HIF-1α/BNIP3 경로 억제 를 통한 자가포식 조절을 통한 무릎 골관절염에서 Hydroxyl Safflower Yellow A의 분자 기전

널리 퍼진 만성 정형외과 질환인 무릎 골관절염(KOA)은 중년 및 노년층에 영향을 미쳐 삶의 질에 큰 영향을 미칩니다^1,2. 광범위한 발생에도 불구하고 KOA의 근본적인 정확한 병인 및 병태생리학적 메커니즘은 아직 불완전하게 이해되고 있습니다. 더욱이, 예방과 근치적 치료 모두에서 이 상태의 복잡한 병리학적 토대를 밝히는 것이 시급함을 강조합니다. 새로운 관심 분야 중 하나는 연골 항상성에서 자가포식의 역할이며, 연골 조직 내 자가포식 감소가 KOA ^3,4의 변성에 기여한다는 증거가 축적되고 있습니다.

세포 항상성 유지에 필수적인 세포 분해 과정인 자가포식은 연골의 유지 및 복구에 매우 중요합니다. 관절 연골 내에 널리 퍼져 있는 저산소 미세 환경에서 저산소증 유도 인자 1α(HIF-1α)/아데노바이러스 E1B 19kDa 상호 작용 단백질 3(BNIP3) 신호 전달 경로가 자가포식의 중추적인 조절자로 나타납니다. KOA 환자에서 HIF-1α 발현 상승이 관찰되었으며, 이는 이 경로의 조절 장애가 자가포식 장애 및 후속 연골 변성에 기여할 수 있음을 시사합니다 ^5,6,7.

침술, 뜸, 약초, 마사지는 무릎 관절염을 치료하는 한의학의 네 가지 고전적인 방법입니다. 비스테로이드성 항염증제, 히알루론산 주사, 관절 성형술과 같은 현재 치료법은 도움이 되는 것으로 입증되었지만 특정 부작용과 관련이 있습니다⁸. 더욱이 무릎 골관절염에 대해 권장되는 일상적인 치료법은 없습니다. 시간이 지남에 따라 KOA에 대한 일반적인 보완 요법으로 중국 전통 의학(TCM)은 KOA⁹ 치료에 가능성을 보여주는 수많은 약초 요법을 개발했습니다. 이 중 하이드록실 잇꽃 옐로우 A는 항염증 및 자가포식 조절 특성으로 인해 큰 주목을 받았습니다^10,11. 그러나 HSYA가 무릎 골관절염(KOA)에 치료적 영향을 미치는 정확한 메커니즘, 특히 HIF-1α/BNIP3 경로를 통한 자가포식 조절 측면에서 불확실합니다. 따라서 KOA에서 HSYA의 치료 효과 메커니즘을 연골 세포 자가포식에 미치는 영향과 HIF-1α/BNIP3 경로와의 상호작용에 초점을 맞춰 조사합니다. 우리는 HSYA가 HIF-1α/BNIP3 경로 억제를 통해 세포사멸과 염증을 억제하면서 연골세포 자가포식 및 증식을 강화하여 무릎 골관절염을 완화한다는 가설을 세웁니다.

인간 샘플과 관련된 모든 절차는 Zhanjiang Central People's Hospital 윤리 위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호. KY-YS-2021-09)을 참조하십시오. 샘플 수집 전에 모든 참가자로부터 서면 동의서를 얻었습니다. 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 환자 및 연구 설계

무릎 골관절염(KOA) 진단을 받고 슬관절 전치환술을 받는 30명의 환자를 모집했습니다. 코호트에는 52-75세(평균 ± SD: 64.3 ± 12.6세)의 남성 14명과 여성 16명이 포함되었으며, 모두 미국 류마티스 학회 KOA 기준¹²를 충족합니다. 수술 전 2주 이내에 비스테로이드성 항염증제 또는 스테로이드를 투여받았거나 1개월 이내에 관절 내 주사를 받은 환자는 제외되었습니다.

2. 일차 연골 세포 배양

관절 연골은 수술 직후 멸균 상태에서 채취하여 저온 PBS에 넣었습니다. 멸균 메스를 사용하여 연골을 얼음처럼 차가운 유리판에서 ~1mm³ 조각으로 절단하고 10mL의 0.25% 트립신-EDTA가 들어 있는 50mL 원심분리관으로 옮겼습니다. 튜브를 37°C 진탕 수조에서 80rpm에서 30분 동안 배양하고 소화를 용이하게 하기 위해 5분마다 부드럽게 뒤집었습니다. 상청액을 흡인하고 조직 펠릿을 PBS로 한 번 세척하고 200 × g 에서 5분 동안 원심분리했습니다. 그런 다음 펠릿을 10mL의 0.02% II형 콜라게나제에 재현탁하고 37°C에서 4시간 동안 진동하면서 소화했습니다. 현탁액을 해리를 촉진하기 위해 30분마다 위아래로 피펫팅하고 70μm 스트레이너를 통과한 다음 200× g 에서 5분 동안 다시 원심분리했습니다. 생성된 펠릿을 10% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에 재현탁하고 T25 플라스크에 파종했습니다. 세포를 5% CO₂와 함께 37°C에서 배양하고, 배지를 2-3일마다 교체하고, 1-2계대의 세포를 실험에 사용하였다. 실험군은 정상 대조군, 블랭크 모델, HSYA(100μmol/L), HIF-1α 억제제 YC-1(10μmol/L), 라파마이신(10nmol/L), HSYA + YC-1 및 HSYA + 라파마이신을 포함했습니다.

3. siRNA 매개 HIF-lα, BNIP3 녹다운

일차 연골 세포를 2-5 × 10⁵ 세포/웰에서 6-웰 플레이트에 파종하고 30%-50% 컨플루엔션에 도달할 때까지 37°C에서 배양했습니다. 각 웰에 대해 5μL의 20μM siRNA를 250μL Opti-MEM에 희석하고, 5μL의 지질 기반 형질감염 시약을 250μL Opti-MEM에 별도로 희석했습니다. 두 용액을 부드럽게 혼합하고 실온에서 15-20분 동안 배양하여 복합체를 형성했습니다. 배양 배지를 10% FBS가 함유된 1.5mL의 신선한 DMEM으로 교체하고, siRNA-지질 복합체(500μL)를 부드럽게 소용돌이치면서 웰 벽을 따라 적가했습니다. 세포를 6시간 동안 배양하고, 배지를 완전 배지로 교체하고, 배양을 48-72시간 동안 계속하였다. 녹다운 효율은 추가 처리 전에 qRT-PCR 및 웨스턴 블롯으로 검증되었습니다.

4. 엘리사

세포 배양 상청액을 수집하고, 200× g 에서 5분 동안 원심분리하고, 필요한 경우 분석 완충액에서 1:2로 희석하였다. IL-1β, TNF-α 및 IL-6용 ELISA 키트는 제조업체의 프로토콜에 따라 사용되었습니다. 표준, 블랭크 및 샘플은 세 번으로 실행되었습니다. 기질 반응 후, 15분 이내에 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정했습니다.

5. MTT 분석

연골세포를 100μL의 완전 배지에서 5,000 세포/웰로 96웰 플레이트에 파종하고 0시간, 24시간, 48시간 또는 72시간 동안 배양했습니다. 각 시점에서 20μL의 MTT 용액(PBS에서 5mg/mL)을 각 웰에 직접 첨가하고 웰 바닥에 보라색 포르마잔 결정이 보일 때까지 플레이트를 37°C에서 30분 동안 배양했습니다. 상청액을 결정을 방해하지 않고 조심스럽게 흡인하고, 각 웰에 150μL의 DMSO를 첨가하고, 플레이트를 100rpm의 쉐이커에 10분 동안 놓아 결정을 완전히 용해시켰다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 490nm에서 측정되었습니다. 대사적으로 활성이 높은 세포에서 신호 포화를 피하기 위해 짧은 배양 시간을 선택했습니다.

6. 유세포 분석

세포를 트립신화에 의해 수확하고, 200× g 에서 5분 동안 원심분리하고, 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 이들을 500 μL의 결합 완충액에 ~1 × 10⁶ cells/mL로 재현탁하고 5 μL Annexin V-FITC 및 5 μL PI를 첨가했습니다. 부드럽게 혼합한 후, 세포를 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 배양했습니다. 샘플은 유세포 분석기에서 분석되었으며, 샘플당 최소 10,000개의 이벤트가 수집되었습니다(여기 488nm, 방출 FITC 530/30nm, PI > 600nm). 세포사멸 세포는 표준 소프트웨어를 사용하여 정량화되었습니다.

7. 웨스턴 블로팅

세포를 차가운 PBS로 두 번 헹구고 프로테아제 억제제를 함유한 200μL RIPA 완충액에 얼음 위에서 30분 동안 용해했습니다. 세포를 플라스틱 스크레이퍼로 긁어내고, 위아래로 피펫팅하여 점도를 낮추고, 12,000 × g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 수집하고 BCA 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정했습니다. 동일한 양의 단백질(30μg)을 5× 로딩 완충액과 혼합하고 95°C에서 5분 동안 가열한 다음 10%-12% SDS-PAGE 겔에서 분리했습니다. 스태킹을 위해 80V, 분리를 위해 120V에서 전기영동을 실행하고, 단백질을 300mA에서 90분 동안 PVDF 멤브레인으로 옮겼습니다. 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 5% 무지방 우유에서 차단하고 1차 항체(1:1,000)와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 배양했습니다. TBST로 3회 세척한 후, 멤브레인을 HRP-접합 2차 항체(1:5,000)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양했습니다. 단백질 밴드는 ECL 기질로 시각화되었고 30-120초 노출로 화학발광 검출 시스템을 사용하여 이미지화되었습니다. 밴드 강도는 ImageJ를 사용하여 정량화되었고 GAPDH는 로딩 컨트롤로 사용되었습니다.

8. 모노단실카다베린(MDC) 염색

사용 직전에 원액으로부터 50μM MDC 작업 용액을 제조했습니다. 세포를 실온에서 10분 동안 1mL의 4% 파라포름알데히드로 고정하고, PBS로 2회 세척하고, 500μL MDC 작업 용액과 함께 어두운 곳에서 37°C에서 30분 동안 배양했습니다. PBS로 2회 세척한 후, 커버슬립을 퇴색 방지 마운팅 매체로 장착하고 형광 현미경(여기 355nm, 방출 512nm)에서 관찰했습니다.

9. 투과전자현미경(TEM)

세포를 수확하고 200 × g에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화한 다음 밤새 4°C에서 2% 글루타르알데히드에 고정했습니다. 샘플을 PBS로 각각 5분 동안 3회 세척하고 흄 후드에서 4°C에서 1시간 동안 1% 사산화오스뮴에 사후 고정했습니다. 탈수는 각각 10분 동안 30%, 50%, 70%, 90% 및 100%의 등급별 아세톤 시리즈를 통해 수행되었습니다. 샘플을 1:1 아세톤/에폭시 수지로 1시간 동안 침투시킨 다음 순수 수지로 밤새 침투시켰습니다. 포매는 신선한 수지에서 수행하고 60°C에서 48시간 동안 중합했습니다. 50-70nm의 초박형 절편을 울트라마이크로톰으로 절단하고, 200메쉬 구리 그리드에 장착하고, 2% 우라닐 아세테이트로 30분 동안 염색한 후 구연산납으로 15분 동안 염색하고, 증류수로 세척하고, 공기 건조하고, 투과전자현미경으로 80kV에서 검사하였다. 안전 참고 사항으로, 글루타르알데히드와 사산화오스뮴은 독성이 있고 휘발성이 있으므로 장갑과 보호 안경을 착용한 훈기 후드에서만 취급해야 합니다. 폐기물은 기관 안전 프로토콜에 따라 지정된 유해 용기에 폐기해야 합니다.

10. 통계 분석

모든 실험은 세 번으로 수행되었습니다. 데이터는 평균 ± SD로 표현됩니다. 통계적 유의성은 일원 분산 분석에 이어 LSD 사후 테스트를 사용하여 평가되었으며 P < 0.05가 유의한 것으로 간주되었습니다.

연골세포 전염증성 사이토카인(IL-1β, TNF-α, IL-6) 발현에 대한 HSYA의 영향
정상 대조군과 비교하여 다른 모든 그룹은 전염증성 사이토카인(IL-1β, TNF-α 및 IL-6) 수치가 유의하게 상승한 것으로 나타났습니다(P < 0.05, 표 1, 그림 1A-G). HSYA, HIF-1α 억제제, 자가포식 유도제, HSYA + HIF-1α 억제제 또는 HSYA + 자가포식 유도제로 치료한 결과 블랭크 모델 그룹에 비해 사이토카인 수치가 유의하게 감소했습니다(P < 0.05). 이 중 병용 치료(HSYA + HIF-1α 억제제 또는 HSYA + 자가포식 유도제)는 사이토카인 발현을 더욱 감소시켜 모델군에 비해 약 35%-40% 감소했다(P < 0.05). 유전자 간섭 실험(그림 1H-J)에서 HIF-1α 또는 BNIP3의 siRNA 녹다운은 모델 + 블랭크 그룹에 비해 사이토카인 수준에서 ~25%-30%의 감소를 가져왔습니다. HSYA 치료는 이러한 효과를 더욱 강화했습니다. 구체적으로, siHIF-1α + HSYA 그룹의 사이토카인 수치는 siHIF-1α + 블랭크 그룹보다 ~20% 낮았고, siBNIP3 + HSYA 그룹의 수치는 siBNIP3 + 블랭크 그룹보다 ~22% 낮았습니다(P < 0.05).

연골세포 증식에 대한 HSYA의 영향
정상 대조군은 기준선 증식 활성을 나타낸 반면, 빈 모델 그룹은 유의한 감소를 보였습니다(P < 0.05, 그림 2A). 증식은 HSYA, HIF-1α 억제제 또는 자가포식 유도제로 치료한 후 부분적으로 회복되었고, HSYA + HIF-1α 억제제 또는 HSYA + 자가포식 유도제 병용 치료에 의해 현저하게 향상되었습니다(P < 0.05). siRNA 실험(그림 2B)에서 HIF-1α 또는 BNIP3의 녹다운은 모델 대조군에 비해 ~25% 증식을 촉진했습니다. HSYA 치료는 증식을 더욱 향상시켜 모델 그룹에 비해 ~40% 더 높은 증식을 보였습니다(P < 0.05).

연골세포에서 세포사멸 및 자가포식 관련 단백질 발현에 대한 HSYA의 영향
웨스턴 블롯 분석은 그룹 간 단백질 발현의 유의미한 차이를 나타냈습니다(표 2). 빈 모델 그룹은 대조군에 비해 HIF-1α의 현저한 상향 조절과 LC3, P62, Beclin1 및 BNIP3의 발현 감소를 보였습니다(P < 0.05). HSYA, HIF-1α 억제제 또는 자가포식 유도제로 치료하면 LC3, P62, Beclin1 및 BNIP3 발현이 증가하고 HIF-1α 수치가 감소했습니다(P < 0.05). HSYA + HIF-1α 억제제 또는 HSYA + 자가포식 유도제와의 병용 치료는 가장 큰 변화를 일으켰으며 LC3 및 Beclin1 수치는 블랭크 모델 그룹에 비해 거의 두 배로 증가했습니다. P62는 일반적으로 자가포식이 활성화될 때 감소하지만 여기서는 HSYA 치료 후 수치가 증가했습니다. 이것은 연골 세포 자가포식에 대한 이전 연구에서도 보고된 현상인 향상된 자가포식체 축적 또는 불완전한 플럭스를 나타낼 수 있습니다.

연골세포의 세포사멸률에 대한 HSYA의 효과
유세포 분석 결과 블랭크 모델 그룹은 정상 대조군보다 유의하게 더 높은 세포사멸률을 나타냈습니다(P < 0.05, 그림 3A,B). HSYA, HIF-1α 억제제 및 자가포식 유도제는 각각 세포사멸을 감소시킨 반면, 병용 치료(HSYA + HIF-1α 억제제 또는 HSYA + 자가포식 유도제)는 가장 낮은 세포사멸률을 생성했으며 빈 모델 그룹에 비해 ~45%-50% 감소했습니다(P < 0.05). siRNA 실험에서 세포사멸도 HIF-1α 또는 BNIP3의 녹다운에 의해 감소되었고 HSYA 처리에 의해 더욱 감소되었습니다.

연골세포의 세포사멸률 및 자가포식 소포 형성에 대한 HSYA의 영향
MDC 염색 및 TEM 이미징은 그룹 간 자가포식 소포 형성의 명확한 차이를 나타냈습니다(그림 4A-D). 빈 모델 그룹은 소포의 희박한 분포를 나타낸 반면, HSYA, HIF-1α 억제제 또는 자가포식 유도제 처리는 소포 수를 증가시켰습니다. 병용 치료(HSYA + HIF-1α 억제제 또는 HSYA + 자가포식 유도제)는 모델 그룹에 비해 TEM에서 관찰된 소포가 약 2배 더 많아 가장 현저한 향상을 보였습니다. 이러한 결과와 일치하게, 유세포 분석법(그림 5A-E)으로 측정한 세포사멸률은 병용 치료군에서 가장 낮았습니다.

데이터 가용성:
이 연구에서 생성된 모든 데이터는 보충 파일 1에 제공됩니다.

그림 1: 각 그룹(n = 3)에서 연골세포 전염증성 사이토카인(IL-1β, TNF-α, IL-6)의 발현. (AG) IL-1β, TNF-α 및 IL-6의 단백질 발현 수준은 웨스턴 블로팅(WB)에 의해 검출되었습니다. (HJ) IL-1β, TNF-α 및 IL-6의 함량은 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)으로 측정되었습니다(P < 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 각 그룹의 연골 세포 증식 활성 비교(n = 3). (A) 치료군, (B) HIF-1α 및 BNIP3 녹다운군, P< 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 각 그룹의 세포사멸률 비교(n = 3). (A) 1, 정상군; 2, 모델 그룹; 3, HSYA 그룹; 4, HIF-1α 억제제군; 5, 자가포식군; 6, HSYA + HIF-1α 억제제군; 7, HSYA + 자가포식 유도제군. (B) HIF-1α 및 BNIP3 유전자 녹다운 그룹. 정상 대조군과 비교하여 *P < 0.05입니다. 빈 모델 그룹과 비교했을 때 #P< 0.05입니다. HSYA + HIF-1α 억제제군과 비교하여 &< 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 미토콘드리아에서 자가포식 소포 형성의 TEM 이미징. (A) 빈 모델. (B) HSYA 그룹. (C) HIF-1α 억제제군. (D) 자가포식 유도 그룹. 스케일 바 = 1μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 각 그룹의 세포 사멸률에 대한 HSYA의 효과(n = 3). (A) 빈 모델. (B) HSYA 그룹. (C) HIF-1α 억제제군. (D) 자가포식 유도 그룹. (E) 정상 대조군과 비교한 각 그룹의 전체 분석, **P< 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 각 그룹의 전염증성 사이토카인 수치 비교. 정상 대조군과 비교하여 *P < 0.05입니다. 빈 모델 그룹과 비교했을 때 #P< 0.05입니다. HASY, HIF-1α 억제제 및 자가포식 유도제로 치료한 그룹과 비교하여 & P< 0.05.

표 2: 서로 다른 그룹의 단백질 비교. 정상 대조군과 비교하여 *P< 0.05. HSYA, HIF-1α 억제제 및 자가포식 유도제로 치료한 그룹과 비교하여 #P< 0.05.

보충 파일 1: 연구 중에 생성된 원시 데이터. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 경쟁 이해관계가 없음을 선언합니다.