마우스에서 1차 섬과 1차 췌장 아시나세포를 동시에 분리하는 간단하고 신속한 방법

Summary

이 연구는 마우스 췌장에서 기능성 원차 섬과 선반세포를 효율적으로 추출하는 단순화된 방법을 개발하여, 급성 췌장염 유발 당뇨병의 발병 기전에서 세포 간 소통을 연구하는 귀중한 도구를 제공하였습니다.

Abstract

급성 췌장염 당뇨병(PPDM-A)의 발병 기전 연구에서는 췌장 선방세포(PAC)와 섬세포 간의 비정상적인 양방향 통신이 주요 초점입니다. 그러나 불멸화된 세포주는 병태생리학적 조건을 재현할 수 없으므로, 고품질 1차 세포 추출이 매우 중요합니다. 현재 쥐에서 원발 섬을 추출하는 방법은 주로 담관 관을 통한 체 내 췌장 관류에 의존하는데, 이는 기술적 장벽이 높고 경험이 없는 연구자가 수술하기에 적합하지 않습니다.

이 연구는 복잡한 체 내 관류가 필요 없도록 방법을 수정했습니다. SPF 등급 C57BL/6J 마우스(6-8주)는 마취 및 안락사를 시행한 후 췌장 격리를 시행하였습니다. 췌장은 콜라겐제 P와 함께 시험관 내에서 소화되었으며; 주요 섬들은 Ficoll 밀도 구배 원심분리를 통해 분리되었고, 아시나 세포는 세포 체와 원심분리를 통해 얻었습니다. 세포 생존성과 기능은 칼세인/프로피듐 요오화물(칼세인/PI) 염색, 포도당 자극 인슐린 분비 분석법, 아밀라아제 활성 검출을 통해 평가하였다.

결과는 수정된 방법이 조작이 용이하다는 것을 보여주었다: 마우스당 수확량은 (120 ± 5) 1차 섬과 1.6-1.95 × 10⁷ 아시나르 세포였다; 섬과 선구의 생존율은 각각 (97.52 ± 0.16%)와 (96.55 ± 0.95)%였습니다. 더불어, 섬들은 정상적인 인슐린 분비 능력을 보였고, 아시나르 세포는 세룰린 자극에 민감했다. 이 방법은 간단하고 신뢰할 수 있으며, 췌장 외분비-내분비 상호작용과 PPDM-A 연구를 위한 실현 가능한 틀을 제공합니다. 하지만 쥐에서 검증되지 않은 적용 등 한계가 있습니다.

Introduction

급성 췌장염(AP)은 췌장 실질 손상과 염증성 연쇄 반응 등 여러 경로를 통해 췌장 내분비 기능을 교란시켜 급성 췌장염 후 당뇨병(PPDM-A)을 유발할 수 있습니다^1,2. 현재 PPDM-A의 핵심 병인기는 명확하지 않으며, 췌장 내분비와 외분비 구획 간의 비정상적인 양방향 통신이 주요 연구 초점입니다^. 기존의 불멸화된 β세포주(예: INS-1, MIN6)는 시험관 내 당뇨병 세포 모델에 흔히 사용되지만, 종양 유래 특성 때문에 정상 원발 섬세포와 혈당 반응성과 세포 이질성 면에서 유의미한 차이가 나타납니다. 그 결과, 급성 췌장염 ^4,5의 미세환경 하에서의 병태생리학적 상태를 진정으로 재현할 수 없습니다. 따라서 고품질 1차 섬과 아시나르 세포를 얻는 것이 이들의 상호작용 메커니즘을 규명하는 핵심 기술적 기반이 되었습니다.

현재 쥐에서 1차 섬을 분리하는 방법은 주로 담관을 정밀하게 위치시키고 관을 삽입하여 콜라겐아제 용액을 췌장 실질에 주입하여 생체 내 관류 ^6,7을 하는 데 의존합니다. 그러나 신생아 쥐의 1차 섬을 분리하는 데 있어, Huang 등은 체내 췌장 관류 없이 시험관 내 소화를 통해 우수한 ^{결과를 달성했습니다}. 저희 연구팀의 실무 경험에 따르면, 담관 관을 통한 최적의 췌장 관류를 수행하는 것은 전문 교육 없이는 빠르고 효과적으로 달성하기 어렵습니다. 신생아 쥐에서 1차 섬을 분리하는 방법에서 영감을 받아, 우리 팀은 관류 경험이 없는 연구자들도 더 간단하고 접근하기 쉽게 추출 프로토콜을 수정했습니다. 이 수정된 방법은 또한 젊은 쥐나 섬관이 섬을 분리하는 데 더 간단한 대안을 제공합니다. 더 나아가, 이 방법은 섬과 아시나르 셀의 분리 효율(양)과 순도(품질) 모두에서 장점을 제공합니다. 이 시스템은 연구자들이 동일한 병리학적·생리학적 맥락 내에서 실험을 수행할 수 있게 하여, 섬과 액시나 세포 간의 상호작용 메커니즘을 심층적으로 분석할 수 있게 합니다.

이 방법은 췌장 소화 시간을 엄격히 조절해야 하며; 소화 전에 췌장을 다지는 것도 매우 중요한 단계입니다. 또한, 소화 후 췌장 조직의 기계적 분산 강도에도 주의를 기울여야 합니다. 이 모든 요인들은 분리된 섬과 아시나르 세포의 양과 질에 영향을 미칩니다. 이 방법은 쥐에서 검증되지 않았으며 현재로서는 생산을 위한 대규모 생산이 불가능합니다.

Protocol

동물 관련 절차는 상하이병원 윤리위원회 또는 실험동물센터 윤리위원회(승인 번호: CHEC (A.E)-2025-026)의 승인을 받았습니다. SPF 등급 C57BL/6J 마우스(6-8주, 체중 18-25g, 수컷 또는 암컷, n = 3)는 12시간 동안 밝고 어두운 주기로 유지되었으며, 음식(유지 식이)과 물을 자유롭게 섭취할 수 있었습니다.

주사기와 바늘과 같은 폐기물 샤프는 실험실의 전용 샤프 용기에 수거되어 자격을 갖춘 전문 기관에 의해 폐기됩니다. 연구에서 비인간 동물 관리 및 사용에 관한 윤리적 행동 지침에 따라, 쥐 사체는 실험실의 전용 쥐 사체 냉동고에 보관되어 전문 기관에 의해 소각되어야 합니다.

1. 시약 준비

참고: 멸균 밀도 구배 매체와 같은 용액은 실험실의 '화학 폐기물 수집 드럼'에 수집되어야 합니다. 모든 화학 폐기물은 실험실에서 정한 자격을 갖춘 전문 기관에 의해 처리되어야 합니다.

1. 콜라겐제 P 용액의 제제
   1. 50mL 원심분리관에 순차적으로 25mg의 콜라겐제 P, 42mg의 무수칼슘클로라이드, 0.02g의 트립신 억제제를 무게로 넣습니다. 행크스 밸런스 소금 용액 45.5mL와 HEPES 용액 500 μL를 추가한 후 완전히 녹을 때까지 소용돌이를 돌립니다. 0.22 μm 필터를 통해 여과하여 용액을 멸균한 후, 여과된 용액을 새로운 멸균 50 mL 원심분리관으로 옮깁니다. 이로 인해 0.5 mg/mL 콜라겐제 P 용액이 생성되며, 이는 이후 췌장 조직 소화에 사용됩니다.
2. 멸균 밀도 구배 용액의 처리
   1. 멸균 밀도 구배 용액을 0.22 μm 필터로 여과하여 멸균한 후, 새로운 멸균 50 mL 원심분리관으로 옮깁니다. 용액 정보를 명확히 라벨링하고 나중에 사용할 수 있도록 4°C에 보관하세요. 이후로는 "피콜"이라고 불립니다.
3. 정지 버퍼 및 완전 배지 준비
   1. 각각 빈 DMEM 배지와 RPMI-1640 배지에 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액을 첨가하여 DMEM 완전 배지와 RPMI-1640 완전 배지(췌장 소화 완충제도 포함)를 준비합니다. 용액 정보를 명확히 표시하고 나중에 사용할 수 있도록 4°C에서 보관하세요.
4. 서로 다른 농도의 포도당 용액 제조
   1. 50 mL 원심분리관에 50 mL의 크렙스-링거 중탄산염 HEPES 완충제(KRBH)와 0.25 g 소 혈청 알부민(BSA)-V 혼합물을 추가하여 0.5% BSA를 포함한 KRBH 용액을 만듭니다. 그 다음 0.5% BSA 함유 KRBH 용액 28.33 mL에 포도당 168 μL(1 M)와 염화칼슘 용액 1.5 mL(50 mM)를 첨가하여 5.6 mM 포도당 용액을 만듭니다. 0.5% BSA 함유 KRBH 용액 9.28mL에 포도당 220 μL 1 M과 염화칼슘 500 μL 용액(50 mM)을 첨가하여 22 mM 포도당 용액을 만듭니다.

2. 췌장 섬 및 췌장 액시나(PAC) 분리

참고: 모든 수술 기구는 오토클레이브 멸균을 거쳐야 합니다.

1. 12웰 플레이트에 행크의 밸런스 소트 용액과 콜라겐제 P 용액을 추가하세요. 그리고 50mL 원심분리관에 콜라겐제 P 용액 3mL를 추가하여 이후 소화합니다.
   참고: 행크스 밸런스 소금 용액 2mL를 세 개의 웰에, 콜라겐제 P 용액 2mL를 한 웰에 추가하세요.
2. 수술 전 0.025 mL/g 용량의 복경내 주사 1.25% 트리브로모에탄올로 마취 및 마취 상태, 발바닥을 집어 마취 상태를 확인하세요: 마취 깊이는 호흡 수가 점차 감소하고 발바닥 집힘에 반응이 없음으로 결정됩니다. 심마취가 확인되면 경추 탈구로 쥐를 안락사시킨다. 쥐를 75% 에탄올에 5분간 담가 소독한 후, 췌장 격리를 위해 생체 안전 캐비닛으로 옮깁니다.
   참고: 트리브로모에탄올(1.25%)은 구매 시 사전 준비된 용액으로 제공됩니다; 수작업 준비는 필요하지 않습니다. 연구자들은 실험 내내 장갑과 마스크를 착용해야 합니다. 1.25% 트리브로모에탄올 주사 중 피부 접촉이 발생하면 즉시 무수 에탄올로 잔류 시약을 닦아내고, 흐르는 물로 5분간 헹군 후 건조함을 완화하기 위해 보습제를 바르세요. 이 연구에는 부식성 화학물질이 포함되어 있지 않습니다. 1.25% 트리브로모에탄올과 같은 폐기화학물질 시약은 "유해 화학폐기물"이라고 표시된 전용 밀폐 용기에 수집되어야 합니다.
3. 복부에 'V'자 모양의 절개를 하여 쥐의 복강을 열어주세요. 왼쪽 건강염려증 부위에 있는 짙은 붉은색 림프구 기관은 비장이고, 비장에 부착된 흰색 기관은 췌장입니다. 위 아래쪽과 췌십이지장 접합부를 따라 췌장을 둔하게 해리합니다.
4. 분리된 췌장 조직을 행크의 밸런스 소금 용액으로 세척하고 잔여된 장간막 부착물, 비장, 췌장 주변 지방 조직을 제거합니다.
5. 가공 전 췌장을 2mL 콜라겐제 P 용액이 담긴 12웰 플레이트로 옮깁니다. 왼손으로 핀셋으로 췌장을 고정하고, 오른손으로 1mL 주사기를 사용해 췌장 실질에 콜라겐제 P 용액을 주입하여 췌장 조직이 투명하고 부종이 생길 때까지 유지하세요.
   참고: 관류를 위한 콜라겐제 P 용액의 부피는 600-800 μL입니다.
6. 췌장을 외과용 가위로 빠르게 1-2 mm³ 크기의 조직 조각으로 잘라내세요.
   참고: 조직 조각의 크기는 표준 200 μL 피펫 팁의 내경과 거의 같습니다.
7. 1 mL 피펫 팁의 원위 1-1.5cm 부분을 잘라내어 입구를 확장하고, 이 수정된 팁을 사용해 2 mL의 콜라겐제 P 용액과 함께 50 mL 원심분리관에 3 mL 콜라겐제 P 용액이 미리 적재된 상태로 옮깁니다.
8. 원심분리관을 37°C 수조에 12분간 보관하고, 이 기간 동안 5-6분마다 부드럽게 흔들어 주세요.
   참고: 원심분리관을 흔드는 목적은 췌장 조직과 콜라겐제 P 용액 간의 완전한 접촉을 보장하기 위함입니다.
9. 콜라겐제 P 용액의 소화 효과를 종료하기 위해 RPMI-1640 완전 배지 10mL를 추가하세요.
10. 5mL 파스퇴르 피펫으로 펠릿을 반복적으로 피펫(15-20회 위아래로 스트로크)하여 뚜렷한 큰 조직 덩어리가 남지 않을 때까지 사용하세요.
11. RPMI-1640 완전 배지 10mL를 추가한 후 180 × g 에서 4°C에서 2분간 원심분리한 후 상원액을 버립니다.
12. 펠릿을 20mL의 RPMI-1640 완전 배지와 함께 재현탁합니다. 현탁액을 40 메쉬 체로 걸러낸 후 180 × g 에서 4 °C에서 2분간 원심분리기를 사용하세요.
13. 상청액을 부드럽게 버리고, 펠릿을 재현탁하기 위해 20 mL의 Ficoll 용액을 추가한 후, 천천히 15 mL의 RPMI-1640 완전 배지를 추가합니다.
    참고: 이 시점에서는 투명한 액체 인터페이스를 관찰할 수 있습니다.
14. 640 × g 에서 25°C에서 20분간 부드럽게 원심분리합니다.
    참고: 원심분리 중 격한 흔들림을 피하여 인터페이스 손상을 방지하세요.
15. 원심분리관을 조심스럽게 제거하고 5mL 파스퇴르 피펫으로 상단 적색 배지 층을 흡입하세요. 그 후 액체층 경계면에서 섬을 포함한 액체를 조심스럽게 흡입하여 새로운 50mL 원심분리관으로 옮깁니다. RPMI-1640 완전 배지 20mL를 넣고, 180 × g 에서 4°C에서 2분간 원심분리한 후 상청액을 버립니다.
16. 펠릿을 20mL RPMI-1640 완전 배지로 재현탁하고, 180 × g 에서 4 °C에서 2분간 원심분리한 후 상원액을 버립니다.
17. 펠릿을 10mL RPMI-1640 완전 배지로 재현탁한 후 60mm 세포 배양 접시로 옮깁니다.
18. 역형 생물 현미경(100배 배율) 아래에서 20 μL 피펫을 사용해 수동으로 섬을 선택합니다. 선택된 아일릿을 24웰 배양판에 500 μL RPMI-1640 완전 배지를 미리 적재한 배양 플레이트로 옮깁니다.
19. Ficoll 용액층을 폐기하고, 2.15단계의 펠릿을 10mL DMEM 완전 배지와 함께 재현탁한 뒤, 100 μm 셀 체로 걸러내고, 180 × g 에서 4 °C에서 2분간 원심분리한 후 상원액을 버립니다.
20. 펠릿을 10mL DMEM 완전 배지와 함께 재현탁하고, 180 × g 에서 4 °C에서 2분간 원심분리한 후 상원액을 버립니다. 그 후 5mL의 DMEM 완전 배지를 넣어 펠릿을 재현탁하여 후속 실험을 수행합니다.

3. 췌장 섬과 원뿔세포의 생존 가능성 검출

1. 분리된 섬과 적절한 수의 아시나르 세포를 12웰/24웰 배양판에 각각 1mL RPMI-1640 완전배지와 1mL DMEM 전액 배양지를 담고 옮깁니다. 플레이트를 37°C, 5% CO₂ 셀 인큐베이터에 15분간 넣어 평형을 맞춥니다.
2. 12웰/24웰 세포 배양판을 180 × g 에서 25 °C에서 30초 원심분리합니다. 그동안 칼세인/프로피디움 요오드화물(칼세인/PI) 세포 생존 및 세포독성 분석 키트의 지침에 따라 염색 시약을 준비하세요(준비 중 빛으로부터 보호).
3. 배지를 부드럽게 버리고, 섬과 아시나르 세포를 인산 완충 식염수(PBS)로 한 번 세척한 후 3.2단계와 동일한 조건에서 원심분리합니다.
4. PBS를 버리고, 준비된 염색 시약으로 섬과 아시나르 셀을 다시 현탁하세요. 배양판을 알루미늄 호일로 감싸(빛으로부터 보호하기 위해) 37°C, 5% CO₂ 세포 인큐베이터에서 30분간 배양하세요.
5. 빛이 차단된 환경에서 형광 현미경(100배 배율)으로 이미지를 촬영하고 ImageJ를 통해 세포 생존 분석을 수행합니다.

4. 아시나 아밀라아제 분석법

1. 12웰 플레이트에 1.5 ×^{6 세포 밀도}로 1mL 배지를 시딩합니다. 대조군(Ctrl)과 세룰린 자극 세포(10 nM, 20 nM, 50 nM; C10, C20, C50으로 표시됨)를 설정하세요. 30분 자극 후에는 제조사 지침에 따라 아밀라아제 활성 검사를 위해 상원액을 채취하세요.

5. 포도당 자극 인슐린 방출 분석

1. 24웰 플레이트에 우물당 10개의 아슬렛을 씨앗 뿌립니다. 섬을 완전한 RPMI-1640 매체에서 2시간 안정화한 후 매체를 버리세요.
2. 섬을 5.6 mM 포도당 용액 1mL에 1시간 배양합니다. 그 후에 상원액을 채취하세요.
3. 섬은 KRBH 버퍼로 세척하세요. 다음으로 소환체를 22 mM 포도당 용액에 1시간 배양한 후 상원액을 다시 수집합니다.
4. 마우스 INS(인슐린) ELISA 키트를 사용해 두 상청액의 인슐린 농도를 저혈당과 고혈당 조건에서 검출하세요. 포도당 자극 인슐린 지수(GSI) 계산:
   GSI = 고포도당 배지에서의 인슐린 농도 / 저포도당 배지에서의 인슐린 농도

Results

피콜 용액 밀도 구배 원심분리 후, 투명한 무색 액체층과 매질 사이의 경계 근처에서 섬들이 관찰되었으며, 튜브 바닥에 PAC가 퇴적물로 존재했습니다(그림 1).

광학 현미경 아래에서 섬들은 일반적으로 둥근 또는 타원형이며 황갈색이었으며, 쥐당 120개 ± 5개의 섬을 안정적으로 발견했습니다(그림 2A,B). 갓 분리된 PAC는 구형이며 주로 클러스터(클러스터당 3-8개의 acinar cells)로 분포했습니다. 아시나르 세포의 끝 끝은 색이 더 어두웠고, 자이모겐 과립이 뚜렷하게 보였다; 세포 주변에는 과립이나 소포 구조가 관찰되지 않았고, 용액 배경도 명확했다. 아시나르 세포의 수확량은 쥐당 1.6개에서 1.95개× 10/6개 [(1.77 ×^{10 7}) ± (1.75 × 10⁶)] 사이였다(그림 2C,D).

섬과 아시나르 세포의 칼세인/PI 염색 결과는 그림 3A에 나와 있습니다: 칼세인 염색 세포(녹색)가 대다수를 차지했고, PI 염색 세포(빨간색)는 드물었습니다. 생선/사망 염색 이미지의 정량 분석은 ImageJ를 사용하였습니다. 결과는 분리된 섬과 원뿔세포의 생존율이 각각 (97.52 ± 0.16)%와 (96.55 ± 0.95)%임을 보여주었다(그림 3B).

분리된 췌장 세포의 기저 아밀라아제 활성은 (0.79 ± 0.01) U/mL였습니다. 10 nM, 20 nM, 50 nM 농도로 카에룰린으로 자극한 후, 아시나르 세포의 아밀라제 활성은 각각 (1.45 ± 0.03) U/mL, (1.65 ± 0.05) U/mL, (1.39 ± 0.02) U/mL였습니다. 일원 ANOVA 결과는 대조군(Ctrl) 그룹과 비교했을 때, 모든 세룰린 자극 그룹이 아밀라아제 활성에서 유의미한 차이를 보였음을 나타냈습니다(모두 P < 0.001). 또한, 20 nM과 10 nM 세룰레인 그룹 간에 아밀라아제 활성에 유의미한 차이가 관찰되었습니다(P < 0.001)(그림 4A).

5.6 mM 포도당 용액으로 자극했을 때, 분리된 섬들의 인슐린 분비량은 (0.27 ± 0.04) ng/mL/islet/h였습니다. 22 mM 포도당 용액으로 자극했을 때, 분리된 섬들의 인슐린 분비량은 (0.94 ± 0.04) ng/mL/islet/h였으며, GSI는 3.44였습니다. 결과는 분리된 섬들이 서로 다른 농도의 포도당 용액 자극 하에서 전형적이고 효과적인 인슐린 분비 반응을 보인다는 것을 나타냅니다(그림 4B).

우리 연구팀은 분리된 섬과 아시나르 세포의 양과 질이 소화 시간과 밀접한 관련이 있으며, 이는 운영 중 엄격한 제어가 필요하고 다양한 조작자에 의해 덜 영향을 받는다는 점을 관찰했습니다. 한편, 수율과 생존력의 변동은 완전한 췌장 박리와 췌장 조직의 기계적 분리와 밀접한 관련이 있어, 수술 중 주의가 필요합니다.

그림 1: Ficoll 용액 밀도 구배 원심분리 결과. 섬층은 무색 투명한 액체층과 배양 배지 사이의 경계면에 위치합니다. 원심분리기 튜브 바닥에 있는 침전물은 PAC입니다. 약어: PACs: 췌장 액시나르 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 소와 PAC의 형태학적 및 정량적 특성. (A) 쥐 췌장 조직에서 분리된 소도의 형태. 스케일 바 = 100 μm. (B) 마우스 췌장 조직에서 분리된 섬 수의 정량적 분석(n = 3). (C) 마우스 췌장 조직에서 분리된 PAC의 형태학. 스케일 바 = 100 μm. (D) 마우스 췌장 조직에서 분리된 PAC 수에 대한 정량적 분석(n = 3). 모든 데이터는 평균 ± SD로 표현되었습니다. 약칭: PACs: 췌장 선반 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 섬과 PAC의 생존 가능성 평가. (A) 쥐 섬과 PAC의 생존 가능성 평가를 위한 칼세인/프로피듐 요오다이드 형광 염색. 초록색: 생체 세포. 빨간색: 죽은 세포. 스케일 바 = 100 μm. (B) 섬과 PAC의 생존 가능성에 대한 정량적 분석(n = 3). 모든 데이터는 표준편± 평균으로 표현되었습니다. 약어: PACs: 췌장 선반세포; PI = 프로피디움 요오다이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: PACs의 아밀라아제 활성과 섬의 인슐린 분비 능력 평가. (A) 서로 다른 세룰린 농도에 의한 PACs의 아밀라아제 활성(Ctrl: 대조군; C10, C20, C50: 세룰린 농도는 10 nM, 20 nM, 50 nM(n = 3)이었습니다. (B) 포도당 자극 인슐린 분비 농도의 정량적 분석(n = 3). 모든 데이터는 평균 표준± 기준으로 표현되었습니다. ***P < 0.001. 약어: GSI = 포도당 자극 인슐린 지수; PACs: 췌장 선동세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

Discussion

최근 몇 년간 췌장염 후 당뇨병(PPDM)은 널리 주목받고 있습니다^. AP 맥락에서 PACs가 섬 호르몬 분비에 영향을 미치는 분자 메커니즘을 조사하는 것은 매우 중요합니다.

AP의 병인은 주로 췌장 효소의 과도한 활성화와 관련이 있으며, 이는 췌장 조직의 자가소화를 유발합니다^11,12. AR42J, 266-6(아시나르 세포주)과 MIN6, INS-1(β세포주)과 같은 세포주가 현재 사용 가능하지만, 이러한 시험관 내 세포 모델들은 원발 아시나세포와 섬의 생리학적 복잡성을 완전히 재현하지 못합니다. ^4,5. 따라서 일차 선반세포와 섬을 분리하는 것은 췌장의 외분비와 내분비 구획 간 상호작용에 대한 심층 연구를 위해 매우 중요합니다. 현재 섬 분리 방법은 잘 확립되어 있으며; 그러나 대부분은 섬과 췌장 선반세포 간 상호작용을 연구하는 데 필요한 연구 요구를 충족하지 못합니다 ^6,7,8.

이 실험 프로토콜은 췌장 관류 절차를 최적화하여 기술적 장벽을 낮춰 담관 관내 캐뉰레이션에 대한 전문 교육을 받지 않은 연구자들도 실험을 수행할 수 있게 합니다. 또한, 분리된 섬과 원액 세포의 양과 질을 보장하여, 원발 쥐 섬과 원발 췌장 탄방세포를 동시에 분리하는 간단하고 신속한 방법을 제공합니다.

이 방법은 섬 분리 과정을 단순화하지만, 주요 단계들은 여전히 높은 수율과 섬과 췌장 세포의 효과적인 분리를 위해 엄격한 통제가 필요합니다. 이 단계에는 적절한 췌장 관류, 적절한 조직 파괴(철저한 다짐 보장), 췌장 소화(소화 시간 정밀한 조절 및 소화 중 수동 흔들기), 기계적 피펫 사용(피펫 수와 강도 조절)이 포함됩니다. 섬 선택 전에 재현수된 섬은 약 10분간 세포 인큐베이터에서 안정화하여 보다 효율적인 섬 선택을 촉진해야 합니다.

췌장 관류 시에는 더 맑은 액체 소포를 주입할 때 더 나은 결과를 얻는다는 점이 중요합니다; 췌장 조직 전체를 완전히 관류해야 하지만, 관류 시간은 1-2분 이내에 조절해야 합니다. 세포 생존성이 낮게 검출되면 췌장 조직과 콜라겐제 P 간의 접촉 시간(관류 시간과 수욕 소화 시간 포함)을 조정하세요. 또한, 격리 시 기계적 손상에 주의하세요. 예를 들어, 췌장 조직을 분산시킬 때 과도한 힘을 주지 마세요. 섬과 아시나르 세포의 격리 기간 내내 무균 기법을 유지하여 오염을 방지해야 합니다. 준비된 시약은 0.22 μm 필터를 거쳐 필터링해야 합니다. 격리 과정은 생물안전 캐비닛 내에서 수행되어야 하며, 격리 중 사용되는 모든 기기와 소모품은 멸균되어야 합니다. 두 가지 완성된 배지에는 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액도 포함되어 있습니다.

쥐 마취의 경우: 왼손 엄지와 검지로 쥐의 목 피부를 고정하고, 약지와 새끼손가락으로 복부를 받치세요(머리를 숙이고 복부를 위로 향한 자세를 유지하여 복강을 노출시키세요). 오른손으로 주사기를 잡고, 쥐의 왼쪽 하복부 피부(사타구니에서 1cm, 중앙선에서 0.5cm)에 30° 각도로 삽입한 뒤, 천천히 마취제를 주입한 뒤, 주사 후 10초간 멸균 면봉으로 주사 부위를 눌러 약물 누출을 방지하세요. 쥐를 완전히 마취한 후에만 경추 탈구로 안락사시키세요.

오염된 바늘(쥐의 혈액이나 조직에 노출됨)에 찔리거나 쥐에게 물렸을 경우, 즉시 가장 가까운 싱크대 주변을 압수하여 소량의 혈액을 배출하고, 상처를 흐르는 물로 15분간 지속적으로 헹군 후 75% 에탄올 또는 0.5% 포비돈-요오딘으로 소독합니다.

아시나 세포 아밀라아제 활성 분석 결과, 분리된 췌장 아시나르 세포는 기저 활성화 수준이 낮고 세룰린 자극에 민감함을 보였다: 세룰린 농도가 상승할수록 아밀라아제 활성이 점차 증가했고, 20 nM 세룰린에서 최고 수준에 도달했으며, 세룰린 농도가 50 nM일 때는 약간 감소했다. 포도당 자극 인슐린 분비 분석 결과, 분리된 섬들은 다양한 농도의 포도당 용액 자극 하에서 전형적이고 효과적인 인슐린 분비 반응을 보였다. 이 결과는 이 프로토콜로 추출된 선방세포와 섬 이 이후 시험 관 내 실험에 적합함을 나타냅니다.

이 실험 프로토콜의 섬과 선반세포 분리 절차는 조작이 쉽습니다. 실험 결과는 이 프로토콜로 분리된 섬과 원뿔세포가 우수한 양과 생존성을 보임을 보여줍니다. 또한 우리 팀의 여러 구성원이 여러 마우스를 사용해 이 프로토콜을 검증했습니다; 검증 결과는 재현성이 우수하고, 신뢰할 수 있는 데이터이며, 세포 수율의 변동이 최소화됨을 보여줍니다. 하지만 이 프로토콜에도 몇 가지 한계가 있습니다. 조작자의 기술적 능력에 대한 의존도는 낮지만, 완전한 해부를 위해서는 기본적인 마우스 해부학 지식이 필요합니다. 이는 전체 분리 과정의 전제 조건입니다. 여러 마우스의 췌장 조직을 동시에 분리할 경우, 콜라겐제 P 용액과 기타 시약의 양을 적절히 조절해야 합니다. 또한, 두 마리 이상의 마우스에서 동시에 분리하는 것은 권장되지 않습니다. 해부, 관류, 다진 과정에서 서로 다른 마우스의 췌장 조직을 처리하는 시간 차이가 췌장 조직과 콜라겐제 P 간의 접촉 시간에 영향을 미쳐 세포 분리의 효율성과 생존 가능성을 저하시킵니다. 따라서 대규모 적용은 제한적일 수 있습니다. 더불어, 이 프로토콜은 쥐에서 검증된 바 없습니다. 쥐에서 섬과 원뿔세포를 분리할 경우, 일부 시약의 용량과 소화 시간이 추가로 조정되어야 할 수 있습니다.

결론적으로, 이 실험 프로토콜은 1차 마우스 섬과 1차 췌장 액상세포를 동시에 분리하는 간단하고 신속한 방법을 제공합니다. 경험이 부족한 연구자에게는 섬과 원뿔세포 분리를 수행하는 데 더 적합하며, 췌장 외분비-내분비 상호작용에 대한 시험 관 내 실험 틀도 제공합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 & mu; M 필터	밀렉스	SLGPR33RB	준비된 콜라겐제 P 용액을 여과합니다
0.25 M 염화칼슘 (무균)	비요타임	ST365	인슐린 분비를 활성화하는 칼슘 의존 신호 경로
1ml 주사기	지에루이	10084692516405	콜라겐제 P를 췌장 조직으로 관류시키는 데 사용됩니다.
1.25% 트리브로모에탄올 용액	베이징 요시다 생명공학 유한회사.	JT0781	마취
1.5 mL 원심분리관	에펜도르프	30121589	세포 상청액을 수집하여 원심분리 및 저장합니다.
1x 행크' S의 균형 잡힌 소금 용액	바이오샤프	BL561A	콜라겐제 P 용액을 준비하고 췌장 조직을 세척하세요
12웰 세포 배양 플레이트	사스테트	83.3921	췌장 조직과 배양에서 추출한 아시나를 보관하세요
15 mL 원심분리관	베이징 라브직 테크놀로지 유한회사.	CT-002-15A	실험 중 용액을 보관하기
24웰 세포 배양 플레이트	사스테트	83.3922	추출한 섬들을 양식하세요
40-mesh  체(체)	웨이단 인스트루먼트	해당 없음	췌장 조직 필터링
5 mL 파스퇴르 피펫	바이오샤프	BS-XG-03L	피펫 액체와 췌장 조직 물리적 교란
50 mL 원심분리기 튜브	베이징 라브직 테크놀로지 유한회사.	CT-002-50A	실험 중 용액을 보유하고, 조직을 담고, 원심분리하는 방법
60mm 세포 배양 접시	베이징 라브직 테크놀로지 유한회사.	12211	쉽게 따기 쉬운 아일렛을 담은 배양 배지를 담는 용기
75% 에탄올 용액	하이노트	해당 없음	쥐를 소독을 위해 불려 주세요.
어도비 포토샵 2023	어도비 주식회사	해당 없음	이미지를 생성하세요.
벡만 알레그라 X-12/X-12R 원심분리기	벡맨	알레그라 X-12/X-12R	원심분리기
소 혈청 알부민(BSA)-V	솔라비오	A8020	섬의 정상적인 생리적 기능을 유지하고, 다양한 농도의 포도당 용액을 준비하는 데 사용하세요.
C57BL/6J 마우스, SPF 등급, 6– 8주 된 상태, 몸무게는 18살 정도입니다; 25g	해군 의과대학 실험동물센터
칼세인/PI 세포 생존 및 세포독성 분석 키트	비요타임	C2015L	칼세인-AM(칼세인 AM)과 프로피듐 요오다이드(PI) 이중 형광 염색을 통해 생존 가능한 세포와 죽은 세포를 동시에 검출하여 동물 세포의 세포 생존력과 세포독성을 검출합니다.
염화칼슘(무수)	상곤 바이오텍	10043-52-4	콜라겐제 P 용액을 준비하세요
셀 스트레이너 (100 & mu; m)	바이오샤프	BS-100-XBS	여과 액시나 세포
콜라게나제 P	시그마	11213857001	췌장 조직 소화
D-(+)-포도당 용액 (20%, 멸균)	비요타임	ST491	섬에서 인슐린 분비를 자극하세요.
DMEM 기본 (1회) (Dulbecco' s 변형된 이글 중간)	깁코	C11995500BT	세포 배양
태아 소 혈청(FBS)	바이오웨스트	S140B-500	배양지 준비
Ficoll-Paque PREMIUM 멸균 용액	시티바	17544203	밀도 구배 층화를 위한 밀도 구배 매질
그래프패드 프리즘 8.0.1	그래프패드 소프트웨어 LLC	해당 없음	이미지를 생성하고 통계 분석을 수행하세요.
HEPES 용액 (1 M)	바이오샤프	BL1061A	콜라겐제 P 용액을 준비하세요
고속/냉장 원심분리기	시그마	3K15	원심분리기
이미지J	국립보건원(NIH) 광학 및 계산 기기 연구소(LOCI)	해당 없음	세포 형광 영상을 분석하고 세포 생존력을 계산합니다.
역형 생물 현미경	라이카	해당 없음	세포 형태를 관찰하고 섬을 선택하세요.
역형광현미경	올림포스	IX73	세포 형광 신호를 관찰하고 형광 이미지를 포착하세요.
크렙스-링거 중탄산염 HEPES 완충기	리젠	CZ0103	섬의 정상적인 생리적 기능을 유지하고, 다양한 농도의 포도당 용액을 준비하는 데 사용하세요.
마우스 INS(인슐린) ELISA 키트	우한 파인 바이오테크 유한회사.	EM0260	섬의 인슐린 분비 수준을 감지하세요.
안과 겸자 (10cm, 굽이가 있는 곡선형)	칭이 의료기기	해당 없음	해부 보조
안과 겸자 (10cm, 치아가 있는 직선)	칭이 의료기기	해당 없음	췌장 조직의 해리 및 갑작스러운 분리 및 췌장 조직 추출을 지원합니다
페니실린 스트렙토마이신 용액	깁코	15140-122	오염을 방지하기 위해 배양지를 준비하세요
RPMI-1640 중형,	KeyGEN 바이오테크	KGL1501-500	콜라겐제 P소화액을 제거하고 섬을 배양하세요
Glycine max(대두)의 트립신 억제제입니다	시그마	T6522	콜라겐제 P 용액을 준비하세요
급박 가위 (10cm, 직선 뾰족)	칭이 의료기기	해당 없음	해부학 지원과 췌장 조직을 작은 조각으로 절단하는 데 도움이 됩니다
워터 배스	OAIICLAB	OW-HF	소화 온도를 유지하세요.
&알파-아밀라아제 및 &베타;-아밀라아제 활성 분석 키트	일러브사이언스	E-BC-K006-M	다양한 조건에서 아시나 세포가 분비하는 아밀라아제 수치를 검출합니다