이 프로토콜은 당뇨병 합병증에서 내피 기능 장애의 분자 동인과 치료 표적을 규명하기 위해 네트워크 약리학적 스크리닝과 결합된 다중 오믹스 파이프라인(전사체 및 단백질체)을 구축합니다.
Research Article
이 프로토콜은 당뇨병 합병증에서 내피 기능 장애의 분자 동인과 치료 표적을 규명하기 위해 네트워크 약리학적 스크리닝과 결합된 다중 오믹스 파이프라인(전사체 및 단백질체)을 구축합니다.
내피 기능 장애는 당뇨병 신장병(DKD)의 주요 원인이지만, 그 전신적 분자 기전은 아직 완전히 해독되지 않았습니다. 우리는 통합 다중 오믹스 분석이 고혈당 유발 내피 손상을 지도화하고 재사용 가능한 치료제를 식별할 수 있다고 가설을 세웠습니다. 재사용 가능한 계산 파이프라인을 적용하여 고혈당 내피세포와 당뇨병 신장의 전사체/분비체 프로필을 통합하였습니다. 이 연구는 534개의 흔히 상향 조절되는 유전자/단백질을 확인했습니다. 기능적 풍부화는 세포외 기질 재형성, 세포 간 소통, 염증 경로의 활성화를 밝혀냈습니다. 교차 데이터베이스 검증을 통해 278개의 고신뢰 매개체가 정교화되었고, 단백질-단백질 상호작용 네트워크 분석을 통해 10개의 허브 유전자를 정확히 찾아냈습니다. 네트워크 약리학을 이용해 승인된 약물 라이브러리를 스크리닝하여 이 네트워크를 표적으로 할 수 있는 여러 후보 화합물(예: 브루샨틴, 이델랄리시브)을 확인했습니다. 더 나아가, 전사 인자 조절과 대표적인 분자 도킹 시뮬레이션(예: CTCF/BRD4의 이델랄리시브)은 실험적 검증을 위한 기전적 가설을 제공했습니다. 결론적으로, 본 연구는 DKD에서 내피 병원성 기전을 명확히 하고 재활용 가능한 약물 후보를 지명하는 재사용 가능한 다중 오믹스 프레임워크를 확립하여, 기전 및 치료적 발견을 위한 전략적 접근법을 제시합니다.
당뇨병은 전 세계적인 건강 도전 과제로서 2021년에 전 세계 5억 2,900만 명에게 영향을 미쳤으며, 2050년까지 13억 1천만 명이 영향을 미칠 것으로 예상됩니다. 혈당 조절 외에도 장기적인 합병증이 이환율, 사망률, 삶의 질 저하의 주요 원인입니다. 여기에는 미세혈관 합병증(예: 당뇨병성 신장질환, 망막병증, 신경병증)과 대혈관 합병증(예: 가속된 죽상경화증)이 포함됩니다. 특히 DKD는 당뇨병 환자의 30%-40%에 영향을 미치며, 전 세계적으로 말기 신장 질환(ESRD)의 주요 원인입니다2. 이러한 합병증의 심각한 부담은 그 기전을 겨냥한 새로운 치료법의 긴급한 미충족 필요성을 강조합니다.
내피세포(EC)는 모든 혈관의 내막을 형성하며, 혈관 건강의 핵심적인 문지기 역할을 합니다. 고혈당 유발 내피 기능 장애는 당뇨병성 혈관병증과 장기 손상의 중심 원인 3,4. 높은 포도당 수치는 EC 내에서 일련의 부적응 반응을 유발하며, 여기에는 질소 산화물 조절 이상(NO) 생체이용률, 엔도텔린-1(ET-1) 분비 증가, 부착 분자 발현 상향 조절(예: VCAM-1, ICAM-1), 과도한 활성 산소종(ROS) 생성(예: NADPH 산화제를 통해)을 통한 산화 스트레스 증가, 그리고 지속적인 저등급 염증 등이 포함됩니다 3,4. 이러한 변화들은 혈관 확장, 혈관 투과성 증가, 백혈구 유착 및 침윤, 혈전 촉진 상태, 궁극적으로 혈관 재형성을 촉진합니다5. 신장 미세혈관 내에서 사구체 내피 손상은 여과 장벽을 파괴하고 알부민뇨를 촉진하며, 세포외기질(ECM) 축적, 사구체 경화증, 세뇨관 간질성 섬유증에 직접적으로 기여합니다 5,6. 이후 거주하는 신장 세포의 활성화와 염증 세포의 유입은 신손상을 증폭시키는 악순환을 형성합니다 5,7. 중요한 점은, 임상 연구에서 전신 내피 기능 장애의 표지자가 당뇨병 환자에서 알부민뇨의 발병 및 진행 및 사구체 여과율(GFR) 감소와 강한 상관관계를 보이며, 이는 인간 질환 결과와 직접적인 관련이 있음을 강조합니다. 핵심 연구임에도 불구하고, 만성 고혈당이 ECM 재형성을 유발하는 ECM 재형성 변화에 의해 유발되는 정확한 전사 및 분비 재프로그래밍에 대한 포괄적이고 시스템 수준의 이해는 아직 완전히 규명되지 않아 DKD 및 기타 당뇨병 혈관 합병증에 대한 새로운 기전적 치료 표적 식별에 제한을 두고 있습니다 7,8.
당뇨병에서 내피 기능 장애를 뒷받침하는 깊은 분자 복잡성은 전통적인 단일 표적 치료법에 큰 도전을 제기합니다. 이때 계산생물학과 생물정보학이 필수 도구로 등장하여, 다양한 고차원 오믹스 데이터셋을 통합하고 개발하여 병리학 네트워크 내 인과 중심을 우선시하고 다중 표적 치료 전략을 식별할 수 있게 합니다. 중요한 점은, 기존의 단일 모달리티 접근법(예: 전사체/단백질체 단독 스크리닝 또는 약리학적 스크리닝)은 분자 층 간의 중요한 상호작용(예: 유전자 발현, 단백질 역학, 약물 반응)을 종종 놓쳐 시너지 유발 요인이나 비표적 효과를 포착하지 못한다는 점입니다10,11. 통합 다체체학 파이프라인은 동일한 시스템 내에서 전사체, 분비체, 약리학적 데이터를 동시에 프로파일링함으로써 이러한 한계를 극복하여 전체론적 질병 기전 관점을 제공합니다. 네트워크 약리학, 리간드/표적 예측 알고리즘, 그리고 실리코 분자 도킹은 승인된 약물 라이브러리의 체계적 탐구를 가능하게 하며, 복잡한 질병 신호를 상쇄할 수 있는 화합물의 재배치 또는 발견을 가속화합니다. 이러한 패러다임 전환은 DKD와 같이 내피 조절 이상과 그로 인한 파괴적인 미세혈관 부작용을 표적으로 하는 치료법을 규명하는 데 특히 큰 가능성을 지니며, 효능 향상과 부작용 감소 가능성을 제시합니다. 고혈당 노출 내피세포의 전사체학/분비체학적 분석 통합을 통해 534개의 흔히 상향 조절되는 분자가 확인되었습니다. 기능적 풍부화는 초기 DKD 발병에 세포외 기질 재형성, 산화 스트레스, 염증이 관여함을 시사했습니다. 교차 데이터베이스 분석은 허브 유전자의 PPI 네트워크를 통해 정제된 278개의 고신뢰 표적을 우선시했습니다. 승인된 약물의 네트워크 약리학 스크리닝에서 이 허브들을 표적으로 하는 85가지 후보 화합물(브레펠딘-A, 브루세안틴, 파라세타몰, 이델랄리시브 포함)이 예측되었습니다. 실리코 내 전사 인자 예측과 도킹은 기전을 탐구했습니다. 이 연구는 DKD의 내피 동인을 명확히 하고, 계산 발견 파이프라인을 구축하며, 검증을 위한 치료 후보를 제시합니다. 궁극적으로 이 파이프라인은 당뇨병 합병증에 대한 치료적 발견 프로그램을 촉진할 것으로 기대됩니다.
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동물 실험은 허베이이링 의학연구소 동물 연구 및 윤리 위원회(승인 번호: N2024082)의 승인을 받아 수행되었습니다. 이 연구에 사용된 실험 재료와 기기는 재료 표를 확인하세요. 인원은 TRIzol(피부/눈 자극제, 페놀 포함)과 프로테아제 억제제(잠재적 호흡기/피부 감작제)와 같은 유해 시약을 다룰 때 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 엄격히 착용해야 합니다. 생물학/액체 폐기물은 오토클레이버 가능한 봉투에, 유해 화학 폐기물은 기관 유해 폐기물을 지정된 용기에 분리하여 처리합니다. 폐기 전에 소모품을 소독하세요.
당뇨병성 신병증 마우스 모델링
수컷 db/db 및 db/m 마우스(12주 대)는 특정 병원체가 없는 환경(SPF) 조건에서 22± 2°C, 56% ± 습도, 12시간의 빛/어둠 주기, 그리고 자유롭게 먹이와 물을 섭취하는 환경에서 유지되었습니다. 1주일간의 적응 기간 후, 쥐들은 무작위로 숫자 식별자를 부여받고 실험 그룹에 배정되었습니다. DB/db 마우스들은 DKD를 확립하기 위해 6주간 고단백 식단을 제공했습니다. 성공적인 모델링은 대조군 대비 유의한 증가된 요로 알부민-크레아티닌 비율(UACR)으로 확인되었으며, UACR >30 mg/g이 초기 DKD12의 주요 기능적 바이오마커로 작용했습니다.
고포도당 내피 세포 모델링
인간 신장 사구체 내피세포(HRGEC)는 표준화된 조건에서 준비되었습니다. HRGEC는 정상 포도당(NG, 5.5 mM D-포도당) 또는 고포도당(HG, 30 mM D-포도당) 배양지에서 배양되었으며, 37°C의 가습 인큐베이터에서 5%CO2로 유지되었습니다. 세포는 후속 분석 전에 HG에 중단 없이 노출되거나 대조군 조건에서 24시간 동안 배양되었습니다. 삼투압 조절제(HM, 5.5 mM D-포도당과 24.5 mM 만니톨 포함)를 포함해야 합니다. 모든 조건은 엄격한 세포 적합성 기준을 충족해야 합니다: 생존율은 ≥85%, 세포자사멸사 수준은 15% 미만, HG ROS 증가는 HM에 비해 20%를 넘지 않았고, LDH 방출은 10% 미만으로 유지되어 세포 무결성을 후속 분석 전에 검증했습니다.
컨디셔티드 미디어 수집
조건 배지(CM)는 시크릿옴 분석에 대한 표준화된 프로토콜을 사용해 수집되었으며, 수정된 형태가 있었습니다. 고포도당(30 mM D-포도당), 정상 포도당(5.5 mM D-포도당), 또는 삼투압 조절(5.5 mM D-포도당 + 24.5 mM 만니톨) 자극을 24시간 후, HRGEC는 잔류 혈청 단백질을 제거하기 위해 멸균 인산염 완충 생리식염수(PBS)로 세척하였습니다. 세포는 혈청 무첨가, 페놀 적색 무첨가 기저 배지를 보충하고, 5% CO₂와 함께 37°C에서 12시간 배양하여 분비된 인자를 축적하였다.
CM은 사전 냉각된 원심분리관을 사용해 수확되었습니다. 순차적으로 샘플 처리는 아래에 설명된 대로 진행되었습니다.
주요 명확한 점: CM은 RNase/DNase 없는 원뿔 튜브로 옮겨져 3,000 x g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리했습니다. 탄환 잔해는 버려졌다.
프로테아제 억제: 1차 정제 후 2분 이내에 EDTA 프리 프로테아제 억제제 혼합물을 1배 최종 농도(1:50)에 1배 인산효소 억제제를 포함하도록 첨가하였습니다.
집중: 상청액은 즉시 미리 세척된 PBS 원심 필터(3 kDa MWCO)에 주입한 후 4,000 x g 에서 4 °C에서 90분간 원심분리하여 10배 농도를 달성했습니다.
2차 명확한 설명: 농축액은 미리 냉각된 마이크로 원심분리관에 옮겨져 12,000 x g 에서 4 °C에서 15분간 원심분리되었습니다. 상청액은 수집되어 펠릿 골집체를 피했다.
보관: 50 μL 용량의 알리코트는 멸균 저단백 결합 크라이오비얼에서 제작되었습니다. 수확 완료 후 30분 이내에 액체 질소에 급속 냉동되었습니다. 바이알은 -80 °C(동결-해동 사이클 없음)에서 보관되었습니다.
CM 배치는 내독소 검사(<0.25 EU/mL)를 받았습니다. 혈청 없는 인큐베이트 프로토콜에서는 스트레스 유도가 없었으며(HSP70/CHOP 면역블롯으로 검증됨). CM 단백질 수확량은 수확 시 생존 가능한 세포 수/DNA 함량으로 정규화되었습니다. 가공 엄격함 유지: 전반적으로 멸균 기술; ≤수확부터 냉동까지의 30분 시간; 로터 온도 평형 확인.
조절된 배지 처리된 신관 세포의 CCK-8 분석법
내피 분비체가 신장 선모체 세포 생존력에 미치는 기능적 영향을 평가하기 위해, 인간 신장 근위 선소관 상피세포주인 HK-2에 대해 CCK-8 검사를 수행했으며, 이는 기존 프로토콜에 따라 인간 신장 사구체 내피세포(HRGEC)에서 유래한 CM으로 처리되었습니다. HK-2 세포는 10% 태아 소 혈청(FBS)을 보조한 DMEM 배양지에서 배양하였다. 분석에서는 세포를 96웰 플레이트에 시딩했으며, 웰당 5 x 10³ 셀의 밀도로 시딩되었습니다. 세포에 대한 혈청 결핍은 CM 치료 직전 0.5% FBS 함유 배지에서 12시간 동안 시행되었습니다.
CM은 총 정규화된 단백질량이 동일한 상태에서 적용되었습니다. 냉동 CM 알리코트는 37°C에서 건식 욕조(<5분)에서 해동한 후, 10,000 x g 에서 4°C에서 5분간 원심분리하여 정제하였습니다. HK-2 세포(100 μL/웰)는 단백질/DNA 함량이 일치하도록 정규화된 HG-CM, NG-CM, 또는 HM-CM으로 처리되었습니다. 각 조건별로 총 3개의 생물학적 복제(각 3개의 기술적 복제)가 준비되었습니다. 샘플은 37°C에서 5% CO₂와 함께 24시간 배양되었습니다. 세포 생존 가능성은 세포 계수 키트-8을 사용하여 평가하였습니다. 이를 위해 각 웰에 10 μL CCK-8 용액을 첨가하고 37 °C에서 1-4시간 배큐했습니다. 마이크로플레이트 리더기를 사용해 450 nm 거리에서 흡광도를 측정했습니다. 생존 가능성은 다음과 같이 계산되었습니다:
생존 가능성 (%) = [(A_sample - A_blank) / (A_baseline_control - A_blank)] x 100
산화 스트레스 감지
세포 말론디알데히드(MDA) 수치는 막 지질 과산화의 주요 최종 산물 중 하나인 TBA 분석법을 통해 정량화되었습니다. 세포 용해액(1 x 107 세포)은 10,000 x g 에서 15분간 원심분리하여 정제한 후, 0.02 mL의 상액을 0.02 mL의 MDA 표준액과 함께 샘플 튜브에 투여했습니다. 이 알리코트에 클라리피컨트 0.02 mL와 산 시약 0.6 mL가 첨가되었다. 샘플/표준체는 0.2 mL의 염색제로 처리되었으며(대조관: 50% 아세트산 0.2 mL 첨가됨). 밀봉, 혼합, 100 °C에서 40분간 배양한 후, 샘플을 냉각한 후 9569 x g 에서 10분간 원심분리했습니다. 상청액은 250 μL의 마이크로플레이트로 옮겨져 OD₅₃₂ 측정을 수행했습니다.
전사체 프로파일링
총 RNA는 제조사 프로토콜에 따라 TRIzol 시약을 사용해 분리되었습니다. RNA 양과 순도는 각각 분광광도계와 조각 분석기로 평가하였다. 서열 라이브러리 구축에는 RNA 무결 수(RIN) > 7.0의 고품질 RNA 샘플만이 사용되었습니다.
폴리아데닐화(poly(A)+) mRNA는 올리고(dT) 자기 구슬 기반 선택을 두 차례 거쳐 농축되었습니다. 정제된 mRNA는 마그네슘 기반 단편화 키트를 사용해 94°C에서 5-7분간 200-300 뉴클레오타이드로 분해되었습니다. 첫 번째 가닥 cDNA 합성은 역전사효소를 사용했고, 두 번째 가닥 cDNA 합성은 dUTP가 존재하는 상태에서 대 장 균 DNA 중합효소 I과 RNase H를 사용하여 가닥 특이성을 가능하게 했습니다. 이후 단계에는 엔드 수리, A-테일링, 어댑터 연결, 자기 비드를 이용한 크기 선택 등이 포함되었습니다. PCR 증폭 이전에 dUTP가 포함된 두 번째 가닥은 UDG 효소로 소화되었습니다.
PCR을 사용하여 평균 인서트 크기가 400± 50 bp인 가닥 특이적 라이브러리가 구축되었으며, 다음 조건에서 98°C에서 1분간 초기 변성; 98 °C에서 14회 변성, 10초, 60 °C에서 어닐링 30초, 72 °C에서 30초 신장 14회 사이클; 그리고 72°C에서 5분간 마지막으로 연장이 이루어집니다. 쌍말 150 bp 시퀀싱은 일루미 플랫폼에서 수행되었으며, 샘플당 ≥ 4천만 번의 시퀀싱 깊이(Q30 > 85%)를 가졌습니다.
전사체 데이터의 생물정보학적 분석
원시 리드의 품질 검사는 FastQC(v0.11.8)를 사용했으며, GRCh38.p13 참조 게놈과 HISAT2(v2.2.1)의 정렬을 수행하였습니다. 전사체 정량화와 표본별 전사체 조립은 기본 매개변수를 사용한 StringTie(v2.1.6)를 사용해 수행되었습니다. 모든 조립된 전사체는 개별 샘플에서 병합되어 gffcompare 소프트웨어(v0.12.6; gffcompare는 StringTie의 일부가 아닌 독립 실행형 도구이며, 그 버전은 공통 안정 릴리스로 수정됨)를 사용해 통합되었습니다. DESeq2 (v1.38.3)를 사용하여 |log2 복수 변화(FC)| > 1, 허위 발견률(FDR)은 0.05<. 배치 효과는 variancePartition 패키지를 통해 수정되었습니다.
시크토옴 프로테오믹 분석
CM은 NG, HG, 또는 HM 대조군 조건에서 배양된 HRGECs에서 이전에 설명한 방법13 을 사용했으며, 시크롬 분석을 위해 수정한 방식이었습니다. 자극 후 세포는 PBS로 세척되어 혈청 무첨가 배지에서 12시간 배양되었습니다. CM은 3,000 x g 에서 10분(4 °C) 원심분리하여 수집했습니다.
각 샘플에서 같은 양의 펩타이드를 혼합한 후 용매 A(5% ACN, pH 9.8)로 희석한 후 컬럼에 주입했습니다. 펩타이드 혼합물의 분획은 3.5 μm 4.6 x 150 300Extend-C18 컬럼을 사용하여 이진 신속 분리 시스템에서 수행되었습니다. 구배 용출은 분당 0.3 mL의 유량으로 수행되었습니다: 38분 동안 5%에서 21% 용매 B(97% ACN, pH 9.8), 20분 동안 21.5%에서 40% 용매 B, 2분 동안 40%에서 90% 용매 B, 3분 동안 90% 용매 B, 10분 동안 5% 용매 B를 평형 상태로 만들었습니다. 214nm에서 용출 피크를 모니터링하고, 분획을 분별적으로 수집했습니다. 분획들은 용출 피크의 크로마토그램에 따라 결합되었습니다. 총 10개의 분열을 수집한 후 동결 건조되었습니다.
이동상 A(100% 물, 0.1% 개미산)와 B(80% 아세토니트릴)을 준비하고, 건조된 펩타이드 샘플을 0.1% 개미산으로 재구성한 후 20,000 x g 에서 10분간 원심분리했다. 분리는 UHPLC 액체상 시스템을 사용하여 이루어졌습니다. 샘플들은 ES906 HPLC 컬럼(150mm)에 8분 간격으로 2.5 μL/min 구배로 공급되었고, 다음과 같은 유효 구배로 분리되었습니다: 0-4분, 4% 이동성 B 상 선형 증가; 4-6.9분, 이동 단계 B가 25%에서 35%로 선형 증가; 6.9-7.3분, 이동 상 B 단계가 35%에서 99%로 선형 상승; 7.3-8.0분, 이동 B 상 99% 유지. 액상 분리된 펩타이드는 질량분석기로 옮겨져 DIA 모드 획득을 수행했습니다. 주요 매개변수는 다음과 같이 설정되었습니다: 정규화된 충돌 에너지 25%, 기본 충전 상태 2, 해상도 240,000, 0.6초마다 스캔, 380-980 m/z 스캔 범위, 질량 분석법 AGC 500%. 파편화 이온 스캔은 최대 3ms의 스캔 시간으로 기록되었으며, 380에서 980 m/z까지 300회의 2차 스캔 창을 사용했습니다.
DIA-NN (https://www.nature.com/articles/s41592-019-0638-x, 버전 1.9.1)은 라이브러리 프리 방법으로 DIA 데이터를 분석하는 데 사용되었습니다. MS/MS 데이터는 Uniprot 데이터베이스에서 다음 설정으로 다운로드한 단백질 서열과 대조하여 검색되었습니다: 효소: 트립신/P; 최대 누락 절단 횟수: 2회; 고정 변형: 카바미도메틸(C); 가변 변형: 산화(M) 및 아세틸(단백질 N-항); 전구체 질량 허용성: 20 ppm; 조각 질량 허용 범위: 0.05Da. 결과는 1% FDR로 필터링되었으며, 후속 분석에서는 이 필터 기준을 충족하는 단백질 그룹만 사용되었습니다.
유믹스 기능 풍부 분석 (GO, KEGG, GSEA)
기능적 풍부 분석은 확립된 생물정보학 파이프라인을 따라 필터링된 차별 발현 유전자(전사체학)와 단백질(시크릿옴 단백질체학)에 대해 수행되었습니다. 식별자는 Org.Hs.eg.db를 사용해 매핑되었습니다. GO 농축(생물학적 과정, 분자 기능, 세포 구성 요소)은 clusterProfiler를 통해 수행되었습니다. Benjamini-Hochberg는 p<값을 0.05로 보정했고, 의미 유사도 감소(컷오프=0.7)를 응결항에 적용했다. KEGG 경로 분석은 KEGG REST API(HAS, 2023년 출시)를 사용하여 수행되었습니다. 초기하학적 검사는 예쿠티엘리 FDR 보정과 함께 사용되었습니다. 경로 토폴로지 시각화는 Pathview를 사용했습니다. GSEA는 신호 대 잡음 유전자 순위를 가진 순위 기반 접근법으로 적용되었습니다. MSigDB 컬렉션(HALLMARK, C2, C5; v2023.2)과 엄선된 당뇨병 내피 서명에 대한 검사 농축이 수행되었습니다. 유의는 1000개의 표현형 순열(FDR < 25%) 후에 평가되었습니다.
단백질-단백질 상호작용 네트워크 분석
병원성 후보 풀 내 핵심 분자 조절자를 식별하기 위해 PPI 네트워크 구축과 위상 분석을 통합 계산 워크플로우를 사용하여 수행하였습니다. 278개의 후보 유전자가 STRING 데이터베이스(v12.0; 호모 사피엔스; 증거 출처에는 실험, 공동 발현, 큐레이션 데이터베이스가 포함되었으며; 상호작용 신뢰도(결합 점수) 임계값>신뢰도가 높은 에지에 대해 0.7; 그리고 추가적인 상호작용자 인플레이션도 없습니다. 결과는 Cytoscape(v3.9.1)에 가져왔고, MCODE(v1.5.2)와 CytoHubba(v0.4.1) 플러그인을 사용해 네트워크 토폴로지 분석이 수행되었습니다. 이후 네트워크는 노드 간 연결 정도에 따라 시각적으로 최적화되어, 연결성이 높은 노드는 색상이 더 어둡고 크기가 크며 라벨이 더 두드러지도록 했습니다.
당뇨병 신장 질환 표적 유전자 세트 개발
공동 상향조절된 mRNA/단백질의 기준은 다음과 같이 정의되었습니다: 전사체(FDR < 0.05 및 |log2FC| > 1)와 분비체(FDR < 0.01, |log2FC| > 1.5). 단백질과 유전자 이름은 UniProt으로 정규화되어 통합 형식(Gene Symbol)으로 변환되었습니다. 당뇨병 신장 질환에 대한 표적 유전자 세트는 GeneCards(버전 5.25, 쿼리 용어: Diabetic Nephropathies, 2025년 7월 접속), 비교 독성유전체학 데이터베이스(CTD; https://ctdbase.org/, 쿼리용어: Diabetic Nephropathies, 2025년 7월 접근일), Open Targets Platform(https://platform.opentargets.org/, 버전 0.13.8, 쿼리용어: Diabetic Nephropathies, 2025년 7월 접속일 포함)에서 질병 관련 유전자를 통합하여 구축되었습니다13, 14, 15. 이 세트는 포괄적인 당뇨병 신장 질환 참조 세트로 지정되었습니다. 공동 상조절된 mRNA/단백질과 이 유전자 집합 간의 교차점이 후속 분석을 위해 확인되었습니다.
CCL2 단백질 검출
CCL2를 정량화하기 위해 96웰 플레이트에 포획 항체(100 μL/웰)를 코팅하고 4°C에서 하룻밤 배큐했습니다. 다음 날, 플레이트를 버퍼와 함께 2번 세척하고, ELISA 희석제(200 μL/well)로 1시간 동안 RT 검사로 차단했습니다. S1 표준의 2배 연속 희석으로 7점 표준 곡선을 만들고, 샘플(100 μL/well)을 추가하여 400rpm에서 2시간 배양했습니다. 5회 세척 후 검출 항체(100 μL/웰)를 추가하여 400 rpm에서 1시간 배큐하고, 이어서 효소 용액(100 μL/웰)을 추가한 후 400 rpm에서 30분간 배큐했습니다. 샘플은 TMB 기판(15-30분, RT)으로 현상되었습니다. 반응은 산(100 μL/웰)에서 멈추었고, 흡광도는 450 nm(620 nm 기준 선택 사항)에서 측정되었습니다. 주요 단계로는 엄격한 세척, 시간 조절 인큐베이션, 그리고 재현성을 보장하기 위한 표준화된 희석이 포함됩니다.
약물 재배치
치료 화합물은 다음 플랫폼을 사용하여 예측되었습니다: LINCS L1000 특성 방향 신호 검색 엔진(L1000CDS2; https://maayanlab.cloud/L1000CDS2). 이 플랫폼은 MODZ 방법과 특성 방향 분석을 활용하여 입력 유전자 발현 서명을 역전하거나 모방할 수 있는 소분자 또는 화합물 조합을 식별합니다16. 후보 약물은 이 플랫폼을 이용해 차별적으로 발현된 신장 유전자의 조절 이상을 역전시키는 약물로 확인되었습니다. 화합물들은 조직 컬럼 내 특정 신장에 따른 신장 세포주에서의 역전 점수를 기준으로 순위를 매겼고, 상위 후보들은 주요 단백질 표적과의 결합 친화도를 평가하기 위해 분자 결합 과정을 거쳤다.
공동 조절 전사인자 스크리닝
hTFtarget 데이터베이스는 유전자 집합에 대한 공동 조절 TFsbinding을 조사했습니다. hTFtarget 데이터베이스는 다양한 세포, 조직, 상태에 걸친 대규모 ChIP-Seq 데이터셋을 계산적으로 분석하여 인간 전사인자(TF)-표적 유전자 관계를 규명하기 위해 분석되었습니다. 통합 파이프라인은 ChIP-Seq 피크 신호와 후생유전학적 맥락을 결합하여 프로모터/인핸서에서 TF 결합을 정확히 파악하여 시공간적 조절 역학을 명시적으로 설명합니다. Zhang 등에 의해 밝혀졌듯이, 이는 TF 표적 또는 유전자 조절자 탐색, ChIP-Seq 데이터 시각화, TF 협력성 조사,결합 부위 예측 등을 가능하게 하는 다차원 플랫폼 역할을 했습니다.
소분자-단백질 도킹을 위한 계산 파이프라인 및 분석
AutoDock Vina 1.2.018은 활성 성분과 전사 인자 BRD4, CTCF, EP300, SPI1 간의 결합 상호작용에 대한 분자 도킹 분석을 수행하는 데 사용되었습니다. BRD4(PDB ID: 7REK), CTCF(PDB ID: 5K5I), EP300(PDB ID: 5NU5), SPI1(PDB ID: 8E3K)의 결정 구조는 단백질 데이터 뱅크 (https://www.rcsb.org/)19,20에서 얻었다. SDF 형식의 소분자 구조는 PubChem 데이터베이스(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ 21)에서 다운로드되었으며, Open Babel 2.4.1을 사용해 MOL2 형식으로 변환되었고, PyRx 0.8로 에너지 최소화되었습니다. 단백질 전처리는 물 분자를 제거하고 수소 원자를 추가한 뒤, 가스테이거 전하를 계산한 후 PDBQT 형식으로 변환하는 방식으로 이루어졌습니다(AutoDock Vina에 필수). 각 단백질 내 공동 결정화된 리간드의 결합 부위를 바탕으로 도킹 그리드 위치와 치수를 정의하는 반유연한 도킹 전략이 사용되었습니다. MA9-086은 BRD4의 양성 대조 리간드로, EP300의 XDM-CBP는 양성 대조군 역할을 합니다. CTCF와 SPI1(알려진 양성 리간드 없음)의 경우, Proteins Plus 온라인 플랫폼(https://proteins.plus/)을 이용한 구조 분석을 통해 잠재적 결합 포켓이 확인되었습니다. 도킹 그리드 매개변수는 다음과 같이 설정되었으며(좌표와 치수 (Å) x, y, z 축을 따라 ): BRD4 중심은 (-11.907, -8.617, -3.973), 박스 크기는 (18.387, 18.387, 18.387); CTCF 센터는 (15.165, 4.854, 6.388), 박스 크기는 (17.25, 20.25, 9.75); EP300 센터는 (39.781, 5.326, 9.998), 박스 크기(16.516, 16.516, 16.516)입니다; SPI1 중심은 (3.155, -3.853, 0.668), 박스 크기(17.25, 25.5, 10.5)입니다. 도킹 시 에너지 범위는 3, 광역 매개변수는 8, 그리드 간격은 0.375 Å로 설정되었다. 결합 안정성은 결합 에너지에서 평가되었으며, 낮은 값일수록 더 안정적인 구조와 높은 상호작용 확률을 나타내며, 강한 결합 활성으로 정의되는 임계값은<-5 kcal/mol로 정의되었다. 마지막으로, 화합물과 수용체 간의 상호작용 모드를 PyMOL을 사용해 확인하였습니다.
통계 분석
데이터는 SEM 평균± 제시됩니다. 통계 검정은 정규성(Shapiro-Wilk)과 분산 균일성(Levene 검정)을 기준으로 선택되었습니다. 그룹 간 비교에는 쌍 없는 t-검정(2개 그룹) 또는 일방향 ANOVA와 LSD 사후 검사(≥개 그룹)가 사용되었습니다. p < 0.05는 유의성 임계값으로 정의되었습니다. 그래프는 GraphPad Prism 9.0으로 생성되었습니다.
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고혈당 내피 분비체가 신세뇨관에 미치는 병원성 영향 입증
이 연구는 고혈당 내피 분비체의 병원성 효과 검증으로 시작되었습니다. 고혈당 인간 사구체 내피세포(HG-CM)에서 온 조건화된 배지는 대조군에 비해 인간 근위 세뇨관 상피세포(HK-2)의 생존 가능성을 유의미하게 저하시켰습니다.
이 기능적 증거를 바탕으로 통합 당뇨병 신장 전사체 및 고포당 처리 내피 분비체 분석(LC-MS/MS OF HG-CM)이 수행되었습니다. 이 연구는 병리성 유전자와 그에 상향 분비되는 병리성 유전자의 핵심 집합을 확인했습니다. 이러한 공통 병원성 표적을 활용하여, L1000CDS2 화합물 라이브러리에서 기능적으로 발현 또는 활성을 저하시킬 것으로...
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본 연구는 통합된 다중 오믹스 및 계산적 접근법을 통해 고혈당 유발 내피 분비체 기능 장애가 당뇨병성 신장 손상의 중요한 원인임을 확립하였습니다. 신장세뇨관에 대한 분비체 매개 세포독성이 534개의 내피 유래 인자의 체계적 조절 이상과 일치하며, 이는 기질 재형성, 산화 스트레스, 염증-핵심 경로에 수렴하여 DKD 병인성에 관여한다는 점입니다. 기전적으로 검증된 허브 CCL2, VWF, SERPINE1, THBS1(1.15에서 2630배 상규제 보임)을 포함한 278개의 고신뢰 매개체를 확인함으로써, 내피 전사 재프로그래밍이 분비되는 섬유화 촉진 및 염증성 효과자로 어떻게 전환되는지 파악함으로써 핵심 지식 공백을 해소한다26,33. 특히 CCL2(MCP-1)는 단핵구/대식세포의 신장 조직 모집을 조율하는 강력한 화학물질입니다. 임상 및 실험적 증거는 CCL2가 당뇨...
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저자들은 공개할 것이 없습니다.
이 연구는 중국 국가자연과학기금(32200644), 허베이 과학기술프로그램 프로젝트(246W2501D, 252W7716D), 연자오 황금 플랫폼(A20240022)의 지원을 받았습니다.
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| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| CCL2 ELISA 키트 | 써모피셔 사이언티브 | #88-7399-88 | |
| CCR2 억제제 | 메르크 밀리포어 | #227016 | |
| 세포 생존 검사 키트 | 세븐 바이오테크놀로지 | CCK-8, SC119-01 | |
| DNA 시퀀서 | 일루미나 | 노바세쿼터 6000 | |
| 고성능 액체 크로마토그래피 시스템 | 써모피셔 사이언티브 | 얼티메이트 3000 바이너리 RSLC | |
| HRGECs 배양 매체 | 상하이 중차오신저우생명공학 유한회사. | 1001 | |
| 인간 신장 사구체 내피세포(HRGEC) | 상하이 중차오신저우 생명공학 | 프리-H-00038 | |
| 인간 신장 세뇨관 상피세포 완전 배지 | 프로셀 | CM-H193 | |
| 인간 신장 세뇨관 상피세포 (HK2) | 프로셀 | CP-H193 | |
| 수컷 DB/DB 및 db/m 마우스 (4주 된 생애) | 항저우 쯔위안 바이오테크 유한회사. | SCXK 20190004 | |
| 질량분석기 | 써모피셔 사이언티브 | 아스트랄 | |
| 마이크로플레이트 흡광도 리더기 | 분자 장치 | 스펙트라맥스 iD5 | |
| 프로테아제 억제제 칵테일 (EDTA 프리) | 로슈 | cOmplete, #5056489001 | |
| RNA 추출 시약 | 써모피셔 사이언티브 | 트리졸, #15596026 | |
| RNA 품질 분석기 | 애질런트 테크놀로지스 | 5300 조각 분석기, M5311AA | |
| RNA 정량 기기 | 써모피셔 사이언티브 | 큐비트 3.0, Q33216 | |
| ROS 감지 키트 | 써모피셔 사이언티브 | #EEA019 | |
| 초여과 원심 장치 (3 kDa MWCO) | 메르크 밀리포어 | 아미콘 울트라-4 |
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