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연구 논문

간지롱 과립은 제2형 당뇨병에서 SIRT3-MPC1-PC/PDH 축을 통해 간 포도당신생을 억제합니다

419 조회수

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DOI:

10.3791/69500

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2025년 12월 12일

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1College of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine, 2Department of Gastroenterology, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 3Research Center of Chinese Traditional Medicine, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 4Preventive Treatment Center, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine

이 논문에서

요약

이 연구는 간지롱 그라뉴얼이 SIRT3-MPC1-PC/PDH 축을 통해 간 혈당신생을 억제하여 제2형 당뇨병의 고혈당증을 완화하는지 조사하였다.

초록

제2형 당뇨병(T2DM)은 간 인슐린 저항성과 과도한 포도당신생을 특징으로 하는 전 세계 대사 장애입니다. 간지롱 그라뇰(GZRG)은 전통 중의학 조제로, T2DM 관리에 잠재력을 보여주었으나, 특히 간 포도신생과 관련된 근본 기전은 아직 명확하지 않습니다. 이 연구는 GZRG가 SIRT3 매개 신호 전달 경로를 조절함으로써 고혈당을 완화하는지 조사하였습니다. GZRG의 항당뇨 효과는 고지방식이(HFD) 유도 T2DM 마우스와 자유지방산(FFA) 유도 인슐린 저항성 HepG2 세포에서 평가되었습니다. 대사 지표, 포도당 및 피루브산 내성, 인슐린 감수성, 지질 프로필을 평가하였다. SIRT3의 과발현 및 녹다운을 통해 분자 기전을 탐구하여, 포도신생 경로에서 주요 단백질(SIRT3, MPC1, PC, PDH-E2, PCK1, G6Pase)의 발현을 조사하였다. GZRG 치료는 T2DM 마우스와 인슐린 저항성(IR) HepG2 세포 모두에서 고혈당 완화, 인슐린 감수성 향상, 지질 대사 개선에 기여했습니다. 간지방증을 완화하고 포도신생을 억제했습니다. 기전적으로 GZRG는 SIRT3 발현을 하향 조절하여 MPC1과 PC 수치가 동시에 감소하고 PDH-E2가 증가하는 결과를 낳았습니다. 이 단백질 발현의 변화는 피루브산 대사를 포도당신생에서 멀어지게 만들었습니다. SIRT3 과발현은 GZRG의 포도신생 억제 효과를 역전시켰고, SIRT3 넉다운은 GZRG와 시너지를 냈다. GZRG는 SIRT3-MPC1-PC/PDH 축을 통해 간 포도당신생을 억제하여 T2DM을 완화합니다. 이 발견들은 GZRG의 새로운 분자 기전을 밝히고, SIRT3가 T2DM 관리의 잠재적 치료 표적임을 강조합니다.

서론

제2형 당뇨병(T2DM)은 전 세계적으로 가장 유병률이 크고 쇠약하게 만드는 만성 대사 질환 중 하나로 부상하여 상당한 공중보건 및 경제적 부담을 안고 있습니다 1,2. 인슐린 저항성(IR)과 진행성 췌장 β세포 기능 장애가 특징이며, T2DM은 주로 혈당 및 지질 항상성 저하에 의해 발생합니다 3,4. 포도당 조절에 관여하는 여러 기관 중에서 간은 글리코게노레이션과 포도당신생을 통해 내인성 포도당 생성을 조절하는 중심적인 역할을 합니다. 과도한 간 혈당신생은 공복 고혈당의 주요 원인으로, 이는 T2DM 병태생리의 특징이며, 포도당 균형 회복에 중요한 치료 표적입니다.

현재의 저혈당 약물들—메트포르민7, 티아졸리딘디온스8, GLP-1 수용체 작용제9, SGLT2 억제제10—은 뚜렷한 기전을 통해 혈당 조절을 달성하지만, 장기 사용은 부작용, 효능 저하, 치료 불내성으로 인해 제한되는 경우가 많습니다. 따라서 여러 대사 경로를 안전하고 효과적으로 표적으로 할 수 있는 보완 또는 대체 치료법에 대한 관심이 증가하고 있습니다. 전통 중의학(TCM)은 다성분 및 다중 표적 약리학적 특성을 특징으로 하며, T2DM11, 12, 13, 14, 15와 같은 복잡한 대사 질환 관리에 유망한 전망을 제공합니다. 여러 고전적인 TCM 제형이 통합 조절 기전을 통해 인슐린 저항성을 완화하고 지질 대사를 개선하며 간 혈당신생을 억제하는 것으로 보고되었습니다16,17.

간지롱 과립(GZRG)은 대사 질환 관리에 임상적으로 사용된 역사를 가진 표준화된 TCM 조제법입니다. GZRG는 8가지 약초 허브로 구성된 허브 제형입니다. 이전 식물화학적 및 약리학적 조사를 바탕으로, GZRG에서는 살비아놀산 B, D-스타치오스, 프로안토시아니딘, 바이올렛 옥살산, 살비아놀산 A, 살비아놀릴 산 C, 칼리코신 7 글루코사이드, 3′-메톡시푸에라린, 3′-하이드록시 푸에라린, 아피제닌-7-o-베타-d-피라노, 에모딘-8-O-β-D-포도당, 크리소파놀-1-O-글루코사이드, 크리소파놀-8-O-글루코사이드, 푸에라린, 로즈마린산, 크립토탄시논, 카테신 등 다양한 생물 활성 화합물이 확인되었습니다. Ft-나이플라빈, 칼리코신, 라인, 구아노신, 올레산, 알로에 에모딘, 포르모네틴, 팔미틱산, 크리소파놀, D-트립토판, 단센, 페룰릭산, 만니톨, 갈산, L-페닐알라닌. 전통 한의학(TCM)이 제2형 당뇨병 관리에서 가지는 근본적인 장점은 다성분적이고 다중 표적에 작용하는 시너지 작용에 있습니다. GZRG에 포함된 수십 가지 활성 성분은 인슐린 신호 전달 경로, 글리코겐 대사, 염증 반응 등 여러 생물학적 과정과 상호작용할 가능성이 높아, 단일 정제 화합물로는 충분히 재현할 수 없는 통합 네트워크 효과를 생성할 가능성이 높습니다18. 이전 연구들은 GZRG가 당뇨병 모델에서 포도당과 지질 대사에 유익한 영향을 미치는 것으로 입증되었습니다. 그러나 이러한 효과의 정확한 분자 메커니즘은 여전히 명확하지 않습니다. 특히 GZRG가 간 포도당혈생 신호를 조절하여 항당뇨 작용을 하는지는 아직 밝혀지지 않았습니다.

시르투인 3(SIRT3)는 미토콘드리아 NAD에 의존하는 탈아세틸화효소로, 세포 에너지 항상성의 핵심 조절자입니다. SIRT3는 주요 대사 효소를 탈아세틸화하고 활성화함으로써 미토콘드리아 산화 인산화, 지방산 산화, 그리고 포도당신생에 영향을 미친다21. 이상한 SIRT3 발현은 인슐린 저항성, 지방간, T2DM의 발병기전과 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다22,23. 증거에 따르면 간에서 SIRT3 과발현이 미토콘드리아 피루브산 운반체 1(MPC1)24, 피루브산 카복실효소(PC)25, 피루브산 탈수소효소(PDH)26, 포스포에놀피루베이트 카복시키나제(PCK1)27, 포도당-6-인산효소(G6Pase)28과 같은 효소를 조절함으로써 포도당신생 플럭스를 증강시킨다. 따라서 SIRT3 매개 피루브산 대사 조절은 미토콘드리아 기능과 간 포도당 배출을 연결하는 중요한 연결점을 나타내며, SIRT3는 T2DM 치료 개입의 매력적인 표적입니다.

GZRG에서 생리활성 성분의 확립된 대사 효과와 간 포도당 항상성에서 SIRT3의 중심적 역할을 고려할 때, GZRG가 SIRT3 매개 포도당신생 경로를 조절하여 T2DM의 고혈당을 완화한다고 가설이 세워졌다. 이 가설을 평가하기 위해, GZRG가 포도당 및 지질 대사에 미치는 효과를 고지방식이(HFD) 유도 T2DM 마우스와 자유지방산(FFA) 유도 인슐린 저항성 HepG2 세포에서 평가하였다. 추가 연구에서는 SIRT3-MPC1-PC/PDH 신호전달 축이 간 혈당신생에 대한 GZRG의 억제 효과를 매개하는 관여를 조사하였다. 본 연구는 GZRG의 대사 이점을 뒷받침하는 분자 메커니즘을 밝히고, T2DM 관리를 위한 다중 표적 조절제로서의 치료 잠재력을 뒷받침하는 실험적 증거를 제공하는 것을 목표로 합니다.

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프로토콜

동물 연구 프로토콜은 창춘 중의대학 기관 동물 관리 및 이용 위원회(승인 번호 2024396)에서 승인되었습니다. 모든 동물 실험은 국가 지침과 관련 국가 동물 보호법에 따라 수행되었습니다.

실험 약물
GZRG(배치 번호 26210483)는 중국 지린주 장춘중의학대학교 부속병원에서 제공하였습니다. GZRG의 주요 생리활성 성분과 품질 관리 매개변수는 이전 연구에서 특성화되었습니다18.

시약 및 항체
상업용 분석 키트를 사용해 포도당, 글리코겐, 비에스터화 지방산(NEFA), 중성지방(TG), 총 콜레스테롤(TC), 고밀도 지단백(HDL) 콜레스테롤, 저밀도 지단백(LDL) 콜레스테롤을 정량화하였습니다. 당화 헤모글로빈과 인슐린을 위한 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 키트도 상업적으로 도입되었습니다. 피루브산 탈수소효소(PDH)와 피루브산 카복실화제(PC)에 대한 ELISA 키트도 상업적으로 도입되었습니다. RNA 및 cDNA 연구를 위해 RNA 조직/세포 키트, qPCR 프리믹스, gDNA RT 슈퍼믹스를 상업적으로 도입했습니다. 형질전환 시약을 사용하여 변환 검사를 수행했습니다. SIRT3에 대한 1차 항체(RRID: AB_2837621), 인산피루베이트 카복시키나제 1(PCK1; RRID: AB_2838732), PDH-E2, 포도당-6-인산효소(G6Pase; RRID: AB_2845572), 미토콘드리아 피루브산 운반자 1(MPC1; RRID: AB_2836209), PC(RRID: AB_2836732), 그리고 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH; RRID: AB_2833041)는 상업 업체로부터 구입되었습니다.

쥐와 치료제
수컷 C57BL/6J 마우스(5-6주 생)는 랴오닝창성생명공학유한회사에서 확보하였으며, 표준 조건(22± 2°C, 습도 50%-60%, 12시간 빛/어둠 주기)에서 먹이와 물을 자유롭게 섭취하며 관리하였습니다. 1주일간의 적응 기간 후, 6마리의 쥐를 무작위로 대조군(Con)으로 지정하여 표준 차우 사료를 먹였다. 남은 쥐들은 비만과 인슐린 저항성을 유도하기 위해 12주간 고지방 식단(HFD)을 받았습니다.

13주차에 공복 혈당(FBG) 수치가 11.1 mmol/L≥ 나타난 쥐들은 성공적인 제2형 당뇨병(T2DM) 모델로 분류되었습니다. 이 당뇨병 마우스들은 무작위로 다섯 개의 실험군(n=6개)으로 배정되었습니다: HFD 모델 그룹, 저용량 GZRG(L-GZRG, 3.2 G/KG/DAY), 중용량 GZRG(M-GZRG, 6.4 G/KG/DAY), 고용량 GZRG(H-GZRG, 12.8 g/kg/d), 메트포르민(Met, 0.2 g/kg/d). GZRG와 Met는 8주 동안 매일 경구 개비지로 투여되었습니다. Con과 HFD 모델 그룹은 동등한 양의 증류수를 받았습니다. 치료 기간이 끝나면 모든 마우스로부터 혈액 및 간 조직 샘플을 채취하여 후속 분석을 진행했습니다.

복강내 포도당 내성 검사(IPGTT), 피루브산 내성 검사(PTT), 인슐린 내성 검사(ITT)
약물 치료 시작 후 6주에서 8주 사이에 대사 내성 검사를 실시하였습니다. IPGTT와 PTT 검사에서는 쥐를 하룻밤(약 16시간) 단식시켰습니다. ITT에서는 4시간 단식 기간이 단축되었습니다. 금식 후에는 복강내 주사로 포도당(IPGTT 시 2g/kg), 피루베이트나트륨(PTT당 2g/kg), 또는 인간 일반 인슐린(ITT용 1 U/kg) 중 하나를 받았습니다. 주사 후 0분, 30분, 60분, 90분, 120분 시각에 꼬리 정맥 혈액 샘플에서 보정된 혈당 수치를 보정된 혈당계를 사용해 측정하였습니다.

생화학적 분석 및 효소 활성 분석
공복 혈당(FBG), 헤모글로빈 A1c(HbA1c), 인슐린(INS) 수치는 제조사 지침에 따라 상업용 검사 키트를 사용해 측정되었습니다. 인슐린 저항성 항상성 모델 평가(HOMA-IR)는 다음과 같은 공식을 사용하여 계산되었습니다:

HOMA-IR = [FBG (mmol/L) x INS (μU/mL)] / 22.5

간 조직 내 NEFA, TG, TC, LDL-C, HDL-C 및 PDH 및 PC의 효소 활성은 해당 상업용 키트를 사용하여 정량화하였습니다.

간 조직의 조직병리학적 분석
신선한 간 조직은 10% 중성 완충 포르말린에 24시간 고정한 후 표준 처리로 파라핀 임베딩을 진행했습니다. 두께 5μm 단면을 절단하여 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색하여 일반적인 형태학적 평가를 수행하였습니다. 지질 시각화를 위해 일부 간 검체를 최적 절정 온도(OCT) 화합물에 삽입하고, 스냅 냉동, 냉동절부 후 오일 레드 O로 염색했습니다.

세포 배양 및 처리
인간 간종 세포주 HepG2는 중국과학원 유형 배양 컬렉션에서 획득되었습니다. 세포는 최소 필수 배지(MEM)에서 배양되었으며, 25 mM 포도당, 10% 태아 소 혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보완되었습니다. 배양은 5%CO2 가습 인큐베이터에서 37°C에서 유지되었습니다.

인슐린 저항성(IR)의 시험관 내 모델을 구축하기 위해, 70%-80% 융합률의 세포를 24시간 동안 올레산과 팔미트산으로 포함된 자유 지방산(FFA) 혼합물로 2:1 몰 비율로 처리하였으며, 이는 이전에 보고된 방법과 약간의 수정을 거친 것에 기반했다29. FFA 유도 후에는 동일한 FFA 혼합물과 다양한 농도의 GZRG를 포함한 신선한 MEM으로 배양지를 교체하여 추가 24시간 배양했습니다.

세포 생존 가능성 검사 (CCK-8)
로그 성장 단계의 HepG2 세포는 수확하여 1 x 104 셀 밀도의 96웰 플레이트에 시딩되었습니다. 주변 웰에는 증발을 최소화하기 위해 100 μL의 멸균 인산염 완충 생리식염수(PBS)가 채워졌습니다. 부착을 보장하기 위해 하룻밤 배양한 후, 실험 설계에 따라 세포를 처리했습니다. 처리 후에는 각 웰에 10 μL CCK-8 용액을 첨가하고, 판을 37 °C에서 2시간 배큐했습니다. 450 nm에서의 흡입도는 마이크로플레이트 리더기를 사용해 측정되었습니다. 세포 생존 가능성은 다음과 같이 계산되었습니다:

[(As - Ab) / (Ac - Ab)] x 100%

여기서 As는 시료의 흡광도, Ac는 대조군(처리되지 않은 셀)의 흡광도, Ab는 블랭크(셀이 없는 웰)의 흡광도입니다.

HepG2 세포에서의 플라스미드 트랜스펙션
SIRT3 과발현 플라스미드(OV-SIRT3)와 세 가지 뚜렷한 SIRT3 표적 소간섭 RNA 플라스미드(si-SIRT3-1#, si-SIRT3-2#, si-SIRT3-3#), 그리고 음성 대조 siRNA(si-NC)는 한 벤더에 의해 제작되었습니다. 세포 합류율이 50%-60%에 도달했을 때 형질전환 시약을 사용하여 형질전환을 수행했습니다. 형질전환 복합체는 멸균 조건에서 다음과 같이 준비되었습니다: 용액 A는 250 μL 환원 혈청 배지에 플라스미드 DNA 1 μg를 희석하여 부드럽게 혼합하여 생성되었습니다. 용액 B는 환원 혈청 배지 250 μL에 2-3 μL 형질전환 시약을 희석한 후, 상온에서 5분간 소용돌이 없이 배양하여 제조하였습니다. 두 용액을 결합하여 피펫팅으로 부드럽게 혼합한 후 상온에서 30분간 배큐하여 DNA-지질 복합체를 형성했습니다. 형질전환 시에는 시술 1시간 전 세포배양지를 흡인하고, PBS로 세포를 세척한 후 1mL의 환원된 혈청 배지(혈청 및 항생제 무첨가)를 첨가했습니다. 그 후 각 웰에 500 μL의 형질전환 복합체를 드롭 가볍게 첨가하고, 배양판을 부드럽게 휘저어 균질성을 보장했습니다. 세포는 37 °C에서 4-6시간 배양한 후, 세포 독성을 완화하기 위해 배양지를 완전한 배지로 교체했습니다. 이후 추가 분석에 따라 세포를 24-48시간 배양했다. 형질전환 효율은 정량적 PCR(qPCR)으로 평가하였다. 총 RNA를 추출하여 역전사하여 cDNA로 전환하고, 18S rRNA를 내부 대조군으로 사용한 SIRT3 특이 프라이머를 사용해 증폭하였습니다. 상대적 발현 수준은 ΔΔCt 방법을 통해 결정되었고, 이 결과를 바탕으로 가장 효과적인 siRNA 구성체가 이후 실험을 위해 선정되었습니다.

세포 내 지질 축적을 위한 오일 레드 O 염색
로그 성장 단계의 HepG2 세포는 웰당 2 x 105 세포 밀도의 24웰 플레이트에 시딩되고, 250 μM 올레산과 250 μM 팔미산이 포함된 고지질 배지를 48시간 유도하여 지질 축적 모델을 확립하였다. 처리 후 세포는 PBS로 세척한 후 10% 포름알데히드로 상온에서 10분간 고정되었습니다. 증류수로 세척하고 60% 이소프로판올에 잠시 담근 후, 세포는 갓 준비된 오일 레드 O 작업용액(성분 A1과 A2를 3:2 비율로 혼합하여 얻음)으로 10-15분간 염색했습니다. 과잉 염료는 60% 이소프로판올로 세척한 후 증류수로 세척하여 제거했습니다. 핵은 1-2분 동안 마이어스 헤마톡실린(1.0 g/L)으로 카운터 스테인을 했습니다. 최종 세척 후 세포는 글리세롤 젤라틴으로 부착되었고, 지질 방울의 정성적 평가를 위해 200배 배율의 광학 현미경으로 이미지를 촬영했습니다.

HepG2 세포에서 인슐린 저항성 유도 및 포도당 정량
HepG2 세포는 24웰 플레이트에서 2 x 105 세포의 시딩 밀도로 배양하여 인슐린 저항성의 시험관 내 모델을 구축하였습니다. 치료 후 24시간 후, 배양 상청액을 채취하여 추가 분석을 진행하였다. 세포 내 포도당 측정을 위해 세포 현탁액을 1000 x g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리했습니다. 상원액은 버려졌고, 세포 펠릿은 등장성 완충제로 한두 번 세척한 후 같은 조건에서 원심분리를 했습니다. 그 후 펠릿은 0.2에서 0.3 mL의 균질화 배지에 균질화되고, 300W 프로브를 이용해 얼음 욕조에서 초음파 파동을 가했으며, 3-5초 펄스 후 30초 간격으로 3x-5회 반복했습니다. 생성된 균질액은 추가 원심분리 없이 직접 분석되었습니다. 배양 상원액과 세포 균질액의 포도당 농도는 제조사의 지침에 따라 표준화된 포도당 분석 키트를 사용하여 대사 반응의 정확하고 재현 가능한 평가를 보장하였습니다.

세포 중성지방 함량 측정
HepG2 세포는 1000 x g 에서 10분간 원심분리하여 채취한 후 상원액을 버렸습니다. 세포 펠릿은 등토성 인산염 완충제(0.1 M, pH 7.0-7.4)로 1회 또는 2회 세척한 후 같은 조건에서 원심분리를 진행했습니다. 상청액을 제거한 후, 이 펠릿은 재현탁되어 0.2-0.3mL의 절대 에탄올로 균질화되었다. 균질체는 얼음 위에서 초음파 파란(300W, 폭발당 3-5초, 30초 간격, 3-5회 반복)을 가했다. 생성된 균질체는 추가 원심분리 없이 후속 분석에 직접 사용되었습니다. 빈 웰, 표준 웰, 샘플 웰로 구성된 96 웰 플레이트가 설치되었습니다. 철저한 혼합 후, 플레이트는 37°C에서 10분간 배양되었고, 마이크로플레이트 리더기를 사용해 500nm에서 흡광도를 측정했습니다. 세포 샘플 내 중성지방 함량은 글리세롤 표준의 연속 희석에서 도출된 표준 곡선을 기반으로 계산되었습니다.

총 콜레스테롤 함량 측정
HepG2 세포(5 x 106)는 얼음 위에서 초음파 파동을 통해 1mL의 추출 버퍼에 용해하였습니다. 균질액은 10,000 x g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리한 후, 상원액을 즉시 분석하기 위해 수집되었다. 콜레스테롤 표준 정액(50 μmol/mL)을 준비하고 연속적으로 희석하여 표준 곡선(0.3125에서 10 μmol/mL)을 생성했습니다. 콜레스테롤 분석 키트에 제공된 시약 1, 2, 3을 혼합하여 37 °C로 예열하여 작동하는 염색 용액을 준비했습니다. 샘플 또는 표준액을 작업 용액과 혼합하여 37°C에서 30분간 배양하고, 500nm에서 흡수력을 측정했습니다. 콜레스테롤 함량은 표준 곡선을 기준으로 계산되었습니다.

면역형광 염색
커버슬립에서 배양한 세포는 얼음처럼 차가운 PBS로 헹군 후 4% 파라포름알데히드로 실온에서 15분간 고정시켰다. PBS 세척 후에는 0.1% Triton X-100으로 10분간 투과시키고, 4°C에서 5% BSA로 하룻밤 차단했습니다. 그 후 세포는 1차 항-SIRT3 항체(1:500 희석)와 함께 4°C에서 밤새 배양되었습니다. PBS 세척 후, 세포는 형광 결합 2차 항체(1:2000 희석)와 함께 실온에서 어두운 환경에서 1시간 동안 배양했습니다. 핵은 DAPI(0.5 μg/mL)로 10분간 염색하였다. 커버슬립은 페이드 방지 매체를 사용해 유리 슬라이드에 장착하고 형광 현미경으로 관찰했습니다.

RNA 추출 및 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)
총 RNA는 RNA 조직/세포 키트를 사용하여 세포에서 추출하였습니다. 유전체 DNA는 제거되었고, cDNA는 gDNA RT 키트를 사용해 합성되었습니다. 정량적 PCR은 실시간 PCR 검출 시스템에서 qPCR 키트를 사용하여 수행되었습니다. 유전자 특이적 프라이머 서열은 표 1에 제공되어 있습니다.

서부 블롯 분석
간 조직에서 단백질을 추출하기 위해 약 50-200mg의 조직을 무게를 재고, 페트리 접시에서 다진 후 균질화기로 옮겼습니다. 단백질 분해를 방지하기 위해 프로테아제와 인산효소 억제제를 보충한 사전 냉각 용해 버퍼(RIPA)가 추가되었습니다. 균질화는 완전한 조직 파괴를 보장하기 위해 얼음 위에서 철저히 수행되었으며, 균질체는 원심분리관으로 옮겨져 단백질 용해를 용이하게 하기 위해 30분간 얼음 위에서 배양했습니다. 이후 균질체는 4°C에서 12,000 x g 에서 10-30분간 원심분리되었고, 상청액은 펠릿 오염을 피하는 전체 단백질 추출물로 신중히 수집되었습니다. 세포 단백질 추출을 위해 사전 냉각된 용해 완충제(1% Triton X-100 및 프로테아제 억제제 포함 RIPA 완충액)를 세포에 첨가한 후, 완전한 용해를 위해 15-30분간 얼음 위에 적립했습니다. 세포 파괴는 세포 스크레이퍼로 반복적으로 긁거나 강한 피펫팅으로 보장되었습니다. 용해액은 원심분리관으로 옮겨져 4°C에서 14,000 x g 에서 30분간 원심분리되었고, 상청액은 총 단백질 추출물로 수집되었습니다. 단백질 농도는 BCA 단백질 분석키트를 사용해 정량화되었으며, 알리코트는 향후 웨스턴 블롯 분석을 위해 -80 °C에 저장되거나 샘플 준비에 직접 사용되었습니다. 단백질 샘플은 100°C의 Laemmli 버퍼에서 10분간 변성시키고, SDS-PAGE로 분리한 후 PVDF 막에 옮겼습니다. 막은 5% 무지방 우유로 실온에서 2시간 동안 막은 후, 4°C에서 특이적 1차 항체와 함께 하룻밤 배큐했습니다. 세척 후, 막은 HRP 결합된 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅되었습니다. 단백질 밴드는 증강된 화학발광(ECL) 기질을 사용하여 시각화되었습니다. 화학발광 신호를 포착하고, ImageJ 소프트웨어를 이용한 덴시토미터 분석을 통해 밴드 강도를 정량화하였습니다. 원시 서부 블롯은 보충 파일 1에 제공된다.

통계 분석
모든 데이터는 평균의 표준오차(SEM)± 평균으로 표현됩니다. 두 그룹 간의 통계적 비교는 쌍이 없는 학생 t-검정을 사용하여 수행되었습니다. 세 개 이상의 그룹 간 비교에는 분산 일방향 분석(ANOVA)을 적용한 뒤, 다중 비교를 위한 Tukey의 사후 검정이 적용되었습니다. 모든 통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어(버전 9.5.0)를 사용하여 수행되었습니다. p-값이 0.05 미만일 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

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결과

GZRG는 HFD 유도 T2DM 마우스에서 인슐린 저항성과 포도당신생을 개선했습니다
인슐린 저항성, 고혈당, 지질이상이 특징인 HFD 유도 제2형 당뇨병(T2DM) 마우스 모델은 질병 발병 기전 조사와 치료 중재 평가에 널리 사용되고 있습니다30. 본 연구에서는 C57BL/6J 마우스에서 고유 질환 유도 T2DM 모델을 구축하여 GZRG의 효능과 기전을 평가하였다.

대조군과 비교했을 때, HFD 먹이를 먹은 쥐는 체중과 간 지수가 유의미하게 증가했으며, 이 두 가지는 GZRG 처리로 개선되었습니다(그림 1A, B). GZRG는 또한 FBG와 HbA1c 수치를 효과적으로 감소시켜 혈당 조절이 개선되었음을 나타냈습니다(그림 1D

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토론

본 연구는 GZRG가 주로 SIRT3-MPC1-PC/PDH 축 조절을 통해 간 포도신생 억제를 통해 T2DM의 생체 및 시험 관 내에서 유의미한 항고혈당 및 인슐린 감작 효과를 발휘함을 입증합니다. 실험 자료에 따르면 GZRG 투여는 HFD 유발 당뇨병 마우스에서 공복 고혈당을 완화하고, 포도당 및 인슐린 내성을 개선하며, 지질 항상성을 회복하고 간지방증을 감소시켰습니다. 동시에 GZRG 치료는 FFA 유발 인슐린 저항성 HepG2 세포에서 포도당 이용을 향상시키고 글리코겐 합성을 증가시키며 지질 축적을 완화했습니다. 종합적으로 이 결과들은 GZRG가 간 포도당 배출을 조절하는 SIRT3 의존 미토콘드리아 경로를 표적으로 하여 대사 기능 장애를 완화한다는 것을 시사합니다.

이 연구의 핵심 메커니즘적 통찰은 GZRG가 SIRT3 발현과 그 하위 표적인 MPC1과 PC를 현저히 하향 조절하는...

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공개 사항

모든 저자는 본 논문에서 보고된 연구에 영향을 미칠 수 있는 알려진 경쟁 재정적 이해관계나 개인적 관계가 없다고 진술합니다.

감사의 글

이 연구는 YDZJ202301ZYTS454 지린성 과학기술발전계획(보조금 번호 20210101199)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
FastKing gDNA 디스펠링 RT 슈퍼믹스  그리고 nbsp; 그리고 nbsp;천겐 바이오텍 유한회사(중국).nbsp;KR118-02
포도당-6-인산효소(G6Pase) 항체우한 링제시 생명공학 유한회사 (중국)LJS-D-12610
글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소효소(GAPDH) 항체우한 링제시 생명공학 유한회사 (중국)LJS-T-0004
당화된 헤모글로빈 ELISA 키트   그리고 nbsp; 그리고 nbsp;장쑤 메이먄 산업유한회사(중국).MM-0159M2
GZRG창춘 중의약과대학 부속 병원 (지린, 중국)26210483
고밀도 지단백(HDL) 콜레스테롤 검사 키트난징 건청 생명공학연구소 (중국)A112-1-1
인슐린 ELISA 키트장쑤 메이먄 산업유한회사(중국).MM-0579M2
리포펙타민2000 인비트로젠, 미국11668-019
저밀도 지단백(LDL) 콜레스테롤 분석 키트난징 건청 생명공학연구소 (중국)A113-1-1
혈당 측정 키트난징 건청 생명공학연구소 (중국)F006-1-1
미토콘드리아 피루브산 운반체 1(MPC1) 항체우한 링제시 생명공학 유한회사 (중국)LJS-D-3852
비에스터화 지방산(NEFA) 검사 키트난징 건청 생명공학연구소 (중국)A042-2-1
PC 항체우한 링제시 생명공학 유한회사 (중국)LJS-D-4364
PDH-E2 항체우한 링제시 생명공학 유한회사 (중국)LJS-D-14046
인산피루브산 카복시키나제 1 (PCK1) 항체우한 링제시 생명공학 유한회사 (중국)LJS-D-6770
피루반산 카복실라제(PC) ELISA 키트  우한 링제시 생명공학 유한회사 (중국)LJS-160408H
피루반산 탈수소효소(PDH)ELISA 키트   그리고 nbsp;우한 링제시 생명공학 유한회사 (중국)LJS-160300H
RNA 저지 패스트 조직/세포 키트   그리고 nbsp;천겐 바이오텍 유한회사(중국).nbsp;DP451
SIRT3 항체우한 링제시 생명공학 유한회사 (중국)LJS-A-5135
출연진 SYBR Green qPCR 프리믹스 천겐 바이오텍 유한회사(중국).nbsp;FP209-02
총 콜레스테롤(TC) 검사 키트난징 건청 생명공학연구소 (중국)A110-1-1
중성지방(TG) 분석기 키트난징 건청 생명공학연구소 (중국)A111-1-1

참고문헌

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