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방법 논문

쥐 모델에서 심부 경추 림프정맥 문합을 위한 수술 프로토콜: 림프절 및 림프관 문합

1.4K 조회수

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DOI:

10.3791/69201

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2025년 11월 14일

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1Department of Neurosurgery, The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, 2Institute of Medical Technology, Peking University Health Science Center, 3Department of MR Diagnosis, The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, 4Department of Neurology, The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, 5Department of Clinical Nutrition, Harbin 242 Hospital

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서는 다른 변수의 영향을 최소화하고 수술 기반 연구 수행을 표준화하기 위해 쥐의 심부 경부 림프절 또는 구심성 림프관을 안면 후방 정맥과 문합하는 단계를 명확하게 정의하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

심부 경추 림프정맥 문합(dcLVA)은 알츠하이머병(AD)에 대한 유망한 치료 전략이 되었으며, 현재 제한된 치료 옵션에 비해 상당한 개선을 제공합니다. 그러나 dcLVA의 기본 메커니즘은 불분명합니다. 임상 시험이 진행 중이지만 dcLVA를 시뮬레이션하는 동물 모델은 그 메커니즘을 탐구하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 이 연구는 기초 연구를 촉진하고 임상 문제를 해결하기 위해 동물에서 dcLVA 모델을 생성하기 위한 표준화된 프로토콜을 개발하는 것을 목표로 합니다. 심부 경부 림프절(dcLN)과 구심성 림프관(ALV)을 후안면 정맥(PFV)과 문합하기 위한 수술 절차 및 주요 단계를 설명하고 심부 경부 림프절-정맥 문합(dcLnVA) 및 심부 경부 림프관-정맥 문합(dcLaVA). 림프 배수를 촉진하는 것 외에도 이 두 가지 수술 방법의 비교는 알츠하이머병의 병인에서 심부 경부 림프절과 심부 경추 림프계의 역할을 이해하고 탐구하는 데 도움이 됩니다. 전반적으로 쥐의 수술 절차와 주요 해부학적 랜드마크의 완전하고 명확한 표현은 수술 프로토콜을 표준화하는 데 도움이 됩니다. 교란 요인을 최소화하고 실험 간 가변성을 줄여 관련된 메커니즘에 대한 더 깊은 이해를 위한 견고한 방법론적 기반을 마련할 수 있습니다.

서론

알츠하이머병(AD)은 점진적으로 진행되는 신경퇴행성 장애로 종종 인지 저하를 초래합니다. 알츠하이머병의 독특한 병리학적 특징은 비정상적으로 인산화된 타우 단백질에 의해 형성되는 아밀로이드-베타(Aβ) 플라크와 신경원섬유 엉킴입니다. 뇌 림프계에 대한 최근 연구는 알츠하이머병 치료를 위한 새로운 치료 방법을 열었습니다. 이 시스템은 간질액(ISF)에서 뇌척수액(CSF)으로, 이어서 수막 림프관(mLV)을 통해 심부 경부 림프절로 Aβ의 배수를 용이하게 합니다1. 2024년 시 교수 팀은 심부 경추 림프정맥 문합(dcLVA) 후 알츠하이머병 환자의 인지 개선 사례를 처음으로 보고한 후 임상 시험(NCT06530732)을 시작했습니다2.

알츠하이머병에 대한 새로운 치료 접근법인 dcLVA는 환자에게 유망한 전망을 제공하지만, 치료 효과의 근간이 되는 정확한 메커니즘은 추가 해명이 필요합니다3. 동물 모델은 이러한 메커니즘을 조사하는 데 없어서는 안 될 플랫폼을 제공합니다. dcLVA의 치료 메커니즘에 대한 포괄적인 이해는 AD 병인에 대한 이해를 향상시킬 뿐만 아니라 수술 기술을 최적화하고 치료 적응증을 명확히 하며 궁극적으로 환자에게 더 큰 임상적 이점을 제공할 것입니다.

Xie 교수 팀은 최근 dcLVA 모델을 보고하여 외부 경정맥의 지류와 심부 경부 림프절4를 연결하는 타당성을 입증했습니다. 그러나 모델에 대한 설명은 여전히 충분하지 않습니다. 첫째, 심부 경부 림프절(dcLN)과 그 주변 해부학적 구조에 대한 설명이 부적절합니다. 둘째, 수술 후 개통성에 대한 객관적이고 정량적인 평가가 없습니다. 더 중요한 것은 dcLN 및 정맥의 문합 단계에 대한 자세한 설명과 교육에 편리한 명확하고 직관적인 사진 및 비디오가 부족하다는 것입니다.

이 기술에는 복잡한 외과적 조작이 포함되고 쥐와 인간 사이의 해부학적 차이를 고려할 때 쥐 모델의 수술 절차와 기술적 세부 사항의 변화로 인해 실험 결과에 상당한 불일치가 발생할 수 있습니다. 따라서 쥐의 관련 해부학적 랜드마크를 명확하게 설명하고 문합 절차에 대한 자세한 기술적 설명을 제공하는 것이 중요하고 시급합니다. 이러한 노력은 수술 프로토콜의 재현성과 표준화를 향상시켜 연구자의 광범위한 적용을 지원하고 관련 과학적 연구를 발전시키는 데 필수적입니다. 또한, 림프절-정맥 문합, 림프정맥 문합 등 임상수술기법의 다양성과 수술적 접근법에 따라 결과가 달라질 가능성이 있다는 점을 감안할 때, 상대적 효능을 평가하기 위한 비교연구가 필요하다. 이러한 문제에 대응하여 우리는 재현성이 높은 두 가지 dcLVA 방법인 심부 경부 림프절-정맥 문합(dcLnVA) 및 심부 경부 림프관-정맥 문합(dcLaVA)을 제시합니다. 이러한 방법은 모델 생성 프로세스를 표준화하고 후속 기초 연구를 촉진하는 것을 목표로 합니다.

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프로토콜

본 연구는 하얼빈 의과대학 기관 동물 관리 및 이용위원회(IACUC)의 승인을 받아 수행되었습니다(승인 번호. SYDW2025-037). 피험자는 대학의 동물 센터에서 제공한 체중 400-500g, 생후 12-14주인 수컷 Sprague-Dawley(SD) 쥐였습니다. 센터는 특정 병원체 없음(SPF) 시설을 유지하고 국가 육종 기준을 준수합니다.

참고: 이 연구는 주로 심부 경부 림프와 정맥 사이의 두 가지 문합 방법을 조사합니다. dcLN과 후방 안면 정맥(PFV) 사이의 외과적 연결 설정; 이 기술을 dcLnVA라고 합니다. 심부 경추 림프관(dcLaV)과 PFV 사이에 해부학적 연결을 생성합니다. 이 기술을 dcLaVA라고 합니다. 우리는 수술 방법론과 문합 후 평가를 포함하여 두 가지 미세 수술 절차를 자세히 설명합니다.

1. 수술 전 준비

  1. 펜토바르비탈나트륨(50mg/kg)의 복강내 주사 를 통해 쥐를 마취합니다. 쥐의 반응을 면밀히 모니터링하십시오. 페달 반사가 완전히 없는 경우에만 진행하십시오.
  2. 끝이 뭉툭한 바늘을 사용하여 Evans 블루(EB) 용액(약 60-100 μL/kg, 5%)5 을 편측 비강의 비강 점막에 천천히 투여합니다. 쥐를 복부가 위쪽을 향하고 EB 주사된 콧구멍이 아래를 향하도록 반측면 누운 자세로 배치합니다. EB가 반대쪽 콧구멍이나 호흡기로 들어가는 것을 방지하기 위해 머리를 고정합니다.
  3. 쥐의 목에 있는 털을 면도하여 깨끗한 수술 부위를 확보하십시오. 수술 중 건조함이나 각막 손상을 방지하기 위해 양쪽 눈에 바셀린을 바르십시오.

2. 외과적 절개

  1. 멸균 수술 부위를 보장하기 위해 요오드 팅크로 쥐의 목 정중선을 세 번 소독합니다.
  2. 수술용 가위를 사용하여 약 3cm 길이의 정중선 절개를 합니다.
    참고: 해부 중 상악하선(SMG)과 혈관이 손상되지 않도록 주의하십시오.
  3. 수술 절개를 후퇴시켜 흉골갑상선근(STM), 흉쇄유돌근(SCM) 및 오모설골근(OHM)을 노출시킵니다.

3. PFV 준비

  1. SCM의 측면 가장자리를 따라 외경정맥(EJV)의 지류인 PFV를 식별합니다.
  2. PFV와 EJV 사이의 분기점에서 미세혈관 클립을 사용하여 PFV를 폐색합니다.
  3. PFV를 계속 무뚝뚝하게 해부하여 충분한 길이를 얻고 원위 끝에서 고정합니다. dcLN과의 문합 중에 후속 견인을 허용하기 위해 PFV 세그먼트가 가능한 한 느슨하게 유지되도록 합니다.
  4. 미세혈관 가위를 사용하여 혈관 축과 평행한 세로 절개를 만듭니다.
    알림: 가로 절개는 견인에 의해 확대되고 파열될 수 있으므로 PFV 절개가 세로인지 확인하십시오.
  5. 혈관내 적혈구가 완전히 제거될 때까지 헤파린화 식염수(0.9% NaCl에 0.1% 헤파린 나트륨)로 분리된 혈관 분절을 철저히 세척합니다.

4. 림프절-정맥 문합

  1. STM 및 SCM4 중간에 있는 dcLN과 구심성 림프관(ALV)을 탐색하고 완전히 노출시킵니다.
  2. 무딘 기술을 사용하여 dcLN을 점진적으로 해부합니다. dcLN과 주변 조직 사이의 근막을 조심스럽게 절개하여 dcLN과 ALV 모두의 손상을 방지합니다.
    참고: 문합 후 장력을 최소화하기 위해 PFV와 dcLN이 서로 가까이 있는지 확인하십시오.
  3. dcLN의 말단부를 절개합니다. PFV 혈류에 큰 영향을 미치지 않도록 절개 폭이 PFV의 직경보다 작거나 유사한지 확인하십시오.
  4. 12-0 나일론 봉합사를 사용하여 PFV 절개의 근위 끝을 dcLN 절개의 근위 끝으로 문합합니다.
  5. PFV의 절개 길이를 원위 끝까지 계속 확장하여 dcLN 절개 길이보다 약간 커지도록 합니다.
  6. 바늘을 dcLN 절단의 바깥쪽 가장자리와 PFV 절개의 안쪽 가장자리를 순차적으로 통과시켜 dcLN 절단을 PFV의 내강으로 당깁니다.
  7. dcLN 절도의 아래쪽 가장자리에서 위쪽 가장자리까지 연속 봉합을 수행합니다. PFV 내강 내에서 혈전 형성을 방지하기 위해 최종 봉합을 완료하기 직전에 헤파린 나트륨을 한 번 더 투여합니다. 연속 봉합 중에 봉합사에 적절한 장력을 유지하여 안전한 봉합을 보장하고 후속 누출을 방지하십시오.
  8. 연속 문합이 느슨한 곳에 단속된 봉합사를 배치하십시오.

5. 림프관-정맥 문합

  1. ALV를 횡단하고 주변 조직을 보존하여 봉합사 앵커 포인트 역할을 합니다.
  2. 12-0 봉합바늘을 사용하여 PFV 절개 부위 근위 약 2mm 지점에 삽입하고 PFV 절개 부위의 개구부를 통해 빠져나오도록 전진시킵니다.
  3. 봉합 바늘로 ALV 그루터기 근처의 조직에 들어가 ALV를 잡습니다.
  4. 바늘을 PFV 절개 부위에 통과시켜 근위 가장자리를 통해 바늘을 통과시킨 다음 봉합사를 묶어 PFV 내강 내의 ALV 그루터기를 고정합니다.
    참고: ALV 그루터기를 PFV의 내강에 완전히 삽입하고 생리적 배액을 유지하기 위해 근위 방향으로 향하게 합니다.
  5. ALV 그루터기 근처의 주변 조직을 PFV 절개 부위의 안쪽 가장자리에 봉합하여 외부 고정을 제공합니다. PFV 내강에 혈전이 없도록 마지막 바늘 전에 헤파린 나트륨을 투여하십시오.

6. 봉합사 및 수술 후 관리

  1. 피하근막에 대한 연속 봉합과 표피에 대한 중단 봉합을 수행합니다.
  2. 요오드 팅크로 수술 부위를 소독하십시오. 그런 다음 감염을 예방하기 위해 절개 부위 주위에 에리스로마이신 연고를 균일하게 바릅니다.
  3. 수술 후 페니실린 나트륨(800,000 단위/kg)을 연속 5일 동안 1일 1회 복강내 주사 로 투여하여 감염 위험을 줄입니다.

7. 문합 검증

  1. PFV 측면의 EJV의 지류인 전방 안면 정맥(AFV)을 식별하고 해부합니다.
  2. 인접한 AFV에 비해 PFV에서 훨씬 더 강렬한 염색을 관찰하여 문합의 성공을 확인합니다.
  3. 표준화된 CIE LAB 색 공간을 사용하여 색상 변화를 객관적으로 정량화합니다. 피지에서 관심 영역(ROI)을 정의하고 추출하여 평균 CIE L*a*b* 값을 얻은 다음 다음 공식을 사용하여 색조 각도(h°)를 도 단위로 계산합니다.
    h° = atan2(b, a) × (180/π)6,7.

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결과

dcLnVA와 dcLaVA의 수술 절차와 수술 후 결과는 각각 하나의 대표 사례로 설명되어 있습니다. dcLnVA의 경우 PFV(직경 2mm)가 확인되고 SCM의 측면 경계에서 해리되었습니다(그림 1A, 그림 S1A). PFV의 약 4mm 내측인 SCM과 STM 사이의 간격에서 긴 타원형 dcLN(5mm × 4mm × 2mm)이 발견되어 미세하게 분리되었습니다(그림 1B,C, 그림 S1B-E). 그 후, 클램핑된 PFV를 분리된 dcLN과 병치했습니다(그림 1D). PFV 측벽에 세로 절개(1.5mm)를 하고 내강을 약 1mL의 헤파린 나트륨 용액(0.1%)으로 세척했습니다(그림 1E...

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토론

2012년에 ILif et al. 글림프 시스템8을 처음으로 설명했습니다. 2015년 Louveauet al. 림프관 내강에서 T 세포 응집체를 확인하고 이러한 구조를 수막 림프관이라고 불렀습니다. 그들은 또한 수막 림프관이 글림프 시스템과 dcLN 모두에 연결되어 있음을 입증했습니다. 요약하면, 글림프계와 수막 림프계를 모두 포함하는 뇌 림프계의 조절에 따라 간질액의 Aβ는 뇌척수액(CSF)으로 배출된 다음 수막 림프관으로 배출되어 궁극적으로 dcLN9에 도달합니다. 후속 동물 실험은 손상된 수막 림프 기능이 마우스에서 인지 저하 및 Aβ 침착 증가를 초래한다는 것을 일관되게 입증했습니다10. 반대로, 수막 림프계의 기능을 향상시키는 근적외선 조사와 같은 치료 전략은 마우스의 인지를 개선하고 AD 관련 병리학적 특징을 감소시키는 것으로 나타...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 중국 국가자연과학재단(82173384 및 81773161), 헤이룽장성 핵심 연구 개발 프로그램(2023ZX06C11) 및 Genertec 의학 과학 연구 기금 프로젝트(TYYLKYJJ-2024-043)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
멸균 생리식염수 0.9%   그리고 nbsp;산둥 치두 제약유한회사(Shandong Qidu Pharmaceutical Co., Ltd.) & nbsp; 그리고 nbsp;R9824041307  그리고 nbsp;
에리스로마이신 연고산기 제약유한회사.H34020307
에반스 블루 다이 5% (50mL)리젠DK0053
헤파린 나트륨 용액 0.1%바이오스코BAC006
마이크로 겸자안릭신AT-15
미세혈관 클램프타이거진TG-AC-18-Z
페니실린 나트륨허베이 위안정 허무 제약유한회사JFT230602
화이트 바셀린톈청  그리고 nbsp;20250202

참고문헌

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