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방법 논문

하체 허혈 치료를 위한 경골 피질 횡수송의 쥐 모델

1.1K 조회수

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DOI:

10.3791/69181

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2026년 3월 6일

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1Department of Orthopaedic Surgery, Guangxi Diabetic Foot Salvage Engineering Research Center, The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, 2Department of Orthopaedic Surgery, Guangxi Key Laboratory of Regenerative Medicine, The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, 3Collaborative Innovation Centre of Regenerative Medicine and Medical Bio-Resource Development and Application Co-constructed by the Province and Ministry, Guangxi Medical University, 4Department of Plastic and Reconstructive Surgery, The People's Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 절차는 쥐에서 경골 피질 횡수송을 입증하여 사지 허혈 중 재혈관화 과정을 시각화하고 분석할 수 있게 합니다.

초록

경골 피질 횡수송(TTT)은 허혈성 하지의 혈관 재생을 촉진하기 위해 사용되는 신흥 외과 기법입니다. 이 영상은 TTT의 재현 가능한 쥐 모델을 시연하며, 피질 골 조각의 외과적 생성, 운송 프로토콜, 그리고 수술 후 평가를 상세히 설명합니다. 이 절차는 골 조각을 위아래로 제어하여 혈관 신생 반응을 자극할 수 있게 합니다. 수술 후 1일, 7일, 12일에 촬영된 대표적인 엑스레이 이미지와 안락사 후 19일째에 시행한 미세혈관 관류 영상에서는 TTT 후 명확한 골조각 이동과 사지 관류 개선이 확인되었습니다.

이 모델은 TTT 유도 혈관신생의 분자 기전을 조사하고 허혈성 질환에 대한 잠재적 치료 전략을 평가할 수 있는 실용적이고 재현 가능한 플랫폼을 제공합니다. 이 모델을 구축하기 위해 우리는 Sprague-Dawley 쥐에서 임상 TTT 절차를 시뮬레이션했으며, 주요 세 가지 수술 단계가 포함되었습니다: 표재 대퇴동맥 결찰, 피질 골 조각의 생성 및 동원, 맞춤형 외고정기 적용. 12일에 걸쳐 이 조각은 점차 앞뒤로 이동했다. 관류 영상 검사에서 수송 주기 완료 후 허혈성 사지의 혈관 형성이 강화된 것으로 확인되었습니다. 전반적으로 이 표준화된 쥐 모델은 임상 TTT 절차를 매우 유사하게 모방하며, 허혈성 사지 상태에서 기계전달, 혈관신생, 혈관 재생을 연구하는 데 유용한 실험 시스템을 제공합니다.

서론

동맥경화증(ASO), 혈전혈관염(TAO), 당뇨병성 족발(DF)과 같은 하지 허혈성 질환은 하체로의 동맥 혈류가 제한되는 것이 특징입니다 1,2. 초기 단계에서는 환자들이 간헐적 파행과 휴식 시 통증을 경험하는 경우가 많습니다. 질병이 진행됨에 따라 장기적인 허혈은 조직 괴사, 감염, 심한 경우 사지 절단으로 이어질 수있습니다. 현재 표준 치료법—약물 치료, 혈관내 개입, 개복 수술 절차 등—은 특히 질병의 말기 단계에서 제한적인 효능을 보이는 경우가 많습니다.

경골 피질 횡수송(TTT)은 다양한 하체 허혈성 질환 치료를 위한 혁신적인 치료 전략입니다. 일리자로프 방법과 '장력-스트레스 법칙'5,6에 뿌리를 둔 이 기법은 골절개술을 통해 경골에 이동성 피질 피판 조각을 만드는 것을 포함합니다. 그 후 연속적이고 느리며 통제된 주의 분산 힘을 가해 뼈, 혈관 및 주변 연조직의 재생을 자극합니다. 이 재생 과정은 미세순환 재정립을 촉진하고 영향을 받은 사지의 산소 공급 균형을 회복하는 데 도움을 줍니다. 궁극적으로 TTT는 허혈 조직에서 혈액 관류와 기능 회복을 개선합니다7.

하체 허혈에 대한 기존의 혈관 재건 기법은 종아리 큰 동맥의 혈류를 회복시킬 수 있지만, 발의 작은 동맥 재혈관화나 손상된 미세혈관의 수리 및 재생을 촉진하는 데는 효과적이지 않아 허혈 8을 완전히 해결하는 데 제한적입니다. TTT는 뼈와 주변 연조직에 지속적으로 견인을 가하여 화학작용 인자와 사이토카인의 강력한 분비를 유도합니다. 이러한 화학작용 인자들은 줄기세포의 다양한 기능을 조절하며, 허혈 상태에서는 순환계에 풍부하게 분비됩니다. 이들은 손상 부위에 내인성 줄기세포를 적극적으로 모집하여 직접 줄기세포 이식 없이도 혈관 회복과 재생을 촉진합니다. 이러한 이점 덕분에 TTT는 하체 허혈에 대한 유망한 치료 전략으로 부상했으며, 하체에 영향을 미치는 다양한 허혈성 질환 치료에 점점 더 많이 활용되고 있습니다 7,9,10.

토끼와 개는 기초 TTT 연구에 흔히 사용되지만, 이 종에 적합한 분석 도구가 부족해 기전적 연구가 제한됩니다. 반면, 쥐 TTT 모델은 실용성과 낮은 비용을 유지하면서도 분자 및 영상 기법과의 호환성이 더 높아, 기전 연구에 더 접근하기 쉽고 재현 가능한 플랫폼이 됩니다. 그러나 현재까지 하체 허혈 쥐 모델에서 TTT의 효능을 체계적으로 기술하거나 평가한 연구는 없습니다.

쥐 TTT 모델은 경골 크기가 작고 피질이 얇기 때문에 정교한 미세수술 기술이 필요하며, 주의 분산 범위는 피질 두께에 의해 제한됩니다. 이러한 실용적 제약은 모델이 특정 연구 환경에 적합한지 평가할 때 고려해야 합니다.

본 연구에서는 임상 경골 횡수송 장치의 핵심 구조와 작동 원리를 복제하여 쥐 특이적 TTT 모델을 개발하였습니다. 이 절차는 임상적으로 검증된 프로토콜을 기반으로 개선되어 소동물에서의 실현 가능성과 일관성을 보장했습니다. 우리의 목표는 허혈성 사지 질환에서 혈관신생 및 기계전도(mechanotransduction) 연구에 적합한 표준화되고 재현 가능한 쥐 TTT 모델을 확립하고 검증하는 것입니다.

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프로토콜

모든 동물 실험은 광시 의과대학 제1부속병원 동물윤리위원회(승인번호 2025-E0642)의 승인을 받았습니다. 수컷 스프래그-도울리 쥐(300-350g)는 광시 의과대학 동물연구센터에서 표준화된 조건 하에 보관되었습니다. 쥐들은 자유롭게 정상적인 식사와 깨끗한 식수를 제공받았으며, 12시간의 인공 조명/암 주기로 유지되었습니다. 동물 시설은 20-26°C의 통제된 온도와 40%-70%의 상대습도로 유지되었습니다. 모든 수술 기구는 사용 전에 철저히 멸균되었습니다. 본 연구에 사용된 모든 시약 및 재료에 대한 자세한 정보는 표 1에 제공되어 있습니다.

안락사는 펜토바르비탈나트륨 과다복용을 복막 내 주사로 시행했습니다. 심장 박동과 호흡의 영구 정지, 동공 확장, 유해 자극에 대한 반응 부재로 사망이 확인되었다. 모든 절차는 동물의 고통을 최소화하기 위해 훈련된 인력이 수행했으며, 안락사 프로토콜은 기관 동물 돌봄 및 사용 위원회에서 사전에 검토 및 승인되었습니다.

1. TTT용 외고정기

  1. 임상적 경골 피질 횡방향 수송 외부 고정기(TTT-EF)의 축소되고 맞춤형 버전을 사용하세요. 이 장치는 골조각 견인 장치와 외고정 프레임으로 구성되어 있습니다.
  2. 내부 나사산 메커니즘을 통합하여 두 부품의 수직 동원을 가능하게 합니다(그림 1).
  3. 견인 장치와 고정 프레임의 단면에 각각 두 개의 관통 구멍을 뚫어 Kirschner 와이어를 삽입할 수 있게 합니다.
  4. 키르슈너 와이어를 지정된 구멍에 삽입하고, 안정화를 위해 육각형 나사로 측면으로 고정하세요.
  5. TTT-EF의 견인 부품을 0.8mm 커슈너 와이어를 사용해 뼈 조각에 연결합니다.
  6. 1.0mm 키르슈너 와이어를 사용해 경골의 근위부와 원위 부위에 고정하세요.

2. 수술 절차

  1. 8주 된 수컷 스프래그-도울리(SD) 쥐에게 TTT 절차를 시행하세요. 쥐에게 0.35 mg/kg의 펜토바르비탈나트륨과 0.3 mg/kg 클로랄 하이드레이트를 복강내 주사하여 마취합니다.
  2. 페달 철수 반사와 각막 반사를 검사하여 마취 효과를 평가합니다. 시술 내내 활력 징후와 마취 깊이를 지속적으로 모니터링하세요. 수술 전에 쥐의 눈에 안과 연고를 바르어 각막을 보호하며, 실험동물 사용 지침에 따라 해야 합니다.
  3. 수술 부위를 면도하고 0.5% 리도카인을 투여하여 수술 후 통증을 최소화하세요.
  4. No. 11 메스로 오른쪽 서혜부 부위에 10mm 피부 절개를 하세요.
  5. 근막을 무딘 박리하여 얕은 대퇴동맥을 노출시켜.
  6. 대퇴신경과 얕은 대퇴정맥 사이의 동맥을 안과 겸자를 사용해 격리합니다. 동맥 양 끝을 결찰하고 횡단하세요.
  7. 절개 부위는 4-0 흡수성 봉합사로 봉합하세요.
  8. No. 11 메스를 사용해 내측 상경골에 수직 15mm 절개를 하세요.
  9. 피하 조직과 그 아래 근육을 조심스럽게 분리하여 골막 손상을 피하세요. 부드럽게 연조직을 해리하여 내측 경골 표면을 완전히 노출시키세요.
  10. 수술 칼날을 사용해 내측 경골면의 골 조각 면적(8 mm × 4 mm)을 윤곽 표시합니다. 0.6mm 드릴 비트를 사용해 표시된 경계를 따라 촘촘히 천공을 시추합니다. 상부 내측 경골에 뼈 창 조각(8mm × 4mm)을 만듭니다.
  11. 0.8mm 간격으로 0.8mm 간격으로 나사산 키르슈너 와이어 두 개를 뼈 조각에 이식하여 운반을 용이하게 합니다. Kirschner 선을 TTT-EF에 연결하고 고정하세요.
  12. 조각 양쪽에 1.0mm 키르슈너 와이어 두 개를 삽입하여 경골 후피질을 관통합니다.
  13. TTT-EF를 조립하고 설치하세요.
  14. 표시된 선을 따라 안과 가위를 사용해 골절개술을 시행하세요.
  15. 골수 손상을 피하기 위해 뼈 조각을 부드럽게 들어 수직 이동을 가능하게 합니다.
  16. 수술 부위를 10% 포비돈-요오딘으로 세척한 후 멸균 식염수를 사용하세요.
  17. 절개 부위를 4-0 흡수성 봉합사로 층으로 봉합하세요.
  18. 수술 직후 부프레노르핀(0.05 mg/kg)을 피하 투여하세요. 효과적인 진통을 위해 최대 3일간 12시간마다 투여를 계속하세요.

3. 수술 후 모니터링

  1. 수술 후 동물을 면밀히 관찰하여 적절한 회복을 보장하고 잠재적인 합병증을 조기에 발견하세요. 수술 후 처음 48시간 동안 6-8시간마다 동물을 검사하세요. 일반적인 활동, 자세, 단장 행동, 음식과 물 섭취, 수술 절개 상태를 평가합니다.
  2. 수술 후 3일째부터 산만화 및 통합 단계까지 최소 하루 한 번씩 모니터링을 수행하세요. 정상적인 보행, 안정적인 체중, 일정한 음식과 물 섭취, 상처 분비물, 과도한 부기, 행동적 통증 징후가 없음을 확인하여 적절한 회복을 확인하세요.
  3. 기관 지침에 따라 필요 시 진통제를 계속하십시오.
  4. 상처 감염(예: 홍반, 부기, 고름성 분비물)은 수의의 권고에 따라 국소 상처 관리와 전신 항생제로 치료합니다.
  5. 짧은 마취 하에 외고정기의 느슨함이나 이동을 즉시 교정하여 정렬을 유지하고 정확한 주의를 분산시킬 수 있도록 하세요.
  6. 잠재적인 합병증이 있다면 신속히 평가하고 관리하세요. 수의사와 상담하여 이동성, 먹이 섭취, 상처 치유에 심각한 합병증을 가진 동물을 평가하세요.
  7. 사전에 정해진 인도적 평가 기준을 충족하는 동물은 인도적으로 안락사하세요.

4. 골 조각 수송 프로토콜

  1. 경골 피질 횡이식 외부 고정기(TTT-EF)를 사용하여 수술 후 골 조각 이동을 수행합니다.
  2. 수술 후 1일째를 잠복 기간으로 지정하세요.
    참고: 이 기간 동안 뼈 조각을 조작하지 마십시오.
  3. 2일째에 상향 수송 단계를 시작하세요. 2일차부터 6일차까지 5일 연속으로 12시간마다 0.5mm 간격으로 골 조각을 전진시킵니다. 7일째에는 안정화를 위해 이송 과정을 일시정지하세요.
  4. 8일째에 하강 수송 단계를 시작하세요.
  5. 뼈 조각을 12시간마다 0.5mm의 같은 속도로 5일간 빼내세요(8일차부터 12일차까지). 12일째가 끝날 때까지 뼈 조각이 원래 위치로 돌아오도록 하세요.
  6. 2일간의 통합 단계(13-14일차)를 진행하며 추가 운송은 없습니다.
  7. 고정 단계가 끝날 때 외고정기를 제거하세요.
    참고: TTT 운송 절차와 평가 일정의 시각적 타임라인은 그림 2 를 참조하십시오.

5. 평가

참고: 영상 기법을 사용하여 골 조각 위치와 혈류 회복을 모두 평가하세요.

  1. 1일, 7일, 12일차에 하체 X선 영상을 촬영하여 운반된 뼈 조각의 진행 상황과 최종 위치를 모니터링합니다.
    1. 지정된 영상 시점에 산소 내 2.0% 이소플루란을 사용해 쥐를 마취합니다.
    2. 각 쥐를 온도 조절 영상 플랫폼에 올려 저체온증을 예방합니다.
    3. 호흡 수와 발 반사를 평가하여 마취 깊이를 모니터링하여 안정적인 고정을 보장합니다.
    4. 모든 동물의 사지와 외고정기를 표준화된 방향으로 배치하여 X선 획득의 변동성을 최소화합니다.
    5. 골 조각 이동과 재배치를 확인하기 위해 엑스레이 이미지를 확보하세요.
  2. 수술 후 19일째에 하지의 미세혈관 관류 상태를 평가하기 위해 혈관 관류 영상을 실시합니다.
    1. 쥐를 안락사시키고 대퇴동맥을 통해 조영제를 주입하여 혈관을 시각화합니다.
    2. 안락사된 쥐를 표준화된 누운 자세로 눕혀 일관된 영상 촬영을 하세요.
    3. 상온에서 대퇴동맥을 통해 조영제를 관류하여 완전한 혈관 충전을 가능하게 합니다.
    4. 미세혈관 구조와 관류 상태를 평가하기 위해 혈관 영상을 실시합니다. 모든 표본이 동일한 사지 방향과 고정기 정렬을 유지하도록 하여 영상 촬영 전반에 걸쳐 재현성을 지원하도록 하세요.
    5. 결과된 이미지를 사용해 하지의 혈류와 혈관 구조 회복을 평가합니다.

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결과

그림 3은 TTT 처리된 하지 허혈 동물 모델 구축 절차를 보여줍니다. 저희 손에서 이 수술은 약 90%의 수술 성공률을 보였습니다. 실패 횟수가 제한적이었던 것은 주로 외고정기 완화나 수술 중 골편 골절과 같은 기술적 문제 때문이었으며, 이로 인해 이후 주의를 분산시키는 것이 불가능했습니다. 이 모델은 표면 대퇴동맥을 노출하고 결찰하여 허혈을 유도함으로써 확립되었습니다(그림 3A). 이후 경골 내측에 4mm × 8mm 뼈 조각을 피부와 근육을 절개하여 뼈를 노출시켰습니다(그림 3B). 뼈 조각의 지정된 부위는 경골에 표시되었고, 이어서 이 표시를 바탕으로 드릴링과 골절개술이 진행되었습니다(그림 3C,D). 골절개 후에는 고정 핀...

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토론

마취와 수술이 포함된 모든 시술은 동물 안전과 기관 동물 관리 지침을 세심히 준수하여 수행되었습니다. 마취 깊이는 절개 전에 발 철수 검사나 각막 반사 검사를 통해 확인되었으며, 시술 내내 정기적으로 모니터링되었습니다. 저체온증을 예방하기 위해 충분한 열 지지대(예: 온열 패드)가 제공되었고, 장시간 마취 시 각막을 보호하기 위해 안과 연고가 발라졌습니다.

마취와 관련된 잠재적 위험으로는 호흡 억제, 저체온증, 회복 지연, 우발적 과다복용 등이 포함되었습니다. 따라서 지속적인 관찰이 필수적이었고, 보충 산소를 포함한 소생 장비도 쉽게 준비되어 있었다.

수술 위험은 주로 출혈, 연조직 손상, 수술 부위 오염, 골수 또는 신경혈관 구조의 병원성 손상을 포함했습니다. 이러한 위험을 최소화하기 위해 운영자들은 엄격한 무균 기법을 사용하고, 조직을 온화하게 다루며, 뼈 창을 정밀...

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공개 사항

저자들은 서로 상반되는 이해관계를 선언할 필요가 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
마이크로 횡방향 견인기톈진 신중 의료기기 유한회사A61B17/66골 조각 견인 시술
소형 정형외과 드릴옌청 루이아오 테크놀로지 유한회사RA-II경골 드릴 골절개술을 위해
0.6mm 스테인리스 스틸 드릴 비트창저우 보르슈 의료기기 유한회사-경골 드릴 골절개술을 위해
0.8mm 나사산 키르슈너 와이어창저우 보르슈 의료기기 유한회사-뼈 판과 견인기 부착을 위해
1.0 mm 나사산 키르슈너 와이어창저우 보르슈 의료기기 유한회사-견인기 고정을 위해
펜토바르비탈 나트륨상하이 제약 홀딩 유한회사-동물 마취를 위해
육각키창저우 보르슈 의료기기 유한회사-나사 고정을 위해
부프레노르핀상하이 제약 홀딩 유한회사진통 동물을 위해
마이크로필플로우 테크, Inc 주식회사동물 혈관조영
이소플루란허베이이핀제약유한회사.흡입 마취의 유도 및 유지
리도카인 하이드로클로라이드 (0.5%)허베이이핀제약유한회사.수술 후 통증을 줄이고 조직 자극을 최소화하기 위해 국소 침윤에 사용됨

참고문헌

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  3. Aboyans, V., Chastaingt, L. What LEADs to the under-treatment of patients with lower-extremity artery disease. Eur J Prev Cardiol. 30 (11), 1090-1091 (2023).
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  5. Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues: part II. The influence of the rate and frequency of distraction. Clin Orthop Relat Res. 239, 263-285 (1989).
  6. Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues: part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation. Clin Orthop Relat Res. 238, 249-281 (1989).
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  14. Zhen, P., et al. Finite element analysis of biomechanical effects in rat tibia during tibial cortex transverse transport. Front Bioeng Biotechnol. 13, 1670040(2025).

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