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방법 논문

맥락막 신경총, 상피와 내피의 별도 분석을 위한 인간 혈액-뇌척수액 장벽의 첨단 공동 배양 모델

430 조회수

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DOI:

10.3791/69275

⸱

2025년 11월 28일

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1Pediatric Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2European Center for Angioscience, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 3Department of Medical Statistics, Biomathematics and Information Processing, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 4Laboratory of Clinical Regenerative Medicine, Department of Neurosurgery, Faculty of Medicine, University of Tsukuba

이 논문에서

요약

혈관-뇌척수액 장벽의 고급 시험관 내 모델을 생성하기 위해 맥락신경총의 인간 상피세포와 내피세포를 공동 배양하는 연구가 이루어졌습니다. 우리는 선택된 조건에서 상피와 내피를 분리하여 후속 RNA 준비 및 전사 분석을 수행하는 과정을 설명합니다.

초록

뇌실계에 위치한 고도로 관류된 맥락막총(CP)은 입방체 상피와 창구형 내피 등 여러 구조적 구성 요소로 구성되어 있으며, 혈액-뇌척수액 장벽(BCSFB)의 위치입니다. 시험 관 내 CP를 연구하기 위해 여러 가지 세포 배양 방식이 고려될 수 있습니다. 인간 상피 CP 유두종(HIBCPP) 세포를 기반으로 한 강한 장벽 기능을 가진 역전세포 배양 필터 모델을 우리 연구실에서 구축하여 광범위하게 사용하고 있습니다. 최근에는 안정적인 불멸화 인간 CP 내피 세포주(iHCPEnC)를 생성하는 데 성공했습니다. 두 세포주를 결합하여, HIBCPP 세포 단독 비교해 장벽 기능이 향상된 고급 기능성 2세포형 모델을 구축하였습니다. 이 모델은 CP 상피와 내피를 모두 나타내기 때문에, 감염, 염증 등 선택된 조건에서 두 세포 유형 간의 상호작용을 조사할 수 있게 합니다. 이 프로토콜에서는 상피세포와 내피세포를 분리하여 전사 분석을 수행하는 이 2세포형 모델을 구축하는 방법을 설명합니다. 우리는 상피와 내피에 특이적인 PCR 프라이머를 소개하며, 이는 두 세포 간 교차 오염 가능성을 검출하는 역할을 합니다. 염증 상태에서 CP 내피가 상피에 미치는 잠재적 영향을 조사하기 위해, 지지다당류(LPS) 처리 맥락에서 선택된 유전자의 발현 수준을 HIBCPP 세포 분획에서 분석하였습니다. 고급 CP in vitro 모델과 상피 및 내피 반응을 별도로 분석할 수 있는 가능성은 CP의 생물학적 및 병리학적 기능과 관련된 세포 과정 연구에 중요한 관심사입니다.

서론

맥락막총(CP)은 뇌의 네 개의 뇌실에 위치한 다양한 세포 집단으로 이루어진 고도의 혈관 형성 집합체입니다. 그 외에 중추신경계(CNS)와 혈액 사이의 생리학적 장벽인 혈액-뇌척수액 장벽(BCSFB)으로서 뇌가 혈액 내 감염성 물질을 순환하는 것을 방지하는 역할을 합니다. CP는 다양한 세포 유형으로 구성되며, 여기에는 밀착 및 부착 접합부와 데스모좀이 포함되어 있으며, 기저막 위에 위치해 있습니다. 상피세포 표면은 하내막 표면에 미세융모가 존재함으로써 확대됩니다. 저저막 1,2,3 아래에 위치한 창문 내피 모세혈관은 섬유아세포와 면역 세포 같은 결합 조직으로 둘러싸여 있습니다. 최근 CP 내피세포가 상피 세포와 함께 BCSFB의 무결성을 향상시킬 수 있으며, 이는 염증 과정 중 뇌 보호에 역할을 할 수 있다는 보고가 있습니다 4,5.

현재까지 인간 상피 CP 유두종(HIBCPP) 세포의 역배양은 높은 전상피 전기 저항(TEER) 값과 강한 장벽 기능을 가진 인간 BCSFB를 모방하기 위해 가장 자주 사용되는 시험관 내 모델입니다. 세포 기능을 더 잘 이해하고 동시에 동물 실험을 피하려면 시험관 내 실험에서 가능한 한 많은 정보를 얻는 것이 중요합니다. 최초로 안정적으로 불멸화된 인간 CP 내피 세포주(iHCPEnC)가 최근 우리 실험실 6,7에서 확립되었습니다. HIBCPP 세포와 iHCPEnC의 도움으로 우리는 BCSFB를 보다 진보된 방식으로 모방하는 공동 배양 시험관 모델을 구축할 수있었습니다. 이 두 세포 유형 모델을 사용하여 HIBCPP 세포와 iHCPEnC의 공동 배양이 HIBCPP 단독 세포에 비해 TEER 값을 증가시킨다는 것을 입증할 수 있습니다. iHCPEnC만으로는 TEER 7,8이 발생하지 않는다는 점이 중요합니다. 이 모델에서 사용된 두 세포 유형에 대한 별도의 준비와 후속 분석을 통해 건강한 상태와 병든 상태에서 이들의 상호작용을 조사할 수 있을 것입니다.

여기서는 이 목표를 달성하기 위한 두 가지 다른 접근법을 설명합니다. 이 방법은 두 경우 모두 HIBCPP 세포의 역전된 세포 배양 모델을 기반으로 한다는 점입니다(그림 1). 방법 1, 즉 '직접 공동 배양(direct co-culture)' 방법은 두 세포를 하나의 필터 인서트에 포함시키는 방식입니다. HIBCPP 세포는 iHCPEnC 씨앗 전에 역방향으로 배양되며, 표준 방식은 7,8입니다. 방법 2인 '멤브레인-인-인서트' 배양에서는 필터 인서트에 사용되는 멤브레인과 동일한 특성을 가진 별도의 멤브레인을 추가했습니다. 이 추가 막은 이미 HIBCPP 세포가 역배양 환경에서 성장 중인 필터 삽입물에 삽입됩니다. iHCPEnC는 표준 배양 방식으로 추가 막에 시딩됩니다.

이후 세포를 분리하여 RNA 분석함으로써 선택된 조건에서 CP 상피와 내피의 전사 반응에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다. HIBCPP 세포와 iHCPEnC에 특이적인 PCR 프라이머를 소개하는데, 이는 두 세포 유형의 성공적이고 깨끗한 분리를 확인할 수 있게 합니다. 지지다당류(LPS) 치료 후, 우리는 설명된 모델을 사용하여 염증성 상태에서 내피가 존재할 때 CP 상피의 독특한 반응을 조사합니다.

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프로토콜

1. HIBCPP 세포

참고: 다음에서는 HIBCPP 세포의 배양 및 유지 방법, 그리고 HIBCPP 세포를 이용한 역배양 필터 삽입물 제조에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 12웰 세포 배양 필터 삽입물에서 HIBCPP 세포를 증식하기 위해 설계되었습니다. 24웰 세포 배양 필터 삽입물에 HIBCPP 세포를 배양하는 상세한 프로토콜과 동영상이 이전에 발표되었습니다.

  1. HIBCPP 세포를 배양에 채취하기
    1. HIBCPP 세포 한 바이알을 실온(RT)에서 해동하세요.
    2. 바이알 내용물을 10mL의 DMEM/HAMS-F12 배지(태아 송아지 혈청(FCS) 10%와 예열된 5 μg 인슐린 배지(10% HIBCPP 배지)를 들어 재현탁합니다.
    3. 재현탁된 HIBCPP 세포를 T75 세포 배양 플라스크에 넣고 37°C에서 5%CO2와 함께 24시간 배양합니다.
    4. 세포 씨앗 후 24시간 후에 플라스크의 배지를 바꾸어 DMSO를 제거하세요.
    5. 세포를 90% 융합할 때까지 배양하며, 이 과정은 약 2주가 걸립니다. 매체를 일주일에 두 번 바꾸세요.
  2. HIBCPP 세포의 연속 배양
    참고: 연속 배양을 위해서는 HIBCPP 세포를 1:3으로 분할하여 새로운 T75 세포 배양 플라스크에 넣으세요.
    1. T75 플라스크에서 배양지를 제거하세요.
    2. 10mL PBS로 세포를 한 번 세척하세요.
    3. PBS를 제거하세요.
    4. 0.25% 트립신-EDTA 3mL의 도움으로 HIBCPP 세포를 분리합니다. 이 단계는 37°C에서 약 10-20분 정도 소요됩니다. 그동안 플라스크를 돌려 세포층을 트립신-EDTA로 완전히 덮어주세요.
    5. HIBCPP 배지 7mL를 추가하고 50 x g 에서 원심분리기에서 10분간 RT로 투여합니다.
    6. 세포 펠릿을 10% HIBCPP 배지 30mL에 재현탁한 후 3개의 새로운 T75 플라스크에 발라줍니다.
    7. 세포를 90% 융합할 때까지 배양합니다; 세포들은 약 1주일 후에 합류할 것입니다.
    8. 매체를 일주일에 두 번 바꾸세요.
      참고: HIBCPP 세포는 성장 억제가 되지 않습니다; 따라서 플라스크는 합류하여 세포가 계속 성장하며 다층을 형성합니다.
  3. 역배양에서 HIBCPP 세포 씨앗
    1. T75 플라스크에서 배양지를 제거하세요.
    2. 10mL PBS로 세포를 한 번 세척하세요.
    3. PBS를 제거하세요.
    4. 0.25% 트립신-EDTA 3mL의 도움으로 HIBCPP 세포를 분리합니다. 이 단계는 37°C에서 약 10-20분 정도 소요됩니다. 그동안 플라스크를 돌려 세포층을 트립신-EDTA로 완전히 덮어주세요.
    5. 그동안 필터 삽입물을 준비하세요. 12웰 필터 삽입물을 겸자를 거꾸로 돌려 6웰 배양판에 넣고, 미리 데워진 10% HIBCPP 배양지로 채웁니다. 각 필터 삽입물 위에 매체 한 방울을 미리 적셔 멤브레인을 적세요.
    6. 트립신화된 세포를 10% HIBCPP 배지 17mL로 재현탁합니다.
    7. 50 x g 에서 10분간 RT 원심분리기에서 HIBCPP 세포를 1 × 106 cells/mL 농도로 조절합니다.
      참고: HIBCPP 세포는 작은 응집체를 형성하는 경향이 있습니다. 필터 삽입물에 씨앗을 뿌리기 전에 완전히 녹일 필요는 없습니다. 셀의 90%가 단일 셀인지 확인하세요.
    8. 12웰 필터 인서트에 4×10 5 셀 밀도의 HIBCPP 셀을 거꾸로 시드 처리합니다.
    9. 세포 부탁액이 막에 흡수될 때까지 기다립니다. 6웰 배양판 뚜껑을 닫으세요.
    10. 인큐베이터에 인서트가 있는 플레이트를 넣으세요.
    11. 씨앗 후 24시간 후, 겸자를 이용해 삽입물을 올바른 방향으로 돌려 새로운 12웰 배양 플레이트로 만듭니다. 하부 구획에는 10% HIBCPP 배지 2mL를, 상부 구획에는 1mL를 넣으세요.
    12. 세포를 5일에서 6일간 배지 교체 없이 방치한 후 TEER 측정과 공동 배양 준비를 시작하세요.

2. TEER 결정

참고: TEER 값 측정은 MilliCell ERS2와 젓가락 전극의 도움을 받아 수행됩니다. 세포 배양 필터 삽입물에 포함된 세포 배양 필터 삽입물(옴블랭크)의 빈 측정이 계산을 위해 필요합니다.

  1. 젓가락 전극은 건조하게 보관하세요. 측정을 시작하기 전에 전극을 80% 에탄올에 10분간 넣어 소독하세요.
  2. 그 후 전극을 PBS로 헹구세요.
  3. 측정 시작: 전극의 긴 끝을 웰에, 짧은 끝을 시드 셀이 포함된 필터 인서트에 넣습니다.
  4. 12웰 세포 배양 필터 삽입물(옴샘플)의 옴값을 기록하세요.
  5. TEER는 다음과 같이 계산합니다: 옴·cm2 = (옴샘플 -옴 빈칸) × 1.1 cm2.
  6. 측정이 끝난 후에는 전극을 80% 에탄올로 헹군 후 건조 보관합니다.
    참고: 다양한 실험 조건이나 세포주 측정 사이에는 젓가락 전극을 PBS로 소독하고 세척하여 교차 오염을 방지해야 합니다.

3. iHCPEnC

  1. iHCPEnC 문화 분야 도입
    1. RT에서 iHCPEnC 바이알 한 병을 해동하세요.
    2. 바이알 내용물을 미리 가열한 5mL의 완전 클래식 내피 배지(iHCPEnC 배지)로 재현탁합니다.
    3. 500g에서 원심분리기를 5분 간 RT로 돌립니다.
    4. 그동안 T25 세포 배양 플라스크에 2mL의 부착 인자를 약 1분간 코팅하세요. 부착 인자를 흡입하고 iHCPEnC를 시딩할 때까지 플라스크를 그대로 두세요.
    5. 세포 펠릿을 5mL의 iHCPEnC 배지로 재현탁한 후 준비된 T25 세포 배양 플라스크에 넣습니다.
    6. 배지 변경 없이 37°C에서 5%CO2 와 함께 1주일간 배양합니다.
  2. iHCPEnC의 연속 배양
    참고: 연속 배양의 경우, iHCPEnC 1:4를 새로운 T25 세포 배양 플라스크에 분할하세요.
    1. iHCPEnC 배지를 제거하고 3mL PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 세포가 떨어지지 않도록 주의하세요.
    2. PBS를 흡입하세요.
    3. 1mL의 트립신-EDTA를 이용해 합류한 iHCPEnC를 분리합니다. 이 단계는 RT에서 약 3-5분 정도 걸립니다.
    4. 세포를 5mL의 iHCPEnC 배지에 재현탁합니다.
    5. 500g에서 원심분리기를 5분 간 RT로 돌립니다.
    6. 그동안 4개의 새 T25 플라스크에 2mL의 부착 인자를 코팅하세요.
    7. 세포 펠릿을 20mL iHCPEnC 배지로 재현탁합니다.
    8. 각각 4개의 준비된 플라스크에 세포 현탁액 5mL를 분포합니다.
    9. 다시 말하지만, 배지를 바꾸지 않고 1주일간 세포를 배양합니다. 1주 후에 합류할 예정입니다.
      참고: iHCPEnC 세포는 성장 억제 상태입니다; 따라서 플라스크는 합류하여 남은 셀들이 떠오르게 됩니다.

4. 공동 배양 실험 준비

  1. 방법 1: "직접 공동 배양"(한 삽입물의 양쪽에 상피세포와 내피 세포를 배양하는 경우)의 경우, 추가적인 재료를 준비하지 마세요.
  2. 방법 2: '멤브레인 인-인서트' 방법의 경우 다음 단계를 수행합니다:
    1. 별도의 Din-A-4 막에서 11mm 직경에 해당하는 No. 11 천공철을 이용해 12웰 세포 배양 필터 삽입물 크기의 막을 뚫어냅니다.
    2. 천공 제거된 막을 페트리 접시에 넣으세요.
    3. 천공된 막을 자외선(UV-C, 254nm)으로 60분간 멸균하세요.
      참고: 천공 제거 및 멸균된 12웰 세포 배양 필터 인서트 크기의 막은 사전에 준비하여 멸균 상태에서 보관할 수 있습니다.

5. 공동 문화 구축

참고: 현재 HIBCPP 세포는 이미 2세포형 시험관 배양 모델에 맞게 준비되어 있습니다. HIBCPP 세포는 5일에서 6일간 배양되었습니다(1.3.8-1.3.12 단계 비교). HIBCPP 세포는 TEER(약 20옴·cm2)를 발달시키기 시작할 것입니다.

  1. 두 경우 모두 방법 1("직접 공동 배양")과 방법 2("막 인-인서트")는 10% HIBCPP 배지를 1% HIBCPP 배지로 대체합니다. 이를 위해 12웰 배양 플레이트의 웰에 1% HIBCPP 배지 2mL를 넣습니다.
  2. 피펫과 겸자를 이용해 역배양 필터 삽입물을 비우고, 필터 삽입물을 표준 방향으로 준비된 12-웰에 넣습니다.
  3. 방법 2("멤브레인 인-인서트")의 경우, 필터 인서트를 다음과 같이 준비하세요:
    1. 천공 제거 및 멸균된 막을 준비된 12웰 필터 삽입물에 HIBCPP 세포를 역배양하여 겸자를 사용해 역배양 상태로 넣습니다.
  4. 세포 배양 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣어 iHCPEnC의 트립신화(6단계에 설명됨)를 진행합니다.

6. 공동 배양에서 iHCPEnC의 파종 및 배양

참고: 다음 절에서는 12웰 세포 배양 필터 삽입물에서 HIBCPP 세포와 iHCPEnC의 공동 배양 확립에 대해 설명합니다. 24웰 세포 배양 필터 삽입물에서 HIBCPP 세포와 iHCPEnC의 공동 배양에 관한 상세한 프로토콜은 이전에 8번 설명된 바 있습니다. iHCPEnC를 분리하기 전에 공동 배양을 수행하는 데 필요한 세포 수를 계산하세요. 한 개의 융합된 T25 세포 배양 플라스크는 약 5× 10개의5 세포를 제공합니다.

  1. iHCPEnC가 포함된 Confluent T25 플라스크의 배지를 제거하세요.
  2. iHCPEnC를 PBS 3mL로 세척하세요. 세포 분리는 피하세요.
  3. PBS를 제거하세요.
  4. 1mL의 트립신-EDTA를 이용해 합류한 iHCPEnC를 분리합니다. 이 단계는 RT에서 약 3-5분 정도 걸립니다.
  5. 세포를 5mL/T25 플라스크에 iHCPEnC 배지와 함께 재현탁합니다.
  6. 노이바우어 챔버의 세포 수를 세어보세요.
  7. 원심분리기를 500 × g에서 5분간 RT로 돌립니다.
  8. 세포 펠릿을 iHCPEnC 배지에 최종 농도인 1×10 5 cells/mL로 재현탁합니다.
  9. 방법 1("직접 공동 배양")과 방법 2("인서트 내 막"): 12웰 필터 인서트에 700 μL iHCPEnC (7x105 세포) 씨앗을 시드합니다.
  10. iHCPEnC 씨앗 후 24시간 후 처음으로 공동 배양 및 대조군(즉, HIBCPP 세포 및 iHCPEnC 단정 배양)의 TEER 값을 모니터링하고, 그 이후에는 매일 모니터링합니다.

7. LPS 치료

참고: 공동 배양은 HIBCPP 세포 단독 배양보다 더 높은 TEER 값을 보여야 하며(권장 인수: 1.5 이상).

  1. 실험을 위해 설치된 세포 배양 삽입물의 TEER 값을 측정하고 기록하세요.
  2. 1% HIBCPP 배지에 5 μg/mL LPS를 포함한 마스터 믹스를 준비합니다.
  3. 웰당 2mL 1% HIBCPP 배지를 포함한 새로운 12웰 플레이트를 준비합니다.
  4. 겸자와 피펫팅을 이용해 삽입물을 비우세요.
  5. 준비된 우물에 삽입물을 넣으세요.
  6. LPS 마스터 믹스 1mL 또는 1% HIBCPP 배지를 추가하세요(음성 대조군).
  7. 37°C에서 4시간 배양하세요.
  8. 섹션 8으로 진행하기 전에 TEER 값을 측정하고 기록하세요.

8. HIBCPP 세포와 iHCPEnC에서 RNA를 분리하여 후속 전사 분석을 수행

참고: 두 개의 별도 세포 분획을 달성하고 공동 배양 모델에서 배양된 세포의 교차 오염을 방지하기 위해, 세포 분획은 인서트에서 따로 조심스럽게 긁어냅니다. 각 필터 인서트에 대해 RNA 분리의 모든 단계를 중단 없이 수행하세요(인서트는 건조하지 않도록 허용됨).

  1. 워시 필터 삽입물을 PBS로 한 번 사용하세요. 이를 위해 1.5 mL PBS를 포함한 12웰 세포 배양 플레이트를 준비합니다.
  2. 피펫과 겸자를 이용해 세포 배양 필터 삽입물을 비우세요. 삽입물을 PBS가 채워진 12웰 세포 배양 플레이트에 삽입합니다.
  3. 삽입물에 1mL의 PBS를 추가하세요.
  4. iHCPEnC 및 HIBCPP 세포를 방법 1('직접 공동 배양')으로 준비하기 위해 다음 단계를 수행하세요:
    1. 인서트에서 PBS를 제거하여 빈 12웰 배양 플레이트에 넣습니다.
    2. 피펫 팁과 10-20 μL PBS의 피펫 상하 피펫 사용으로 iHCPEnC를 인서트에서 스크랩하여 분리합니다.
    3. 이 세포 분획을 350 μL RNA 용해 완충제가 들어 있는 1.5 mL 튜브에 넣습니다. 세포를 적절히 섞기 위해 위아래로 피펫을 움직여 RNA 용해 버퍼와 함께 섞으세요.
    4. iHCPEnC 분획 채취가 완료된 후, 삽입물을 세포 배양판 뚜껑 안쪽으로 뒤집어 넣습니다.
    5. HIBCPP 세포를 iHCPEnC 분획과 마찬가지로 막에서 떼어내어 350 μL RLT-β-머캅토에탄올이 담긴 1.5mL 준비된 튜브에 넣습니다.
      참고: 한 질환에 대해 여러 개의 공동 배양을 준비할 경우, 삽입물과 세포 분획당 350 μL의 RNA 용해 완충제를 섭취하십시오. 특정 조건의 단일 준비 세포 분획을 같은 컬럼에서 연속적으로 정제합니다.
  5. 방법 2('막 인-인서트')를 위해 iHCPEnC 및 HIBCPP 세포를 준비하려면 다음 단계를 수행하세요:
    1. 겸자를 이용해 추가 막을 제거하고 12웰 배양판의 마른 뚜껑에 넣습니다. iHCPEnC 용해를 위해 100 μL RNA 용해 버퍼를 막에 피펫 부착합니다.
    2. 이 100 μL 용해액을 250 μL RNA 용해 완충제가 들어 있는 1.5 mL 튜브에 넣고 잘 섞습니다.
    3. 필터 삽입물에서 PBS를 제거한 뒤, 12웰 배양판 뚜껑에 아래쪽으로 넣으세요. 삽입물 막에 100 μL RNA 용해 완충제를 첨가하고 HIBCPP 세포 분획을 용해합니다.
    4. 이 100 μL 용해액을 250 μL RNA 용해 완충액이 들어 있는 1.5 mL 튜브에 넣습니다.
  6. 제조사 프로토콜에 따라 RNA 분리를 수행하세요.
  7. 분광광도계를 사용해 RNA의 양을 측정하세요.
  8. 제조사가 설명한 대로 RNA 샘플에 대해 역전사 및 qPCR 분석을 수행합니다.
    참고: 공동 배양은 HIBCPP 세포에 비해 iHCPEnC 함량이 적기 때문에, 후속 분석에 따라 iHCPEnC에서 충분한 RNA를 분리하기 위해 여러 개의 12웰 필터 삽입물이 필요합니다. 각 필터 삽입물의 RNA 용해액은 함께 모아야 합니다. 역전사와 qPCR은 앞서 설명한 대로 수행할 수 있습니다.

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결과

이 프로토콜에서는 도식적으로 그림 1에 나타난 것처럼 세포 배양 필터 삽입물에 상피(HIBCPP 세포)와 내피(iHCPEnC)로 구성된 인간 CP의 두 세포형 모델을 단계별로 생성하는 과정을 설명합니다. 이 모델 시스템에서는 HIBCPP 세포가 필터 하단에서 역방향으로 배양되는 반면, iHCPEnC는 삽입물 필터 상단이나 삽입물 막 위에 놓인 두 번째 필터 위에 시딩됩니다.

2셀형 모델의 TEER 값
최근 우리는 세포 배양 필터 삽입물에서 HIBCPP 세포와 iHCPEnC를 공동 배양하면, TEER 측정에 따라 장벽 기능이 시간이 지남에 따라 증가함을 보여주었습니다. 이 실험들은 0.4 μm 기공 6,7,8<...

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토론

인간 CP는 장벽 형성 상피와 확장된 혈관의 내피 등 여러 세포 유형으로 구성되어 있습니다. CP의 내피세포는 페네트라트(펜에스트라트)되어 있지만, 최근 연구에서는 BCSFB 4,7에서 장벽 기능에 기여하는 이들이 입증되었습니다. CP처럼 장기에서 내피와 상피 간의 복잡한 상호작용을 연구하기 위해서는 두 세포 유형을 모두 분석할 수 있는 고급 시험관 내 모델이 필요합니다.

여기서는 상피세포(HIBCPP 세포)와 내피세포(iHCPEnC)로 구성된 인간 CP의 2세포형 in vitro 모델 생성 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜을 수행할 때는 배양물의 TEER 값을 정기적으로 모니터링하는 것이 중요하며...

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공개 사항

저자들은 이해 충돌이 없다고 선언합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.25% 트립신-EDTA라이프 테크놀로지스 25200056
12웰 세포 배양판 및 nbsp;스타랩CC7682-7512
12개의 웰 필터 인서트(3 & 마이크로; M 모공)그레이너 바이오 원665631
24웰 세포 배양판 및 nbsp;스타랩CC7672-7524
24웰 필터 삽입물  (0.4 & 마이크로; M 모공)그레이너 바이오 원662641
24웰 필터 인서트(3 & 마이크로; M 모공)그레이너 바이오 원662631
6웰 세포 배양판 및 nbsp;스타랩CC7682-7506
AffinityScript cDNA 합성 키트 (cDNA 합성)애질런트600559
부착 인자셀 시스템4조-500완전 클래식 내피 중간 키트의 일부입니다.
브릴리언트 II SYBR 그린 qPCR 마스터 믹스 (실시간 PCR)애질런트600828
젓가락 전극밀리포어MERSSTX01이 제품은 단종되었습니다.
완전 클래식 내피 배지 (iHCPEnC 매체)셀 시스템4조-500키트, 매체, 보충제, 코팅용 부착 팩터가 포함되어 있습니다.
DMEM/F-12 (1:1) 페놀레드 (10% HIBCPP 미디엄)써모피셔31330-038
DMEM/F-12 (1:1) 페놀르드 미사용(1% HIBCPP 미디엄)써모피셔11039-021
태아 송아지 혈청(FCS) (1% 및 10% HIBCPP 미디엄)써모피셔10270-106
인슐린 (1% 및 10% HIBCPP 미디엄)시그마I9278
지지방다당류(LPS)시그마L3024
밀리셀 ERS2 밀리포어MERS00002이 제품은 단종되었습니다.
나노드롭 (분광광도계)써모 사이언티픽ND1000이 제품은 단종되었습니다.
No. 11 천공철Wü RTH880223211
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Qiagen RNeasy 마이크로치아겐74004
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T75 세포 배양 플라스크사르스테트 AG & 코 KG83,39,11,002
TRAKETCH PET 3.0 cc (별도의 멤브레인)사베우SK4580
자외선칼 로스H469.1

참고문헌

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