Method Article

여러 소스에서 4종의 인수공통전염병 장내 기생충을 동시에 검출하기 위한 통합 PCR 기반 분자 검출 시스템

DOI:

10.3791/69180

⸱

October 28th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Public Health Molecular Biology, Yancheng Center for Disease Control and Prevention, 2Clinical Laboratory, Yancheng Maternal and Child Health Care Hospital Affiliated to Yangzhou University, 3Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기반 통합 분자 검출 시스템의 조합을 기반으로 여러 소스에서 동시에 4개의 인수공통 감염 장내 기생충을 검출하는 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

전염병은 인간의 건강, 경제 발전, 사회 안정에 영향을 미치는 중요한 요소입니다. 그 중 인수공통감염성 장내 기생충 질환은 특히 크립토스포리디움(Cryptosporidium), 비에 네우시장(Enterocytozoon bieneusi), 배반포자, 편모충(Giardia)과 같은 신흥 감염병으로 인해 점점 더 전 세계적인 관심사가 되고 있습니다. 위 기생충의 역학에 대한 연구는 소수에 불과했으며 단일 검출 대상, 낮은 검출률, 높은 누락 검출률과 같은 문제가 수반되었습니다. 본 연구는 야생 생쥐, 반려동물, 가축(소, 양)에서 채취한 샘플에서 위의 4가지 인수공통전염병 장내 기생충을 동시에 검출하기 위한 PCR 검사의 조합을 기반으로 한 통합 분자 검출 시스템을 구축하여 특히 지역 감시 시설에서 동물-환경 인터페이스를 포함한 여러 시나리오에서 일상적인 기생충 검출을 위한 효율적인 기술 지원을 제공하는 것을 목표로 합니다.

본 연구에서는 야생쥐 95마리와 고양이와 개 30마리(고양이 25마리, 개 5마리)의 대변에서 Enterocytozoon bieneusi 검출을 1차 시험으로 삼아 2세트의 프라이머를 사용하여 ITS 유전자를 증폭했을 때 각 PCR의 양성 결과는 정확히 동일(5.26%)이었으나, 2세트의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 검사를 조합하면 Enterocytozoon bieneusi 의 양성률(6.32%)이 더 높았습니다. Giardia의 경우 베타-지아르딘(BG) 유전자를 사용하여 9개의 양성 샘플이 검출되었고, 글루타메이트 탈수소효소(GDH) 및 트리오스 인산 이소머라제(TPI) 유전자를 사용하여 양성 샘플이 검출되지 않았습니다. 위의 결과는 여러 표적 유전자 세그먼트에 대한 PCR 검사의 조합이 단일 PCR 검사에 비해 지정된 병원체에 대한 검출 능력을 향상시켰음을 입증했습니다. 표적 서열은 Sanger 시퀀싱에 의해 확인되었습니다. 이 시스템은 여러 출처에서 인수공통 감염 장내 기생충의 감염 상태, 분포 및 계통 발생 진화에 대한 감시를 강화하고 촉진하도록 설계되어 초기 단계에서 정확하고 민감한 경고의 기초를 제공합니다. 이는 인간-동물-환경 인터페이스 전반에 걸쳐 One Health 목표를 달성하기 위한 기술적 다리를 구축하는 것을 목표로 합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis 및 Giardia는 전 세계적으로 유병률이 있는 흔하고 쉽게 무시되는 원생동물 병원체입니다. 최근 몇 년 동안 자연 초점의 생태학적 틈새에 대한 매립 및 침입, 반려동물 사육의 인기, 가축 및 가금류 사육의 발전 등의 요인으로 인해 설치류, 반려동물(고양이 및 개) 및 가축(소와 양)의 다중 원인 인수공통 감염 장내 기생충 질병의 유병률이 점점 더 등장의 초점이 되었습니다. 국내 및 농촌 지역에서 전염병이 발생하고 재발생하여 인간의 건강과 세계 공중 보건 안보를 심각하게 위협하고 있습니다 1,2,3,4.

이 기생충은 복잡한 속 내 종과 광범위한 숙주 적응성을 가지고 있습니다. 설치류, 반려동물, 가축 반추동물, 가금류, 조류뿐만 아니라 인수공통전염병 종에도 감염되어 인간을 감염시켜 복통, 설사, 구토 등의 임상 증상을 일으킬 수 있습니다. 그들은 특히 어린이, 노인, 임산부 및 면역 저하 인구 사이에서 취약하며 물, 음식 및 공기를 통해 전염될 수 있어 심각한 인수공통 공중 보건 위험을 초래합니다 3,5,6.

현재 위의 4가지 기생충의 식별은 주로 형태학에 의존하고 있으며, 이는 속 내 형태학적 유사성과 주관적 요인, 특히 종과 유전자형을 구별하는 데 있어 오인되기 쉽습니다. 분자 생물학 기술은 이러한 기생충의 종, 속 및 유전자형을 식별하는 데 널리 사용되었습니다. Blastocystis 및 Cryptosporidium의 경우 검출은 주로 작은 서브유닛 리보솜 리보핵산(SSU rRNA) 유전자 3,7,8에 초점을 맞춥니다. Enterocytozoon bieneusi의 경우 내부 전사 스페이서(ITS) 유전자 4,9; Giardia의 경우 베타-지아르딘(BG), 글루타메이트 탈수소효소(GDH) 및 트리오스 인산 이소머라제(TPI) 유전자10,11. 중첩된 기존 중합효소연쇄반응(PCR)은 이 네 가지 기생충의 식별 및 타이핑 능력을 크게 향상시켰지만, 누락된 사례를 감지하고 중요한 유전적 특성을 가진 새로운 종 또는 준종을 식별하는 데는 충분하지 않습니다. 이는 종종 인간, 동물 및 기타 숙주의 역학 조사, 전염 및 질병 통제의 효율성에 영향을 미쳐 인간, 동물 및 환경의 공중 보건 안보에 큰 어려움을 초래합니다.

이 네 가지 기생충의 증상, 전파 경로 및 숙주 범위의 유사성으로 인해 검출 누락을 방지하고 유전적 차이가 큰 새로운 종이나 준종을 정확하게 식별하면서 효율적인 검출을 위한 통합 분자 시스템은 아직 없습니다. 본 연구는 다중 소스 샘플(야생 생쥐, 반려동물, 소, 양)에서 4종의 인수공통전염병 장내 기생충을 동시에 검출하기 위해 문헌을 검토하여 PCR-고처리량 시퀀싱 기술을 기반으로 성숙한 통합 분자 검출 시스템을 구축했습니다. 생물정보학 분석과 결합된 이 시스템은 다중 소스 인수공통 감염 장내 기생충을 식별하고, 감염 분포 및 계통 발생 진화와 같은 역학적 요인을 모니터링하고, 인간 및 동물 감염 및 환경 오염에 대한 조기 경고에 적용되었습니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 장쑤성 질병통제예방센터의 동물윤리위원회의 승인을 받고 수행되었습니다. 본 연구는 2020년판 미국 수의학 협회 동물 안락사 지침, 실험동물 관리 규정(1988년 중화인민공화국 국가과학기술위원회 명령 제2호), 중화인민공화국 과학기술부가 발행한 동물의 인도적 대우를 위한 지도원칙.

1. 야생쥐, 반려동물, 가축(소, 양)의 신선한 배설물 준비

  1. 투명한 밀폐 플라스틱 상자에 담긴 통조림 압축 이산화탄소 공급원에서 이산화탄소를 흡입하여 마우스를 마취시키며, 분당 용기 부피의 30%-70%의 교체율로 사용합니다. 완전한 마취와 혼수 상태에 빠진 후 마우스에게 자궁경부 탈구를 시행합니다.
  2. 신선한 대변 샘플 수집: 배변 후 1시간 이내에 개, 고양이, 소, 양의 대변 샘플을 동물의 대변당 하나의 튜브로 수집하고 교차 오염을 방지합니다.
    1. 다양한 야생 서식지에서 방출 장치가 있는 미끼 케이지를 사용하여 설치류를 포획하십시오. 포획한 쥐를 쥐 가방에 넣고 즉시 실험실로 이송합니다. 생물안전 캐비닛에서 멸균 작동 하에 마우스를 해부하여 대변이 포함된 직장을 수집하고 2mL 냉동 튜브에 넣고 나중에 검출할 수 있도록 -80°C에서 보관합니다.
    2. 다양한 지역의 애완동물 가게에서 개와 고양이를 연구 대상으로 선택합니다. 새로 배설된 대변을 즉시 5mL 냉동관에 모아 완전한 샘플 정보가 표시된 다음 즉시 실험실로 운반하여 -80°C에서 보관합니다.
    3. 축산농장(집약적 또는 방목)의 소와 양을 연구 대상으로 선정합니다. 새로 배설된 대변을 즉시 50mL 냉동관에 모아 완전한 샘플 정보가 표시된 다음 즉시 실험실로 운반하여 -80°C에서 보관합니다.

2. 야생쥐, 반려동물, 가축(소, 양)의 신선한 배설물에서 총 DNA 추출

  1. 대변 전처리:
    참고: QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit를 사용했습니다.
    1. 생물 안전 캐비닛에서 멸균 작동 중인 경우 다양한 출처의 대변 약 200mg을 인산염 완충 식염수(PBS) 완충액에 넣고 강철 구슬을 추가한 다음 조직 분쇄기를 사용하여 완전히 균질화합니다.
    2. 이것을 70°C에서 5분 동안 가열하고 실온(15-25°C)에서 10 분 동안 10,000×g에서 원심분리합니다.
    3. 25μL의 프로테이나제 K가 들어 있는 2mL 원심분리기 튜브에 600μL의 상청액을 첨가하고 600μL의 Buffer AL을 첨가한 다음 15초 동안 소용돌이치게 합니다.
    4. 70°C에서 10분 동안 배양합니다. 600μL의 100% 무수 에탄올을 용해물에 첨가하고 소용돌이치게 하여 혼합합니다.
  2. 600μL의 용해물을 스핀 컬럼에 조심스럽게 첨가하고 14000 × g 에서 1분 동안 원심분리한 다음 스핀 컬럼을 새로운 2mL 수집 튜브에 넣습니다. 이 단계를 한 번 더 반복합니다.
  3. 스핀 컬럼을 조심스럽게 열고 500μL의 버퍼 AW1을 첨가하고 최대 속도로 1분 동안 원심분리한 다음 스핀 컬럼을 새 2mL 수집 튜브에 넣습니다. 스핀 컬럼을 조심스럽게 열고 500μL의 버퍼 AW2를 첨가한 다음 최대 속도로 3분 동안 원심분리합니다.
  4. 스핀 컬럼을 새 2mL 수집 튜브(별도로 준비)에 넣고 14000 × g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 스핀 컬럼을 새로 표지된 1.5mL 원심분리기 튜브에 넣고 100μL의 용출 완충액을 스핀 컬럼 멤브레인에 직접 추가합니다.
  5. 실온(15-25°C)에서 1분 동안 배양하고 14000× g 에서 1분 동안 원심분리하여 DNA를 용리합니다.
  6. 초미세 분광 광도계를 사용하여 DNA의 농도와 순도를 결정합니다. 추출된 DNA를 후속 검출에 사용하거나 장기 보존을 위해 -20°C에 보관하십시오.
    참고: 추출된 DNA의 무결성과 순도를 보장하기 위해 A260/A280 비율은 1.8-2.0이어야 합니다.

3. 작은 서브유닛 리보솜 RNA(SSU rRNA)를 표적으로 하는 Cryptosporidium 및 Blastocystis의 중첩된 기존 PCR 검출

참고: 이 단계에는 Dream Taq Green PCR Mix가 사용되었습니다.

  1. PCR 믹스를 사용하여 얼음 위에서 PCR 반응 시스템을 준비합니다: 2× Taq 완충액 25μL, 정방향 및 역방향 프라이머 각 2μL,ddH2O 16μL, 템플릿 5μL, 총 부피 50μL.
  2. 크립토스포리디움의 경우 3.2.1-3.2.2단계를 따릅니다.
    1. F1R11 및 F-1R1-1 8,11을 1차 반응 프라이머로 사용합니다. 반응 프로그램을 설정합니다: 94°C에서 5분 동안 초기 변성, 94°C에서 40초 동안 30회 변성, 55°C에서 40초 동안 어닐링, 72°C에서 90초 동안 확장, 72°C에서 7분 동안 최종 신장.
    2. F2R21 및 F-1R2-1 8,11을 2라운드 프라이머로 사용하고, 반응 프로그램: 94°C에서 5분 동안 초기 변성, 94°C에서 40초 동안 30회 변성, 55°C에서 40초 동안 어닐링, 72°C에서 1분 동안 확장, 72°C에서 7분 동안 최종 신장.
  3. Blastocystis의 경우 3.3.1-3.3.4단계를 따릅니다.
    1. F1R13 및 F1-1R-1 3,12를 1차 반응 프라이머로 사용합니다. F1R1에 대한 반응 프로그램을 다음과 같이 설정합니다: 94°C에서 5분 동안 초기 변성, 94°C에서 40초 동안 30회 변성 사이클, 60°C에서 40초 동안 어닐링, 72°C에서 100초 동안 신장, 72°C에서 7분 동안 최종 신장.
    2. F1-1R-1의 반응 프로그램을 다음과 같이 설정합니다: 94°C에서 5분 동안 초기 변성, 94°C에서 40초 동안 30회 변성, 55°C에서 40초 동안 어닐링, 72°C에서 1분 동안 확장, 72°C에서 7분 동안 최종 신장.
    3. F2R23 및 F2-1R-1 3,12를 2라운드 프라이머로 사용하십시오. F2R2의 반응 프로그램을 다음과 같이 설정합니다: 94°C에서 5분 동안 초기 변성, 94°C에서 40초 동안 30주기 변성, 60°C에서 40초 동안 어닐링, 72°C에서 1분 동안 신장, 72°C에서 7분 동안 최종 신장.
    4. F2-1R-1에 대한 반응 프로그램을 다음과 같이 설정합니다: 94°C에서 5분 동안 초기 변성, 94°C에서 40초 동안 30회 변성, 55°C에서 40초 동안 어닐링, 72°C에서 50초 동안 확장, 72°C에서 7분 동안 최종 신장.
      참고: 프라이머 서열은 표 1 1,3,8,11,12에 나와 있습니다.
병원체예상 제품 크기(bp)프라이머 서열(5'-3')참조
크립토스포리디움830F1: CCATTTCCTTCGAAACAGGA1
R1: TTCTAGAGCTAATACATGCG
F2: AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA
R2: GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG
607F-1: 가카타캣트카아gtttct가acc8,11
R1-1: CTGAAGGAGTAAGGAACAACC
R2-1: TCTAAGAATTTCACCTCTGACTG
블라스토시스티스600F1: GGGATCCTGATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC3
R1: GGAAGC TTATCTGGTTGATCCTGCCAGTA
F2: ATCTGGTTGATCCTGCCAGT
R2: GAGCTTTTTAACTGCAACAGG
460F1-1: TGCTTTCGCACTTGTTCATC3,12
F2-1: GATTTATTGTCACTACCTCC
R-1: ATCTGGTTGATCCTGCCAGT

표 1: Cryptosporidium 및 Blastocystis의 SSU rRNA에 대한 프라이머 서열.

4. Enterocytozoon bieneusi ITS 유전자 및 Giardia BG, GDH 및 TPI 유전자의 중첩된 기존 PCR 검출

참고: 이 단계에는 Dream Taq Green PCR Mix가 사용되었습니다.

  1. PCR 혼합물을 사용하여 얼음 위에서 PCR 반응 시스템을 준비합니다: 2× Taq 완충액 25μL, 정방향 및 역방향 프라이머 각각 2μL, ddH2O 16μL, 주형5μL, 총 부피 50μL.
  2. Enterocytozoon bieneusi의 경우 4.2.1-4.2.2단계를 따릅니다.
    1. F1R19 및 F1-1R1-12 를 1차 반응 프라이머로 사용합니다. 반응 프로그램을 다음과 같이 설정합니다: 94°C에서 5분 동안 초기 변성, 94°C에서 40초 동안 30회 변성, 55°C에서 40초 동안 어닐링, 72°C에서 50초 동안 확장, 72°C에서 7분 동안 최종 신장.
    2. F2R29 및 F2-1R2-12 를 2라운드 프라이머로 사용하고, 반응 프로그램은 다음과 같습니다: 94°C에서 5분 동안 초기 변성, 94°C에서 40초 동안 30회 변성, 55°C에서 40초 동안 어닐링, 72°C에서 50초 동안 신장, 72°C에서 7분 동안 최종 신율.
  3. Giardia의 경우 4.3.1-4.3.3단계를 따릅니다.
    1. BG-F1R1, GDH-F1R1 및 TPI-F1R1 2,10을 세 가지 표적 유전자에 대한 1차 반응 프라이머로 사용합니다. 모든 것에 대한 첫 번째 반응 프로그램을 다음과 같이 설정합니다: 94°C에서 5분 동안 초기 변성, 94°C에서 40초 동안 30회 변성, 50°C에서 40초 동안 어닐링, 72°C에서 1분 동안 확장, 72°C에서 7분 동안 최종 신장.
    2. BG-F2R2 2,10 및 TPI-F2R2 2,10에 대한 2차 반응 프로그램을 다음과 같이 설정합니다: 94°C에서 5분 동안 초기 변성, 94°C에서 40초 동안 30회 변성, 55°C에서 40초 동안 어닐링, 72°C에서 50초 동안 확장, 72°C에서 7분 동안 최종 신장.
    3. GDH-F2R2 2,10의 2차 반응 프로그램을 다음과 같이 설정합니다: 94°C에서 5분 동안 초기 변성, 94°C에서 40초 동안 30회 변성 사이클, 60°C에서 40초 동안 어닐링, 72°C에서 50초 동안 확장, 72°C에서 7분 동안 최종 신장.
      참고: 프라이머 서열은 표 2 2,9,10에 나와 있습니다.
병원체예상 제품 크기(bp)프라이머 서열(5'-3')참조
장세포 비에네우시390F1: GGTCATAGGGATGAAGAG9
R1: TTCGAGTTCTTTCGCGCTC
F2: GCTCTGAATATCTATGGCT
R2: ATCGCCGACGGATCCAAGTG
390F1-1: GATGGTCATAGGGATGAAGAGCTT2
R1-1: TATGCTTAAGTCCAGGGAG
F2-1: AGGGATGAAGAGCTTCGGCTG
R2-1: AGTGATCCTGTATTAGGGATT
편모충511BG-F1: AAGCCCGACGACCTCACCCGCAGTGC2,10
BG-R1: GAGGCCGCCCTGGATCTTCGAGACGAC
BG-F2: GAACGAACGAGATCGAGGTCCG
BG-R2: CTCGACGAGCTTCGTGTT
530GDH-F1: TTCCGTRTYCAGTACAACTC2,10
GDH-R1: ACCTCGTTCTGRGTGGCGCA
GDH-F2: ATGACYGAGCTYCAGAGGCACGT
GDH-R2: GTGGCGCARGGCATGATGCA
530TPI-F1: AAATIATGCCTGCTCGTCG2,10
TPI-R1: CAAACCTTITCCGCAAACC
TPI-F2: CCCTTCATCGGIGGTAACTT
TPI-R2: GTGGCCACCACICCCGTGCC

표 2: Enterocytozoon bieneusi ITS 유전자 및 Giardia BG, GDH 및 TPI 유전자에 대한 프라이머 서열.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

마우스 크립토스포리디움, 블라스토시스티스 SSU rRNA 유전자, Enterocytozoon bieneusi ITS 유전자, Giardia BG 유전자 PCR 검사 결과
마우스의 직장 대변 샘플 95개 모두 2세트의 프라이머를 사용하여 Enterocytozoon bieneusi의 ITS 유전자에 대해 테스트한 결과 각 방법에 대해 5개의 양성 샘플이 나타났고 총 6개의 양성 샘플이 나왔습니다. 그림 1에서 레인 1-6 및 7-12는 각각 하나의 프라이머 세트를 사용하여 2개의 서로 다른 PCR의 PCR 산물을 로드했습니다....

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis 및 Giardia는 일반적인 인수공통 감염 장내 기생충입니다. 처음 두 마리는 미국 국립보건원(NIH)에 의해 카테고리 B 생물학적 병원체로 분류되었으며, 네 마리 모두 세계보건기구(WHO)에 의해 전 세계적으로 가장 중요한 식중독 24종으로 등재되었습니다. 잠재적으로 인간, 동물을 감염시키고 환경을 오염시켜 질병 발생을 일으키고 공중 보건 안보에 심각한 영향을 미칠 수 있습니다13. 현재 감염성 기생충의 식별은 주로 기술자가 수행하는 형태 분석에 의존하고 있으며 이는 주관적이고 느리며 효율성이 낮습니다. 따라서 다중 소스 샘플에서 4개의 인수공통 감염 장내 기생충 및 기타 기생충을 동시에 검출하기 위한 PCR 고처리량 시퀀싱 기술을 기반으로 효율적인 통합 분자 검출...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 장쑤성 보건위원회(보조금 번호. Ym2023024), Yancheng 시립 의학 연구 프로젝트(보조금 번호. YK2023085), 신흥 및 재출현 전염병에 대한 병원성 미생물학 핵심 연구소(장쑤성 질병통제예방센터)의 공개 기금(PM202402).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
아가로스 칭커 테크TSJ001
Qiaquick 젤 추출 키트키아겐 28704DNA 겔 추출 키트
100 bp 플러스 DNA 사다리TransGen  생명 공학BM311DNA 사다리
4S 그린 플러스 핵산 염색BBIA616696-0500DNA 염색
10번과 10번; TBE 버퍼솔라비오T1051전기영동 완충
큐비트 4.0열https://www.thermofisher.com/in/en/home<브르/> /산업/분광학-원소< > -동위원소 분석/분자 분광학/
fluorometers/qubit/models/qubit-4.html?
ef_id=:G:s& s_kwcid=AL!3652!10!77515
785702067!!!! 77516061528018!! 380468
453!1240249321530142& cid=bid_pca_
aqb_r01_co_cp1359_pjt0000_bid
00000_0se_bng_bt_pur_con		형광 정량 기기
미니 스페이스 1000타논http://en.biotanon.com/PRODUCT/<브레르/> PRODUCTLIST?ID=3040&
유형=상세		젤 이미저
그리고 nbsp; DNA 추출용 빠른 DNA 변 미니 키트치아겐51604핵산 추출 키트
프로플렉스 베이스열https://www.thermofisher.com/<브레> in/en/home/life-science/PCR/
Thermal-Cyclers-Realtime-
기기/Thermal Cyclers
/proflex-pcr-system.html		PCR
드림 탁 그린 PCR 믹스열K1082PCR 증폭  

References

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