로 다른 발현 mRNA(DE-mRNA, p 값<0.05, |log2FC|>1)가 확인되었습니다. 이 DE-mRNA 중 정상군에 비해 사이토카인 그룹에서는 334개의 상향 mRNA와 475개의 하향 조절 mRNA가 확인되었습니다(그림 3A...

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토론

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치주인대 줄기세포(PDLSCs)는 치주염의 진행 및 회복 단계 모두에서 치주 손상을 억제하는 핵심 세포로 간주됩니다32,33. 상당한 증거가 염증성 상태에서의 잠복이 PDLSCs의 노화를 현저히 가속화할 수 있음을 명확히 입증했습니다34,35. 그러나 염증 잠복에 대한 세포 노화 현상과 그것이 세포 기능 장애에 기여한다는 점은 추가적인 심층 조사와 탐구가 필요하다는 점입니다. 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,

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공개 사항

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저자들은 이 연구에서 상반되는 이해관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

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하얼빈의과대학 제2부속병원, 헤이룽장성 자연과학기단(LH2023H037), 국가자연과학기단(82201070)의 지원에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
RR 통계 컴퓨팅 재단4.0.4통계 컴퓨팅을 위한 핵심 오픈 소스 환경. 모든 후속 분석의 기초 역할을 합니다. 일반적으로 RStudio와 함께 사용됩니다.
림마바이오컨덕터 커뮤니티 (수석 개발: 월터 & 엘리자 홀 연구소)3.46.0마이크로어레이 및 RNA-seq의 차별 발현 분석을 위한 특수 패키지;
사이토스케이프사이토스케이프 컨소시엄3.8.2네트워크 시각화를 위한 오픈소스 플랫폼입니다. 별도의 설치가 필요합니다; App Store를 통해 ClueGO와 cytoHubba 같은 플러그인을 지원합니다.
스트링유럽 분자생물학 연구소12예측 및 알려진 단백질-단백질 상호작용(PPI)을 위한 세계 최대 데이터베이스입니다. 웹 또는 Cytoscape 플러그인을 통해 접속; 신뢰도 점수를 제공합니다.
엔코리쑨원 대학교3ceRNA 네트워크(miRNA-mRNA-lncRNA)에 초점을 맞춘 공개 데이터베이스입니다.

재인쇄 및 허가

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태그

ceRNAGOKEGG

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