방법 논문

차세대 시퀀싱을 사용한 비소세포폐암의 표적 변화 검출

DOI:

10.3791/69091

⸱

2025년 10월 10일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, State Key Laboratory of Molecular Oncology, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2Department of Education, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 비소세포폐암(NSCLC) 포르말린 고정 파라핀 포매 조직에서 표적 가능한 게놈 변경을 검출하기 위한 자동화된 ISO15189 인증 차세대 시퀀싱 워크플로우를 설명합니다.

초록

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비소세포폐암(NSCLC)에서 표적 치료의 성공 여부는 돌연변이, 유전자 융합 및 증폭을 포함한 동인 변경의 정확한 식별에 달려 있습니다. 차세대 시퀀싱(NGS)은 알려진 게놈 이상과 새로운 게놈 이상을 모두 감지할 수 있는 포괄적인 분자 진단 도구로 등장하여 맞춤형 NSCLC 치료에 대한 중요한 지원을 제공합니다. 그러나 NGS는 여전히 복잡하고 기술적으로 어려운 방법입니다. 널리 채택되었음에도 불구하고 NGS는 여전히 기술적 복잡성과 긴 처리 시간 등 몇 가지 과제에 직면해 있습니다. 여기에서는 임상 실험실에서 구현된 ISO15189 인증 NGS 워크플로를 소개합니다. 표준화된 프로토콜에는 종양 세포질 평가(≥20%), 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직에서 DNA 추출(DNA 입력 ≥ 50ng), 자동 라이브러리 준비 및 생물정보학 분석이 포함되었습니다. 각 단계에서 엄격한 품질 관리(QC) 조치를 통합함으로써 워크플로는 높은 데이터 신뢰성을 보장합니다. 게다가 워크플로우의 핵심 혁신은 NGS 라이브러리 구축의 자동화였습니다. NGS 라이브러리 구축의 자동화 시스템에는 말단 수리, A-테일링, 어댑터 결찰, 혼성화 캡처 및 정제가 포함되어 인적 오류를 효과적으로 최소화하고 실험 재현성을 향상시키며 실무 시간을 줄여 효율성을 향상시켰습니다. 경험에 따르면 엄격한 QC와 자동화된 라이브러리 준비가 임상 NGS 테스트의 정확성과 확장성을 유지하는 데 필수적입니다. 이러한 최적화된 접근 방식은 ISO15189 표준 준수를 보장할 뿐만 아니라 NSCLC 관리에서 정밀 종양학에 대한 수요 증가를 지원합니다.

서론

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비소세포폐암(NSCLC)은 모든 폐암 사례의 75%-85%를 차지하며, 이는 임상적 우선순위이자 치료적 도전을 모두 나타냅니다1,2,3. 최근 몇 년 동안 표피 성장 인자 수용체 티로신 키나제 억제제(EGFR-TKI)와 같은 분자 표적 약물의 성공적인 개발 및 임상 적용으로 진행성 NSCLC 치료는 맞춤형 정밀 치료의 시대에 접어들었습니다 4,5,6. 표적 치료는 정확한 효능, 높은 특이성 및 최소한의 부작용을 제공합니다 7,8. 이러한 치료의 변화는 동시에 분자 진단 기술에 대한 수요를 증가시켰습니다.

현재 포괄적인 종양 표적 검사는 정확한 유전적 돌연변이 프로필을 밝히는 데 도움이 될 임상 실습의 필수 구성 요소가 되었으며, 따라서 후속 표적 약물 사용, 약물 내성 모니터링 및 환자의 예후 평가를 위한 신뢰할 수 있는 기반을 제공합니다. 특히, 고처리량 및 고감도 기술적 이점을 활용하는 NGS 기반 다중 유전자 검사는 이미 임상 적용에 권장되었습니다 9,10,11,12.

전통적인 분자 진단 기술과 비교할 때 NGS는 획기적인 이점을 보여줍니다. NGS의 가장 큰 장점은 높은 처리량 기능에 있습니다. 이는 알려진 유전적 변형과 알려지지 않은 유전적 변형을 모두 포함하는 여러 유전자의 동시 검출을 가능하게 합니다13,14. 한편, NGS는 단일 실행으로 포괄적인 테스트를 달성하여 비용, 샘플 소비 및 테스트 처리 시간을 상대적으로 줄입니다15,16. 이러한 장점을 감안할 때 NGS는 임상 실습에 점점 더 많이 적용되고 있습니다. 그러나 NGS의 프로세스는 종양 세포질 평가, 핵산 추출, 자동 라이브러리 준비 및 생물정보학 분석을 포함하여 복잡합니다. 초기 샘플 처리의 품질은 후속 생물정보학 분석의 성능에 직접적인 영향을 미칩니다17. 특히, 라이브러리 준비에는 원시 핵산 샘플을 시퀀싱 기기와 호환되는 표준화된 라이브러리로 변환하는 일련의 단계가 포함됩니다. 라이브러리 준비에는 단편화, 말단 복구, 어댑터 결찰 및 PCR 증폭이 포함됩니다18. 이 복잡한 과정은 종종 다양한 기술적 편향을 도입합니다: 예를 들어, 단편화는 이색색질 영역의 과소 대표로 이어질 수 있습니다. 어댑터 결찰 중 리가아제의 기질 선호도는 특정 서열의 손실을 초래할 수 있습니다. PCR 증폭은 극단적인 GC 함량을 가진 영역에서 고르지 않은 적용 범위를 유발하는 경향이 있습니다19. 이러한 체계적 편향은 시퀀싱 데이터의 품질을 저하시킬 뿐만 아니라 후속 생물정보학 분석에서 잘못된 결론으로 이어질 수도 있습니다. 따라서 실험 결과의 신뢰성과 일관성을 보장하려면 엄격한 QC 시스템을 구축하는 것이 필수적입니다.

이러한 오랜 기술적 과제를 해결하기 위해 실험실은 완전 자동화된 NGS 시스템을 채택했습니다. 이 시스템은 수동 처리 시간을 줄이고 전체 처리 기간을 단축하도록 설계되었습니다. 프로그래밍 가능한 프로토콜을 통합하여 운영 유연성과 처리 정밀도를 모두 보장하는 동시에 통합 모듈과 장치를 활용하여 각 단계에서 잠재적인 기술 편향을 효과적으로 최소화합니다. 또한, 이 자동화된 솔루션은 라이브러리 준비의 재현성과 처리량을 향상시킬 뿐만 아니라, 더 중요한 것은 시퀀싱 데이터가 원본 샘플의 분자 구성을 보다 정확하게 반영하도록 보장합니다. 여기서 실험실은 DNA 기반 NGS를 사용하여 운전자 변경 감지를 통해 시스템을 소개하고자 합니다.

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프로토콜

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프로토콜은 익명화된 보관 샘플에 대한 IRB 면제를 받았습니다.

1. 사전 테스트 단계 및 QC

  1. 실험실 정보 관리 시스템에 샘플 정보를 등록합니다(표 1). 유전자 돌연변이 검사를 위한 사전 동의서를 작성하십시오.
  2. NSCLC FFPE 샘플을 받습니다. 테스트에 사용되는 샘플이 2년 이상 보관되지 않은 파라핀 조직 샘플인지 확인하십시오. 샘플이 표준 병리학적 방법에 따라 처리 및 보관되었는지 확인하십시오.
    참고: 이 연구는 대규모 임상 분석을 수행하기보다는 주로 방법론적 워크플로에 중점을 둡니다. 따라서 이 연구 단계에 대한 특정 샘플 수 요구 사항은 설정되지 않았습니다.
  3. 일회용 마이크로톰 블레이드를 사용하여 절편을 절단합니다. 교차 오염을 방지하고 작업자 유래 오염 물질(예: 모발, 피부 세포, 타액)의 유입을 방지하기 위해 샘플 간에 블레이드, 겸자 및 1.5ml 마이크로튜브를 교체하십시오.
    참고: 큰 샘플 크기(≥ 0.5cm x 0.5cm) 6-10μL, 5장; 작은 샘플 크기(< 0.5 cm x 0.5 cm) 및 천자 샘플, 6-10 μL, 10매.
  4. 종양 세포 함량을 평가하기 위해 일상적인 헤마톡실린-에오신(HE) 염색을 수행합니다.
  5. 다운스트림 분석을 위해 ≥20% 악성 종양 세포를 포함하는 샘플을 선택합니다. 종양 함량은 HE 스테인드 글라스 슬라이드20에 대해 병리학자에 의해 평가됩니다.
    참고: 종양 함량이 20% 미만인 경우 HE 슬라이드에 표시된 종양 영역의 안내에 따라 해당 종양 조직 영역을 긁어냅니다. 이 과정은 주변의 비종양 성분을 효과적으로 제거함으로써 종양 조직의 농축을 달성하여 수집된 물질에서 종양 세포의 비율을 크게 증가시킵니다.
  6. 아래에 설명된 대로 자동 정제 시스템을 사용하여 핵산 추출을 수행합니다.
    1. 마이크로톰을 사용하여 FFPE 블록을 단면화하여 리본을 얻습니다. 리본을 1.5ml 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다. 리본을 자동 추출 기기의 지정된 샘플 입력 위치로 옮깁니다.
    2. 자동 추출 키트와 함께 자동 추출 기기를 사용하고 수동 피펫팅을 자동 마그네틱 비드 핵산 추출 시스템으로 대체하십시오.
      참고: 이 단계를 자동화하면 자동 추출을 보장하여 다운스트림 NGS 응용 분야를 위한 고정밀 및 재현 가능한 DNA 생산을 보장하는 데 도움이 됩니다.
    3. 핵산을 추출하려면 전자동 핵산 정제기 및 핵산 추출 시약의 지침을 참조하십시오.
    4. 그런 다음 C1102 프로그램을 선택하고 샘플 탈랍 배양 시간을 16시간으로, 용출량을 100μL로 선택합니다.
      참고: 추출된 DNA 용액을 즉시 테스트하지 않으면 -20°C에서 6개월 이상 보관해야 합니다.
  7. 아래에 설명된 대로 핵산 품질(표 2)을 평가합니다.
    1. 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 DNA 단편 크기를 결정합니다. 저투입 시료에는 Agilent2100 및 기타 미세유체 모세관 전기영동 분석 시스템을 사용하십시오.
    2. 1g의 아가로스를 100mL의 TAE 용액에 녹입니다. 투명해질 때까지 수조에서 혼합물을 가열합니다. 용액을 약 60°C로 냉각합니다.
    3. 전기영동 기기의 양극(빨간색)에 연결합니다. 음극(검은색)을 전압 180V로 수행하고 15분동안 21,22 동안 실행합니다.
    4. 아가로스 겔 전기영동 결과에 따라 단편 크기를 4가지 수준(A-D; 표 3), 후속 작업을 위해 A-C 수준의 핵산을 선택합니다.
    5. 분광 광도법을 사용하여 순도를 확인합니다. OD260/OD280 > 1.8을 확인하십시오. OD260/OD230 > 허용 가능한 오염 물질 수준을 나타내기 위해2.0 23,24.
    6. DNA 농도를 정확하게 측정하기 위해 형광 분석용 서열별 형광 염료를 기반으로 하는 검출 키트(재료 표)를 사용합니다.
    7. 199μL의 작업 용액에 테스트할 DNA 1μL를 첨가한 다음 혼합하고 잠시 원심분리한 다음 형광계(재료 표)를 사용하여 농도를 측정합니다.

2. 라이브러리 준비 및 QC(그림 1)

  1. 아래에 설명 된 대로 초음파 처리 ( 재료 표)를 사용하여 단편 게놈 DNA를 준비하십시오.
    1. 200ng 게놈 DNA를 50μL의 저Tris-EDTA(TE) 완충액에 혼합합니다. 그런 다음 샘플 튜브를 예식된(8°C) 샘플 랙에 보관합니다.
    2. 표 4에 따라 기기 매개변수를 설정합니다. 그런 다음 조각화를 시작합니다.
    3. 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 단편화 효과를 확인합니다. 이 단계에서는 후속 단계를 위해 끝을 뭉툭한 끝으로 변환하기 위해 끝 수리가 필요한 손상된 말단이 있는 DNA 단편을 생성합니다.
  2. 아래 설명된 대로 3'에서 끝 수리 및 A 추가를 수행합니다.
    1. FFPE DNA의 손상된 말단을 효소로 복구하여 평평한 끝을 형성하여 3'-OH 및 5'-P를 보장합니다. 평평한 이중 가닥 3' 끝에 A를 추가합니다.
    2. 말단 복구 완충액 7μL와 말단 복구 효소 3μL를 첨가하여 ERA 혼합물을 준비하고, 수동으로 3x-5x를 부드럽게 튕기고, 1-3초 동안 원심분리합니다.
    3. ERA 혼합물을 50μL의 깨진 DNA 샘플에 첨가하고 부드럽게 혼합한 다음 1-3초 동안 원심분리합니다.
    4. PCR 기기에 넣고 ERA 프로그램(20°C에서 30분, 65°C에서 30분, 4°C 유지; 뚜껑 85°C). 2시간 이내에 다음 작업을 수행합니다.
  3. 아래 설명된 대로 어댑터 결찰을 수행합니다.
    1. 30 μL의 결찰 완충액, 10 μL의 DNA 리가제 및 10 μL의 DNA 어댑터를 첨가하여 반응 시스템 LIG 혼합물을 준비합니다. 그런 다음 수동으로 가볍게 3x-5x를 튕기고 1-3초 동안 원심분리합니다.
    2. 이전 단계의 60μL 제품에 50μL의 LIG 혼합물을 첨가하고 부드럽게 혼합한 다음 1-3초 동안 원심분리합니다.
    3. 혼합물을 PCR 기기에 넣은 다음 LIG 프로그램(뚜껑을 가열하지 않고 15분 동안 20°C, 10분 동안 70°C(가열 커버), 4°C 유지; 뚜껑 85°C).
  4. 마그네틱 비드 정제를 수행합니다.
    1. 저흡착 원심분리기 튜브 1.5mL를 취하고 균질화된 마그네틱 비드 88μL와 어댑터 결찰 생성물 110μL를 추가합니다. 소용돌이치고 잘 섞은 후 실온에서 5분 동안 배양합니다.
    2. 즉시 배양된 샘플을 1-3초 동안 원심분리하고 원심분리기 튜브를 마그네틱 랙에 놓습니다. 용액이 맑아질 때까지 기다리십시오(약 3-5분).
    3. 튜브를 자석에 고정한 상태에서 캡을 열고 비드 펠릿을 방해하지 않고 피펫을 사용하여 제거된 상청액을 조심스럽게 흡인합니다.
    4. 튜브를 자석에 고정하고 새로 준비된 75% 에탄올 300μL를 각 튜브에 추가합니다.
    5. 마그네틱 비드가 완전히 가라앉을 때까지 1분 동안 기다립니다. 원심분리기 튜브를 수평으로 천천히 한 번 돌려 에탄올을 흡수합니다.
    6. 2.4.4단계와 2.4.5단계를 한 번 반복하여 총 2회 반복합니다.
    7. 1-3초 동안 순간 원심분리를 수행하고 튜브를 마그네틱 랙으로 되돌린 다음 30초 동안 기다립니다. 피펫을 사용하여 잔류 에탄올을 제거하고 튜브 덮개를 열어 둡니다.
    8. 비드 표면이 무광택으로 나타나고 균열이 없을 때까지 마그네틱 비드를 실온에서 2분 동안 건조시킵니다.
    9. 결찰 산물을 28μL의 용출 완충액(EB)으로 용리합니다.
      알림: 마그네틱 비드는 사용하기 전에 실온에서 최소 30분 동안 평형을 유지해야 합니다.
  5. 아래 설명된 대로 사전 라이브러리를 증폭하고 정제합니다.
    1. PCR 완충액 10μL, PCR 프라이머 10μL, dNTP 믹스 1.5μL, PCR 효소 1μL를 첨가하여 반응 시스템 프리믹스를 준비합니다. 수동으로 3x-5x를 부드럽게 두드리고 1-3초 동안 원심분리합니다.
    2. 이전 단계에서 정제된 생성물 27.5μL에 22.5μL의 프리믹스를 첨가하고 부드럽게 혼합한 다음 1-3초 동안 원심분리합니다.
    3. 프로그램 선택 PRE: 98 °C 45초; (98°C 15초, 60°C 30초, 72°C 30초) 12사이클; 72°C 2분; 4 °C 유지; 뚜껑 105°C.
    4. PCR 프로그램이 완료된 후 새로 준비된 75% 에탄올을 사용하여 마그네틱 비드 정제를 수행합니다. 18μL의 EB로 제품을 용리합니다.
  6. 아래에 설명된 대로 하이브리드를 캡처합니다.
    1. 15 μL의 사전 라이브러리와 4 μL의 차단제 혼합물을 첨가하여 반응 시스템 A를 준비합니다.
    2. PCR에 놓고 PCR 프로그램 HYB를 실행합니다(95°C에서 5분, 65°C 유지; 뚜껑 105°C).
    3. 하이브리드화 완충액 10μL, RNase 억제제 차단제 0.5μL, 프로브 1μL를 첨가하여 반응 시스템 B HYB 혼합물을 준비합니다. 3x-5x를 부드럽게 튕기고 1-3초 동안 원심분리합니다.
      참고: 프로브 이름은 LCOO1이고 프로브 유전자에는 EGFR, KRAS, BRAF, ALK 등이 포함됩니다.
    4. PCR 기기의 온도가 65°C로 떨어지면 반응 시스템 A에 11.5μL의 HYB 혼합물을 첨가하고 부드럽게 혼합한 다음 PCR 기기 뚜껑을 덮고 16-24시간 동안 배양을 계속합니다.
    5. 15mL 원뿔형 튜브에 세척 완충액 2를 금속 히터와 함께 65°C에서 샘플당 600μL의 용량으로 배양합니다.
    6. SCB 마그네틱 비드를 회수하고 5회 반전 및 혼합하고 10초 동안 소용돌이치고 실온에서 30분 동안 평형을 유지합니다. 10초 동안 소용돌이치고, 25μL를 1.5mL 저흡착 원심분리기 튜브로 옮기고, 마그네틱 랙에 3분 동안 놓은 후 상청액을 버립니다.
    7. 25μL SCB 마그네틱 비드에 200 μL의 Beads Wash Buffer를 첨가하고 3초 동안 소용돌이 및 혼합한 다음 1-3초 동안 잠시 원심분리한 다음 마그네틱 랙에 3분 동안 그대로 두고 상청액을 버립니다.
    8. 2.6.7 2회 단계를 총 3회 반복합니다.
    9. 200μL의 비드 세척 완충액을 마그네틱 비드에 첨가하고 소용돌이치고 3초 동안 혼합한 후 나중에 사용할 수 있도록 재현탁합니다.
    10. 약 30μL의 하이브리드 샘플을 재현탁된 SCB 마그네틱 비드에 옮기고, 소용돌이 및 혼합하고, 회전 믹서에 놓고, 실온에서 30분 동안 배양하고, 1-3초 동안 원심분리합니다.
    11. 혼합 튜브를 마그네틱 랙에 3분 동안 놓은 다음 약 230μL의 상청액을 흡인합니다. 500μL의 세척 완충액 1을 넣고 5초 동안 소용돌이치고 회전식 믹서에 놓은 다음 실온에서 15분 동안 배양합니다. 1-3초 동안 순간 원심분리기.
    12. 마그네틱 비드 샘플 혼합 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 3분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 약 500μL의 상청액과 잔류 액체를 흡인합니다.
    13. 150μL의 세척 완충액 2를 65°C로 예열하고 10초 동안 소용돌이치고 항온 혼합기에 놓고 흔들고 600rpm의 속도로 65°C에서 10분 동안 배양합니다. 1-3초 동안 순간 원심분리를 수행하고 마그네틱 랙에 3분 동안 놓고 약 150μL의 상청액 및 잔류 액체를 흡인합니다.
    14. 2.6.13 단계를 3회 반복하여 총 4회 반복합니다.
    15. 샘플 튜브에서 잔류 액체를 제거하기 위해 1-3초 동안 즉시 원심분리합니다. 20μL EB를 넣고 위아래로 8x-10x로 섞은 다음 잘 섞은 다음 나중에 사용할 수 있도록 얼음 위에 올려 놓습니다.
  7. 최종 라이브러리의 준비 및 정제.
    1. 증폭 믹스 25μL, 인덱스 5μL, 마그네틱 비드 라이브러리 20μL를 첨가하여 반응 시스템 POST 믹스를 준비합니다. 3x-5x를 부드럽게 두드리고 1-3초 동안 원심분리합니다. 부드럽게 섞고 1-3초 동안 원심분리합니다.
    2. 프로그램 선택 POST: 98 °C 45 초; (98°C 15초, 60°C 30초, 72°C 30초) 12사이클; 72 °C 10 분; 4 °C 유지; 뚜껑 105°C.
    3. PCR 프로그램이 완료된 후 새로 준비된 75% 에탄올을 사용하여 마그네틱 비드 정제를 수행합니다. 최종 라이브러리를 20μL의 EB로 용리합니다.

3. 완전 자동화된 라이브러리 준비(표 5)

  1. 전원 버튼을 눌러 시스템을 활성화하고 초기화를 기다립니다. 프로그램 설정으로 이동하여 프로토콜 실행을 선택한 다음 프로토콜: Burning Rock HS를 선택합니다.
  2. 분취량 QC 매개변수를 샘플 유형: 고품질 DNA로 설정합니다. 입력량(ng): 50; 사전 PCR 주기: 12; PCR 후 주기: 12. 실행을 클릭합니다.
  3. 사전 포장된 시약 카트리지를 지정된 슬롯에 삽입합니다(시약 배치 및 상태를 자동으로 확인).
  4. 샘플을 로드한 후 시작 을 눌러 시스템이 자율적으로 실행되도록 합니다. 진행 상황을 모니터링하려면 LED 표시등을 관찰하십시오.
  5. 프로그램이 종료된 후 확인 을 클릭하면 프로그램이 자동으로 최종 라이브러리를 라이브러리 튜브로 전송하여 라이브러리 준비가 완료됩니다.

4. 시퀀싱 및 QC

  1. 아래 설명된 대로 라이브러리 정량 및 QC를 수행합니다.
    1. 형광 측정법을 사용하여 사전 라이브러리 및 총 라이브러리 농도를 측정합니다.
    2. 라이브러리의 조각 크기를 감지합니다. 키트를 사용하여 라이브러리의 단편 크기와 어댑터의 존재 여부를 평가합니다(재료 표).
      참고: 최종 라이브러리에 프라이머 이량체가 포함된 경우 기계에서 샘플을 혼합하기 전에 추가 정제 단계를 추가해야 합니다. 조각 삽입에 대한 적격 표준은 ≥ 150bp이며 예상 포획 효율은 ≥ 40%입니다.
    3. 시퀀싱 작업을 위해 시퀀싱 라이브러리를 1.6 pM 및 1300 μL로 희석합니다.
  2. 아래 설명된 대로 시퀀싱 환경 모니터링을 수행합니다.
    1. 실내 온도(19-25°C), 실내 습도(20%-80%)를 포함한 시퀀싱 환경을 제어합니다.
    2. Q30 이상의 베이스 및 클러스터 밀도 통과 필터(PF)를 포함한 완전한 기기 출력 데이터 QC.

5. 시퀀싱 데이터 분석 및 QC

  1. 아래 설명된 대로 원시 데이터 처리 및 분자 프로파일링을 수행합니다.
    1. Burrows-Wheeler Aligner(버전 0.7.10)를 사용하여 시퀀싱 데이터를 hg19에 정렬합니다.
    2. Genome Analysis Tool Kit(버전 3.2) 및 Vardict(버전 1.5.1)를 사용하여 로컬 정렬, 최적화, 복제 표시 및 변이 호출을 수행합니다.
    3. VarScan(버전 2.4.3) fpfilter 파이프라인을 사용하여 변형을 필터링하고 깊이가 50 미만인 유전자좌를 제거합니다. ExAC, 1000 Genomes, dbSNP 또는 ESP6500SI-V2 데이터베이스에서 모집단 빈도가 0.1%를 초과하는 변이를 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)으로 분류하고 제외합니다.
    4. SnpEff(버전 3.6)를 사용하여 나머지 변형에 주석을 추가합니다.
    5. MarkSV(Burning Rock 알고리즘 도구)를 사용하여 대규모 게놈 재배열(LGR)을 포함한 구조적 변이체(SV)를 분석합니다. 캡처 간격의 커버리지 데이터 깊이를 기반으로 복제 수 변형(CNV)을 분석합니다.
    6. 구아닌-시토신 함량 및 프로브 설계로 인한 염기서열 분석 편향에 대한 정확한 커버리지 데이터.
  2. 25에 설명된 대로 평균 깊이, 중앙값 깊이, 고유 깊이, 삽입 크기, lib 복잡성, 적용 범위, Q30 비율 및 쌍을 이루는 샘플 상관 비율을 포함한 샘플 품질을 평가합니다.
  3. 보고서 생성의 경우 파이프라인 버전 및 매개변수를 확인하여 생물정보학 검토를 완료합니다. 관련 지침을 사용하여 돌연변이의 병원성을 평가하십시오26,27. 최종 보고서를 발행합니다.

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결과

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엄격한 품질 관리와 함께 자동화된 NGS 분석 워크플로를 활용하여 실험실은 NSCLC 표본의 포괄적인 게놈 프로파일링을 수행했습니다. 최적화된 검출 워크플로우(그림 2)는 대표적인 종양 샘플에서 임상적으로 실행 가능한 몇 가지 게놈 변형을 안정적으로 식별했습니다(그림 3).

시퀀싱 결과는 상당한 EGFR 유전자 복제 수 증폭(CN=14.7)을 동반한 고주파 EGFR p.L858R 미스센스 돌연변이(AF=89.25%)를 보여주었습니다. 또한 MET 유전자의 중간 증폭(CN=5.0)과 BRAF 유전자의 낮은 수준의 증폭(CN=3.8)이 관찰되었습니다. 분석된 패널에서 다른 병원성 유전자 변경은 검출되지 않았습니다. 면역요법 관련 바이오마커와 관련하여 결과...

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토론

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모든 적격 NGS 보고서는 여전히 복잡하고 시간이 많이 걸리는 엄격한 프로세스 뒤에 있습니다28. 이러한 문제를 해결하기 위해 실험실은 완전 자동화된 NGS 시스템을 개발했습니다. 이 작업은 수동 개입을 크게 줄이고 실험 오류를 최소화하며 처리 시간을 크게 단축합니다. 따라서 이 시스템은 NGS에 대한 보다 안정적이고 효율적인 전략을 제공하여 게놈 연구에서 데이터 품질에 대한 새로운 생각을 확립했습니다.

통합 시스템은 전체 워크플로우에 걸쳐 포괄적인 자동화를 제공하여 향상된 처리 효율성과 결과 신뢰성을 제공합니다. 첫째, 핵산 추출을 위해 실험실에서는 자동화된 마그네틱 비드 기반 핵산 추출 시스템을 사용하여 FFPE 샘플을 처리합니다. 병원 병리학 실험실에서 흔히 보관된 표본인 FFPE 샘플은 중요한 후향적 연구 가치를 가지고 있지만 핵산이 손상되기 쉽고 전통적인 추출 과정이...

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공개 사항

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 중화인민공화국 베이징 자연과학 재단(7252122), 중화인민공화국 베이징 시스커 임상 종양학 연구 재단(Y-HS202402-0021), 암 병원 레지던트 훈련 교육 연구 기금, 중국 의학 과학원 및 북경 연합 의과대학(E2025004), 국립 고등 병원 임상 연구 기금(2025-LYZX-R-B03).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
그리고 nbsp; 애질런트  고감도 DNA 키트그리고 nbsp; 애질런트5067-4626the 와 함께 사용하기 위해; Agilent 2100 바이오분석기 시스템
그리고 nbsp; 애질런트 DNA 1000 시약 키트그리고 nbsp; 애질런트5067-1504the 와 함께 사용하기 위해; Agilent 2100 바이오분석기 시스템
애질런트 2100 바이오분석기애질런트G2939A라이브러리의 조각 크기와 어댑터의 존재 여부를 평가하세요. 
콘서트 완전 자동 핵산 정제 기기음악회MC1002DNA 추출에 사용
Equalbit 1&time; dsDNA HS 분석 키트바지임EQ121-02-AAthe 와 함께 사용하기 위해; 큐비트 3.0 형광도계
인간 EGRR/KRAS/BRAF/ALK 유전자 통합 돌연변이 검출 키트버닝 록브-LC00102도서관 건설
매그니스 BR애질런트 테크놀로지스G7595AA자동화된 NGS 라이브러리 준비
ME220 집중 초음파코바리스500396초음파
나노드롭 원/OneC써모피셔ND-원-W전파장 UV 가시광광도 검출
NextSeq 550Dx일루미나20005715순서
NSQ 500/550 고출력 KT v2.5 (300CYS)일루미나20024908NextSeq 550Dx와 함께 사용하기 위해
핵산 추출 시약음악회RC1102DNA 추출에 사용
큐비트 3.0 형광도계생명Q33216핵산 또는 라이브러리 농도 검출에 사용됩니다
Qubit dsDNA HS 분석 키트생명Q32851the 와 함께 사용하기 위해; 큐비트 3.0 형광도계

참고문헌

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