방법 논문

lncRNA, miRNA 및 mRNA 발현에 기반한 중대뇌동맥 폐색 쥐의 경쟁 내인성 RNA 네트워크 분석

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DOI:

10.3791/68876

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2025년 10월 7일

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1Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine, 2School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, 3School of Medical Economics Management, Anhui University of Chinese Medicine, 4Xin'an Medical Research Institute, 5Key Laboratory of Xin'An Medicine, Ministry of Education, 6Anhui Province Key Laboratory of Chinese Medicinal Formula

이 논문에서

요약

이 연구는 허혈성 뇌졸중에서 경쟁적 내인성 RNA(ceRNA)로 기능하는 긴 비암호화 RNA(lncRNA)의 조절 역할과 기본 메커니즘을 체계적으로 조사하기 위해 생물정보학 분석 및 실험적 검증을 사용했습니다.

초록

이 연구는 허혈성 뇌졸중에서 ceRNA로 작용하는 lncRNA의 조절 역할과 기본 메커니즘을 조사하는 것을 목표로 합니다. ceRNA 가설에 기초하여 lncRNA, miRNA 및 mRNA는 뇌졸중과 관련된 조절 네트워크의 구성 요소로 확인되었습니다. 결과 서브네트워크의 주요 lncRNA를 상세한 분석을 위해 선택했습니다. 유전자 온톨로지(Gene Ontology)를 사용한 기능적 농축 분석과 교토 유전자 및 게놈 백과사전(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)을 통한 경로 매핑은 lncRNA 관련 ceRNA 네트워크 내에서 중요한 상호 작용을 밝혔습니다. 칼슘 신호 전달, 갭 접합 신호 전달 및 신경활성 리간드 수용체 상호작용을 포함한 주요 경로는 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 추가로 검증되었습니다. 구축된 ceRNA 네트워크는 334개의 lncRNA, miRNA 및 mRNA로 구성되었으며, 기능적 농축 분석을 통해 생물학적 역할을 예측했습니다. 대표적인 ceRNA 서브네트워크를 구축하기 위해 중심성이 높은 3개의 lncRNA를 선택했습니다. 웨스턴 블롯 분석에서는 가짜 그룹에 비해 주요 단백질인 CaMKII, 칼모듈린, CX36, PKC, CX43, GRIA3, GABRA6 및 NPY1R의 발현 수준이 모델군에서 유의하게 하향 조절된 반면 CaN의 발현은 유의하게 상향 조절된 것으로 나타났습니다(P < 0.05). 이러한 발견은 lncRNA가 뇌졸중 병인에 크게 관여한다는 것을 시사합니다. 결론적으로, ceRNA로 작용하는 lncRNA는 허혈성 뇌졸중의 발병기전에서 중요한 조절 역할을 합니다.

서론

널리 퍼진 신경 장애인 허혈성 뇌졸중은 영구적인 뇌 손상, 장기 장애 또는 사망으로 이어집니다 1,2,3,4. MicroRNA(miRNA 또는 miR), 긴 비암호화 RNA(lncRNA) 및 메신저 RNA(mRNA)는 RNA 매개 조절 네트워크를 형성합니다 5,6,7,8. 이 분자는 다양한 복잡한 메커니즘을 통해 세포 기능을 조절합니다 9,10 허혈성 뇌졸중의 병태생리학에 기여하는 것으로 점점 더 인식되고 있습니다. 그러나 상태와의 연관성이 증가하고 있음에도 불구하고 이러한 비코딩 RNA의 정확한 역할은 불분명합니다. 새로운 비암호화 RNA에 대한 추가 조사는 허혈성 뇌졸중의 기초가 되는 분자 메커니즘을 명확히 하는 데 필수적입니다.

LncRNA는 다양한 병리학적 상태의 시작 및 진행 동안 유전자 발현의 주요 조절자 역할을 합니다. 경쟁 내인성 RNA(ceRNA) 역할을 하는 lncRNA는 miRNA에 결합하여 특정 조절 효과를 발휘합니다11. Weiet al. lncRNA AK038897가 miR-26a-5p를 표적으로 삼아 ceRNA로 작용하여 사망 관련 단백질 키나아제 1(DAPK1)을 조절하여 뇌 허혈-재관류 손상을 악화시킨다고 보고합니다12. 연구에 따르면 긴 비암호화 RNA SNHG1(lncRNA SNHG1)은 miR-18a와의 상호 작용을 통해 HIF-1α/VEGF 신호 전달 경로를 조절하여 뇌혈관 질환을 조절하는 ceRNA로 기능하는 것으로 나타났습니다13. 추가 연구는 긴 비암호화 RNA 모계 발현 유전자 3(lncRNA MEG3)이 miR-21/PDCD4 신호 전달 캐스케이드를 통해 신경 세포사멸을 조절한다는 것을 보여줍니다14. 고처리량 시퀀싱 또는 마이크로어레이 분석을 통해 수많은 lncRNA, miRNA 및 mRNA가 확인되었지만 뇌졸중에서 이러한 분자의 기능은 여전히 불분명하며 RNA 매개 조절 네트워크의 체계적인 구축이 시급합니다.

따라서 본 연구는 이전에 수집된 데이터를 이용하여 ceRNA 가설을 기반으로 포괄적인 lncRNA-miRNA-mRNA 네트워크를 구축하고, 유전자 온톨로지(GO) 및 교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG) 농축을 통해 선별된 ceRNA 하위 네트워크를 분석하여 lncRNA 기능을 더 잘 이해하는 것을 목표로 합니다. 결과는 여러 lncRNA가 ceRNA로 기능하여 잠재적으로 특정 miRNA와 그 표적 mRNA를 조절한다는 것을 밝힐 수 있습니다. GO 농축은 세포 발달, 신호 전달 및 세포 주기 조절과 같은 주요 생물학적 과정을 강조할 수 있는 반면, 경로 농축은 뇌졸중 관련 경로, 면역 반응 및 신진대사에 대한 관여를 밝힐 수 있습니다. 이러한 발견은 다양한 세포 과정과 질병 메커니즘에서 lncRNA의 잠재적인 역할을 강조할 수 있습니다.

허혈성 뇌졸중 연구에서 기존 ceRNA 네트워크 분석 방법에 비해 관련 연구와의 비교를 통해 뒷받침되는 몇 가지 주요 개선 사항이 제공됩니다. 첫째, 네트워크 구축과 기능적 경로 검증을 결합하여 다층 검증을 통합합니다. 공개 전사체 데이터를 사용하여 면역 관련 ceRNA 네트워크의 생물정보학적 프로파일링에 주로 초점을 맞춘 Li et al.15와 달리 334개의 lncRNA, miRNA 및 mRNA로 구성된 ceRNA 네트워크를 구축하고 웨스턴 블롯 분석을 통해 중요한 신호 전달 경로(칼슘 신호 전달, 갭 접합 신호 전달 및 신경활성 리간드-수용체 상호작용)를 검증하여 Fan et al.16에서 볼 수 있듯이 인실리코 예측에 대한 과도한 의존의 한계를 해결합니다., circRNA 관련 ceRNA 네트워크를 구성하지만 다운스트림 경로에 대한 실험적 검증이 부족하고 모델 및 가짜 그룹 모두에서 단백질 발현(예: CaMKII, CX36, GRIA3)을 정량화하여 예측된 네트워크의 기능적 관련성을 확인합니다. 위상학적 중요성이 높은 핵심 lncRNA에 집중하여 결과의 특이성을 향상시킵니다. 3개의 lncRNA, 2개의 miRNA 및 24개의 mRNA로 lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA 네트워크를 구성하지만 주요 조절자의 우선순위를 지정하지 않는 Cheng et al.17과 달리 높은 수준의 중심성을 가진 3개의 lncRNA를 식별하여 대표적인 하위 네트워크를 구축하여 기계론적 통찰력이 가장 영향력 있는 노드에 고정되도록 하고 Li et al.18에 설명된 것과 같이 더 광범위하고 덜 집중된 네트워크에 비해 해석 가능성을 향상시킵니다., 62개의 lncRNA를 포함하지만 표적 하위 네트워크 분석이 부족합니다. 재현성을 개선하기 위해 상세한 실험 매개변수 제공: 라이브러리 준비를 위해 뇌 조직에서 추출한 총 RNA 500ng-1μg(그룹당 쥐 6마리: MCAO 모델 20개 및 가짜 조작 대조군 20개)을 사용하고, 품질을 보장하기 위해 RNA 무결성 수(RIN)> 8.0, circRNA 바이오마커를 검증하지만 RNA 입력 사양을 생략하는 Wang et al.19에 명시되지 않은 세부 사항; 널리 사용되는 모델인 MCAO와 함께 수컷 SPF SD 쥐(220 ± 30g)를 사용하지만 Li et al.에서 강조한 바와 같이 인간 허혈성 뇌졸중의 혈관 복잡성 또는 면역 반응을 완전히 복제하지 못한다는 한계를 명시적으로 언급합니다. 연구 한계 인정: ceRNA 네트워크는 번역 후 변형을 포착하지 못할 수 있으며 웨스턴 블롯 검증을 위한 샘플 크기(그룹당 n = 6)를 확장할 수 있으며, 향후 작업은 이러한 격차를 해결하기 위해 더 큰 코호트 및 단백질체 분석을 포함하도록 할 수 있습니다.

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프로토콜

동물 실험은 안후이 중의과대학 실험윤리위원회(허가 번호: AHUCM-rats-2024006)의 승인을 받았으며 기관 지침과 JoVE의 동물 사용 기준에 따라 수행되었습니다. 이 연구에는 40마리의 수컷 SPF 등급 SD 쥐(220g ± 30g)가 사용되었습니다. 사용된 시약 및 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 실험 동물

  1. 표준 실험 조건에서 동물 실험 센터에 동물을 수용합니다. 12시간의 빛/암흑 주기를 유지하고, 매일 침구를 교체하고, 음식과 물을 무료로 이용할 수 있도록 하십시오.
  2. 실험이 끝날 때 복강내 주사 를 통해 150mg/kg 펜토바르비탈나트륨을 투여하여 깊은 마취 상태를 유도하여 동물을 안락사시킵니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름). 발 꼬집기에 대한 반사 반응이 없어 깊은 마취를 확인하고 호흡을 모니터링하여 활력 징후가 완전히 상실되었는지 확인한 다음 참수를 진행합니다.

2. 쥐의 중대뇌동맥폐색(MCAO) 모델 유도

  1. 40mg/kg20의 용량으로 1% 펜토바르비탈 나트륨을 복강내 주사하여 마취를 유도합니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름). 발가락 꼬집기와 각막 반사를 사용하여 마취 깊이를 평가합니다.
    1. 시술 내내 호흡수와 심박수를 지속적으로 모니터링하십시오. 눈 보호를 위해 마취 유도 직후 멸균 미네랄 오일 기반 눈 연고를 바르십시오21.
  2. 완전히 마취되면 목 정중선을 절개하고 오른쪽 총경동맥(CCA), 내경동맥(ICA), 외경동맥(ECA)을 조심스럽게 노출시킵니다. 직접 시각화 상태에서 적절한 미세 수술 기구(예: 겸자 및 가위)를 사용하여 주변 결합 조직을 부드럽게 분리하고 각 동맥을 완전히 노출시킵니다.
    1. 동맥을 노출시킨 후 수술용 봉합사를 사용하여 ECA와 CCA를 결찰합니다. 안전한 수술 매듭을 묶어 혈류를 막고 후속 시술 중 출혈을 최소화합니다. 봉합사 삽입을 위한 안정적인 필드를 만들기 위해 적절한 장력을 확인하십시오.
    2. 봉합사 삽입을 준비하기 위해 안과용 가위를 사용하여 ECA와 ICA의 분기점을 작은 절개합니다. 둥글게(공 모양) 끝 부분에서 직경 0.25mm, 길이 18mm인 나일론 봉합사를 선택합니다. ECA-ICA 접합부의 절개 부위를 통해 봉합사를 삽입하고 ICA를 따라 약 18.5mm± 0.5mm 깊이까지 부드럽게 전진시켜 중대뇌동맥을 폐색하고 국소 뇌허혈을 유도합니다.
    3. 삽입된 나일론 봉합사를 수술용 봉합사를 사용하여 주변 조직이나 혈관에 고정하여 변위를 방지합니다. MCAO를 2시간 동안 유지한 후 허혈/재관류 손상을 유도합니다. 미세한 수술용 겸자를 사용하여 나일론 봉합사를 부드럽게 잡고 약 5mm를 천천히 빼내어 뇌혈류를 부분적으로 회복시키고 재관류 손상을 유도합니다. 가짜 그룹에서는 실 색전증22를 삽입하지 않고 경동맥만 결찰합니다.
  3. MCAO 모델이 성공적으로 확립된 지 일주일 후 쥐를 깊게 마취시킵니다. 발을 꼬집는 데 반응이 없으면 재빨리 목을 베고 뇌를 채취하십시오. 뇌 조직을 생리 식염수로 헹구고 냉동 보존을 위해 -80°C 냉장고에 보관합니다23.
  4. 신경 기능 점수
    1. MCAO 모델의 성공 여부를 결정하기 위해 Longa 채점 방법을 사용하여 신경학적 기능을 평가합니다24. 재관류 후 24시간에, 각 쥐의 신경학적 기능을 평가하고 다음 기준에 따라 점수를 할당합니다: 점수 0: 관찰 가능한 신경학적 결손 없음; 점수 1: 꼬리 현지 중 왼쪽 앞다리의 굴곡, 앞다리가 완전히 확장되지 않음; 점수 2: 평평한 표면에 놓았을 때 영향을 받는(왼쪽) 쪽의 저항이 현저하게 감소한 테일 서스펜션 중 왼쪽 앞다리의 굴곡; 점수 3: 점수 2와 동일하지만 기어가는 동안 원을 그리거나 비자발적으로 회전하는 움직임이 추가되었습니다. 점수 4: 24시간 이내에 의식 불명 또는 사망.
      참고: 점수가 높을수록 더 심각한 행동 장애와 더 큰 신경 장애를 나타냅니다.
  5. 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC) 염색을 사용하여 뇌경색 부피 계산
    1. 각 생체 외 쥐 뇌를 관상면을 따라 동일한 두께의 5개 조각으로 절편합니다. 각 슬라이스의 두께가 정확히 2.0mm ± 0.1mm인지 확인합니다. 절편을 새로 준비된 2%(w/v) TTC 염색 용액에 완전히 담그십시오.
      1. 염색 용기를 알루미늄 호일로 감싸서 용액을 빛으로부터 보호하고 샘플을 37°C ± 0.5°C의 항온 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다. 염색 후 정상 뇌 조직에서 장미색 염색을 관찰하는 반면, 허혈성 경색 부위는 탈수소효소 활성의 손실로 인해 염색되지 않은 상태(흰색)로 남아 있습니다.
    2. TTC 염색된 뇌 절편을 4%(w/v) 파라포름알데히드 용액으로 옮기고 조직 형태를 보존하기 위해 4°C에서 24시간 동안 고정합니다. 고정 후 고해상도 이미징 시스템을 사용하여 슬라이스의 디지털 이미지를 캡처합니다. 고정 후 24시간 동안 데이터를 기록하고 보관합니다.
    3. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 TTC 염색 후 각 쥐 그룹의 경색 부피 및 총 뇌 조직 부피를 정량화합니다. 다음 공식25를 사용하여 수정된 경색 부피 백분율을 계산합니다.
      교정된 경색 부피(%) = {[총 병변 부피 − (좌반구 부피 − 우반구 부피)] / 우반구 부피} × 100%.
    4. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 대응되지 않은 t-테스트를 통해 보정된 경색 부피를 시각화하고 통계적으로 분석합니다. 통계적 유의성을 P < 0.05로 정의합니다.

3. RNA 고처리량 시퀀싱

  1. 각 그룹의 쥐 3마리 중에서 뇌 조직을 선택합니다. 제조업체의 지침에 따라 Ribo-Zero rRNA 제거 키트를 사용하여 전체 RNA 샘플에서 리보솜 RNA(rRNA)를 제거합니다.
    1. 표준 프로토콜에 따라 TruSeq RNA 라이브러리 준비 키트를 사용하여 상보적 DNA(cDNA) 라이브러리를 구축합니다. 클러스터 생성 및 시퀀싱을 위해 정제된 cDNA 라이브러리를 사용합니다.
  2. 새로 구축된 라이브러리에 의존하지 않고 이 연구를 위한 모든 시퀀싱 라이브러리 및 데이터 세트를 제공한 이전에 생성된핵심 데이터 26을 사용합니다. 새로운 RNA-seq 라이브러리나 시퀀싱 데이터를 생성하지 않고 이러한 기존 데이터 세트의 통합 융합 분석에 현재 작업을 집중합니다.
    1. 이전 연구에 대한 관련 기관 윤리 위원회의 승인을 확인합니다. 이전에 설명한 대로 표준화된 프로토콜을 준수하면서 MCAO가 있는 쥐에서 miRNA 발현 프로파일을 체계적으로 평가하기 위해 고처리량 시퀀싱을 수행합니다27.
      참고: RNA 시퀀싱 라이브러리에 대한 품질 관리 데이터는 보충 파일 1에 제공됩니다.

4. 긴 비코딩 RNA, 마이크로RNA 및 메신저 RNA의 차등 발현 분석

  1. 적절한 경우 Ensembl (https://www.ensembl.org/index.html), miRBase (https://www.mirbase.org/) 및 NONCODE (http://www.noncode.org/)로부터 단백질 코딩 유전자, miRNA 및 lncRNA에 대한 주석을 얻는다 28,29,30. StringTie31(https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/)을 사용하여 유전자 발현을 정량화합니다.
    1. StringTie 어셈블러를 사용하여 각 샘플에서 정렬된 판독값을 전사체로 어셈블합니다. StringTie 병합 모듈을 사용하여 모든 샘플의 전사체 어셈블리를 통합하여 코호트 전체에서 일관된 통합 전사체 세트를 생성합니다. 이 병합된 전사체를 사용하여 전사체 풍부도를 추정합니다32.
    2. TMM(Trimmed Mean of M-values) 정규화를 적용하고 각 전사체에 대해 FPKM(Chips Per Chipof Transcript per Kilobase) 을 계산하여 단백질 코딩 유전자 및 lncRNA의 정량화를 수행합니다.
  2. edgeR 패키지(https://bioconductor.org/)를 사용하여 차등 발현 분석을 수행하여 MCAO와 대조군 간에 차등적으로 발현된 lncRNA(DEL), miRNA(DEMis) 및 mRNA(DEM)를 식별합니다. 필터링된 원시 개수 행렬을 edgeR DGEList 객체로 변환합니다. 공통 분산을 추정하고 각 유전자 또는 miRNA에 동일한 분산 값을 할당합니다.
    1. 그룹 간의 유전자 발현을 비교하기 위해 정확한 테스트를 수행합니다. 차등적으로 발현된 각 유전자에 대한 log2 배 변화(log2FC), 백만당 로그 수(logCPM), P-값 및 거짓 발견률(FDR)로 조정된 P-값을 검색합니다35. 통계적 유의성을 P < 0.05로 정의하고 배수 변화 임계값은 |log2(FC)| > 1.

5. 차등적으로 발현된 microRNA의 긴 비암호화 RNA 및 메신저 RNA 표적 예측

  1. 적절한 데이터베이스에서 DEMis 및 DEL의 시퀀스를 검색합니다. miRNA-lncRNA 상호작용 예측 도구인 miRanda36 및 RNAhybrid37을 사용하여 DEMis와 DEL 간의 잠재적인 상호작용을 식별합니다. miRWalk 3.0 데이터베이스(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)38에서 miRNA-mRNA 상호작용 쌍 획득

6. 긴 비암호화 RNA - microRNA - 메신저 RNA 조절 네트워크의 구축

  1. ceRNA 가설39,40을 기반으로 lncRNA-miRNA-mRNA 조절 네트워크를 구축합니다.
    1. DEL과 DEM 간의 Pearson 상관 계수(PCC)를 계산합니다. PC>C가 0.99이고 P 가 0.01인 경우 추가 분석을 위해 lncRNA-mRNA 쌍< 선택합니다.
    2. 공동 발현된 각 lncRNA-mRNA 쌍에 대해 두 전사체를 모두 표적으로 하는 공유 miRNA를 식별합니다. 이러한 공유 miRNA를 사용하여 miRNA-mRNA-lncRNA 공동 발현 네트워크를 구축합니다.
    3. Cytoscape(https://cytoscape.org/)를 사용하여 lncRNA-miRNA-mRNA 상호 작용 네트워크(41,42)를 구성하고 시각화합니다. 다음과 같이하세요:
      1. CytoNCA 플러그인을 사용하여 각 노드의 간편 중심성(BC), 근접성 중심성(CC) 및 차수 중심성(DC)을 계산합니다.
      2. 중심성 점수가 세 가지 지표 모두의 중앙값을 초과하는 유전자를 선택하여 최종 키 하위 네트워크를 구성합니다.
      3. CytoHubba 플러그인을 사용하여 단백질-단백질 상호 작용 네트워크에서 상위 10개 허브 유전자를 식별하고 2단계에서 식별된 주요 노드를 추출합니다.
      4. ceRNA 네트워크의 각 구성 요소에 대한 노드 정도를 계산합니다.

7. 기능 강화 분석

  1. RNA 기능을 추가로 조사하기 위해 GO 및 KEGG 경로 농축 분석을 수행합니다43. clusterProfiler 패키지(https://bioconductor.org/)를 사용하여 보강 결과를 시각화합니다44.

8. lncRNA - ceRNA 관련 경로에 관여하는 주요 단백질의 발현 수준을 검출하기 위한 웨스턴 블롯 분석

  1. 깊은 마취 하에 뇌 전체를 빠르게 제거합니다. 수막과 혈관을 조심스럽게 제거한 후, 쥐의 경색 부위에서 피질 조직을 분리한다45. 가는 가위를 사용하여 조직을 작은 조각으로 자르고 각 조각의 무게가 50mg에서 100mg 사이인지 확인합니다. 계량된 조직 샘플을 예식된 균질화 튜브로 옮깁니다.
    1. PMSF 대 RIPA 용해 완충액의 부피 비율 1:100(최종 농도 1mM PMSF)으로 단백질 용해 완충액을 준비합니다. 용해 완충액을 조직 20mg당 200μL의 비율로 첨가합니다. 조직이 미세하게 분해될 때까지 열 멸균 유리 균질화기를 사용하여 샘플을 철저히 균질화합니다.
    2. 균질염을 얼음 위에서 30분 동안 배양하고 완전한 용해를 촉진하기 위해 10분마다 부드럽게 교반합니다. 샘플을 28,656.6 × g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 총 단백질을 함유한 상청액을 조심스럽게 흡인합니다.
  2. 5× 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 로딩 완충액을 단백질 샘플에 1:4(5× 완충액 1부피 대 단백질 샘플 4부피)의 비율로 첨가합니다. 희석 후 SDS-PAGE 로딩 완충액의 최종 작동 농도는 1×입니다.
    1. 완전히 섞고 끓는 수조에서 10분 동안 가열하여 단백질을 완전히 변성시킵니다. 샘플을 실온으로 식히십시오. 각 샘플 30μg을 SDS-PAGE 겔 웰에 로드합니다.
    2. 전기영동을 2단계로 수행합니다: 30분 동안 80V를 적용하여 스태킹 겔을 통해 단백질을 분리한 다음 1시간 동안 120V로 증가시켜 분해 겔에서 단백질을 분리합니다.
  3. 젤의 크기에 맞게 미리 절단된 여과지와 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인을 준비합니다. PVDF 멤브레인을 메탄올에 3분 동안 담가 활성화합니다. PVDF 멤브레인과 여과지를 모두 전사 완충액에 5분 동안 담급니다.
    1. 양극판, 여과지 3겹, PVDF 멤브레인, 젤, 여과지 3겹, 음극판 순서(위에서 아래로)로 전사 샌드위치를 조립합니다. 젤, 멤브레인 및 여과지 층이 올바르게 정렬되었는지 확인하십시오. 균일한 전달을 위해 각 단계에서 모든 기포를 제거하십시오.
  4. 단백질 전이 직후, PVDF 멤브레인을 웨스턴 세척 완충액에서 5분 동안 헹구어 잔류 전사 완충액을 제거합니다. 5% 탈지분유를 함유한 웨스턴 차단 완충액에서 부드럽게 흔들면서 실온에서 2시간 동안 멤브레인을 차단하거나 인산화 단백질을 검출하는 경우 5% BSA를 사용합니다.
  5. 차단 후, 멤브레인을 1차 항체(1:1000)와 함께 4°C에서 밤새 부드럽게 흔들면서 배양합니다. 다음날, 멤브레인을 2차 항체(1:10,000)와 함께 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
  6. 빛의 간섭을 방지하기 위해 어두운 방에서 화학발광 검출을 수행합니다. PVDF 멤브레인의 단백질 쪽을 자동 이미징 시스템의 노광판 중앙에 평평하게 놓습니다.
    1. 사용하기 직전에 깨끗한 원심분리기 튜브에 동일한 부피의 ECL 시약 A와 ECL 시약 B를 혼합하십시오. 혼합된 ECL 용액을 멤브레인 표면에 고르게 도포하여 발광 반응을 시작합니다.
    2. 실온에서 1-2분 동안 배양한 후, 멤브레인 표면을 방해하지 않고 과도한 액체를 부드럽게 제거합니다. 발광 강도에 따라 이미징 시스템의 노출 매개변수를 조정하여 신호 캡처를 최적화합니다.

9. 통계 분석

  1. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 웨스턴 블롯 결과를 분석하여 밴드 그레이 값을 정량화합니다. 실험 데이터의 통계 분석을 위해 GraphPad Prism을 사용합니다. 모든 데이터를 평균 ± 표준 편차(x ± SD)로 표현합니다. 대응되지 않은 t-검정을 사용하여 그룹 간의 통계적 차이를 평가합니다.
    1. 두 개의 독립적인 샘플 그룹의 데이터를 소프트웨어의 데이터 테이블에 입력하고, 각 그룹은 별도의 열에 해당하고 샘플은 서로 독립적입니다. "분석" 기능에서 "정규성 및 대칭 테스트"를 선택하고 Shapiro-Wilk 테스트를 두 그룹 모두에 적용하여 정규성을 확인합니다.
    2. 두 그룹 모두에 대해 P> 0.05인 경우 정규 분포된 데이터를 고려합니다. 이를 기반으로 분석 함수의 t-테스트에서 짝이 없는 t-테스트를 선택하여 분석을 수행합니다. 통계적 유의성을 P < 0.05로 정의합니다.

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결과

쥐 모델의 각 그룹의 성공률 검증 실험 결과는 그림 1에 나와 있습니다. 모델링 후, 쥐에 대해 신경학적 기능 점수를 수행했습니다(그림 1A). 모델군은 심각한 신경학적 결손을 보였고, 점수가 1에서 3 사이인 모델군은 후속 실험에 포함되었습니다. 그림 1B 와 C는 TTC 염색 결과를 보여주며, 빨간색은 정상적인 뇌 조직을 나타내고 흰색은 경색 부위를 나타냅니다. 모델군은 심한 뇌경색을 보였다. 이러한 발견은 허혈 모델의 성공적인 확립을 확인하고 후속 실험에 대한 사용을 검증합니다. edgeR을 사용한 차등 발현 분석에서는 MCAO 그룹에서 920개의 DEM과 710개의 DEL이 나타났습니다. 또한 16개의 miRNA가 비정상적인 발현 패턴을 나타냈습니다.

LncRNA는 miRNA에 경쟁적으로 결합하여 ceRNA로 작용...

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토론

뇌졸중 발병기의 기초가 되는 분자 기전을 조사하고 잠재적인 진단 및 치료 표적을 식별하기 위해 MCAO 후 쥐의 뇌 조직에 대해 RNA-Seq 및 small RNA-Seq(sRNA-Seq) 분석을 수행했습니다. 이 연구는 주로 lncRNA, miRNA 및 mRNA와 관련된 복잡한 조절 네트워크를 조사하는 것을 목표로 합니다. lncRNA-miRNA-mRNA 조절 네트워크를 밝히기 위해 MCAO 유도 쥐 뇌 조직에서 RNA-Seq 및 sRNA-Seq 데이터 세트에 대한 포괄적인 분석을 수행했습니다. lncRNA, miRNA 및 mRNA 간의 조절 관계를 설명하기 위해 광범위한 네트워크 상호 작용이 구성되어 뇌졸중 발병기의 기저가 되는 RNA 매개 메커니즘에 대한 이해를 발전시켰습니다. ceRNA 네트워크를 분석한 결과 "백혈구 세포 부착", "인테그린 매개 세포 접착 조절", "콜라겐 섬유 조직", "인테그린 매개 세포 접착", "허혈성 뇌졸중 후 신호 전달의 칼슘 의존...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 이해관계가 없다고 말합니다.

감사의 글

이 원고는 안후이성 학술 지도자 예비 후보 자금 지원 프로젝트(No.2022H287), 안후이성 보건 연구 중점 프로젝트(참조: AHWJ2022a013), 안후이성 대학 자연과학 연구 중점 프로젝트(NO.2023AH050745) 및 안후이성 위생 및 보건 우수 인재 프로젝트(NO. ahsjhmypygc20230074)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2% (w/v) TTC 염색 용액베이징 Kangle Clone Biotechnology Co., Ltd. 20230805TTC 염색
4%(w/v) 파라포름알데히드 용액비요타임P0099고정된 뇌 조직
수컷 SPF 등급 SD 쥐 40마리Hagzhou Ziyuan 실험실 동물 사육 유한 회사SCXK [제] 2024-0004실험 동물
탈지분유 5%과학 피진PH1519WB
아가로스 전기영동 시스템베이징 Liuyi Biotechnology Co., Ltd.다이프-44PWB
자동 노광기상하이 Peiqing 기술 Co., Ltd.JS-M6PWB
자동 노출계상하이 Peiqing Technology Co., LTDJS-M6PWB
자동 제빙기창수시 Xueke 전기 제품 Co., LTDIMS-20WB
칼모듈린선호도49B2443WB
캠키이선호도14G0796WB
원심 분리기Haimen Qilinbeier 악기 제조 Co., Ltd.LX 300WB
clusterProfiler 패키지생체전도체clusterProfiler_4.17농축 분석
CX36젠바이오N24AP24WB
CX43젠바이오M08NO01WB
ECL 초고감도 화학발광 키트바이오샤프BL520BWB
전기 온도 조절 공기 건조 오븐상하이 Sanfa 과학 기기 유한 회사DHG-9070WB
전기영동 장치Shanghai Tianeng Technology Co., LTD. (타논)주당순이익300WB
전기영동장치상하이 타논 사이언스 & 테크놀로지 주식회사주당순이익300WB
전기 영동 탱크상하이 타논 사이언스 & 테크놀로지 주식회사VE-180 시리즈WB
가브라6선호도46V5371WB
염소 항마우스 IgGZs-바이오142637WB
염소 안티 토끼 IgGZs-바이오139931WB
그리아3선호도0C33051WB
고속 냉동 원심분리기안후이 Jiawen 계측 장비 Co., LTDJW-3021HR 시리즈WB
HiSeq 2500 시스템일루미나/RNA 고처리량 시퀀싱
ImageJ 소프트웨어국립 보건원이미지J 1.54kTTC 염색
마그네틱 가열 교반기창저우 시 및 악기 공장제이제이-79-1WB
마이크로피펫독일 Eppendorf/WB
상온 마이크로 원심분리기Haimen Qi Limber Instrument Manufacturing Co., LTD. LX300LX300WB
NPY1R선호도2D38248WB
피펫에펜도르프0.5-10ulWB
PKC선호도17E3745WB
사전 염색된 단백질 마커바이오샤프BL712CWB
PVDF 멤브레인밀리포어IPVH00010WB
Ribo-Zero rRNA 제거 키트Illumina, 샌디에이고, 캘리포니아, 미국/RNA 추출
RIPA 용해물바이오샤프BL504AWB
펜토바르비탈나트륨베이징 씽크-파 테크놀로지 유한 회사머 크마 취
이송 멤브레인 기기상하이 타논 사이언스 & 테크놀로지 주식회사VE-186WB
막관통 장치Shanghai Tianeng Technology Co., LTD. (타논)VE-186WB
&베타;-액틴Zs-바이오19AW0505WB

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