단일 세포 히스톤 번역 변형(sc-hPTM2)의 다중화 분석을 위한 자동 샘플 준비

Summary

여기서는 동위원소 2-플렉스 표지 전략과 ArgC 소화를 사용하여 단일 세포 히스톤 번역 후 변형 후 분석을 자동화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 워크플로우는 단일 세포 해상도에서 염색질 이질성과 후생유전학적 반응을 정량적이고 재현 가능하며 고민도로 프로파일링할 수 있게 합니다.

Abstract

히스톤 번역 후 변형(hPTM)은 염색질 조직과 유전자 발현의 중심 조절자입니다. 이들의 불안정은 발달, 암, 노화와 관련이 있습니다. 질량분석법이 hPTM 연구의 주요 방법이지만, 대부분의 프로토콜은 대량 샘플을 위해 설계되어 세포 간 변동성을 구분하지 못합니다. 따라서 히스톤 PTM 분석을 단일 세포 수준까지 확장하는 것은 필수적이지만, 히스톤이 적고 라이신이 풍부하며 심하게 변형되어 있어 기술적으로 도전적입니다.

여기서는 나노 액체 취급을 이용한 히스톤 PTM 분석을 위한 자동화된 단일 세포 단백질체학 워크플로우를 설명합니다. 이 시스템은 최소한의 취급과 높은 재현성으로 개별 세포를 나노리터 규모로 처리할 수 있게 합니다. 워크플로우에는 ArgC Ultra 프로테아제를 이용한 소화가 포함되며, 이 프로테아제는 아르기닌 잔기를 절단하여 히스톤 단백질체학에서 일반적으로 요구되는 라이신 차단 유도화 단계를 피합니다. 조건 간 정량적 비교를 가능하게 하기 위해, 우리는 프로피온 무수물과 그 중수소화 유사체인 프로피온 무수물-d10에 대해 2중성 표지 전략을 적용합니다. 자동 샘플 준비, 동위원소 다중화, ArgC Ultra 소화의 결합은 단일 세포 히스톤 PTM 분석을 위한 간소화되고 민감한 프로토콜을 제공합니다.

이 방법은 염색질의 이질성과 단일 세포 해상도에서의 후생유전학적 교란의 영향을 조사할 수 있게 합니다. 작업 흐름을 입증하기 위해 HepG2/C3A 간세포암세포에서 구상체를 생성하고, 고아세틸화를 유도하는 히스톤 탈아세틸화 억제제인 부티르산나트륨으로 처리했습니다.

Introduction

히스톤은 염색질의 반복 단위인 뉴클레오솜의 단백질 구성 요소입니다. 이들의 N-말단 꼬리는 라이신과 아르기닌 잔기가 풍부하며, 아세틸화, 메틸화, 인산화와 같은 번역 후 변형(PTM)에 의해 매우 잘 조절됩니다. 이러한 변형은 DNA 접근성에 영향을 미치고, 이를 통해 전사, 복제, 수리 등 과정을 조절합니다. 변화된 히스톤 PTM 패턴은 암에서 신경퇴행, 노화 등 질병 상태와 강하게 연관되어 있습니다 ^1,2. 이러한 이유로 히스톤 PTM 분석은 후생유전학과 단백질체학 연구에서 큰 관심을 받고 있습니다. 질량분석법(MS)은 히스톤 변형에 대한 부위 특이적 및 정량적 분석을 제공하지만, 히스톤은 독특한 분석 도전 과제를 제시합니다. 아미노산 조성, 다중 변형 부위, 복잡한 조합 패턴 때문에 일반 단백질보다 분석이 더 어렵습니다. 확립된 프로토콜은 화학적 유도화를 통해 소화 전 라이신 잔기를 차단하여 펩타이드 회수와 크로마토그래피 성능을 향상시킵니다³. 이러한 다단계 파생화 프로토콜은 대량 분석에 효과적이지만, 단일 셀 입력에 문제가 되는 손실을 초래할 수 있습니다. 생물학적 시스템은 본질적으로 이질적이기 때문에 단일 세포 분석이 점점 더 중요해지고 있습니다. 대용량 히스톤은 여러 세포의 평균 신호를 분석하여 이러한 변동성을 포착하지 못합니다. 세포의 하위 집단은 염색질 상태가 다를 수 있으며, 이러한 차이는 발달, 세포 재프로그래밍, 약물 반응을 촉진할 수 있습니다 ^4,5.

여기서는 다중화 단일 세포 히스톤 PTM 분석(sc-hPTM2)을 위한 자동 샘플 준비 방법을 소개합니다. 이 방법은 개별 세포와 나노리터 규모의 시약을 자동화된 방식으로 정밀하게 분사할 수 있는 CellenONE 시스템에 의존합니다. 이 방법은 유리 슬라이드⁶에서 처음으로 방울 준비를 도입한 나노 프로테옴 샘플 준비법(nPOP)의 변형입니다. nPOP 플랫폼은 첨단 자동화 단일 세포 단백질체학을 갖추고 있지만, 표준 트립틱 소화 프로토콜은 높은 라이신 함량과 광범위한 변형 밀도로 인해 히스톤에 최적이 아닙니다. 여기서 우리는 CellenONE 시스템을 프로피온 무수화물과 결합한 표준 히스톤 유도체화를 적용하고, 동위원소 표지를 도입하여 단일 세포 해상도에서 히스톤 번역 후 변형을 정확하고 포괄적으로 정량화할 수 있게 했습니다. 구체적으로, 단백질 소화를 위해 ArgC 울트라 프로테아제를 사용하여 프로토콜을 단순화합니다. 트립신과 달리 ArgC는 아르기닌 잔기에서만 절단하며 라이신 차단이 필요하지 않습니다. 이로 인해 2단계 파생화 전략이 필요 없어져 프로토콜이 간소화됩니다. 또한, 이 방법은 프로피온 무수물과 프로피온 무수물-d10을 이용한 2-동위원소 표지 방식을 포함하여, 2개의 세포를 동시에 분석할 수 있습니다 ^7,3. 소화 및 표지 후 단일 세포 샘플을 회수하여 데이터 독립적 획득(DIA)을 사용하여 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS)/MS 방식으로 분석합니다. 우리 손에 들어본 이 방법은 이전 버전에 비해 히스톤 PTM의 감도와 재현성을 모두 향상시킨다는 것이 입증되었습니다⁸.

이 방법을 입증하기 위해, 우리는 HepG2/C3A 간세포암 세포에서 유래한 구형에서 단일 세포 히스톤 PTM 역학을 프로파일링했습니다. 우리는 이 구상체들을 잘 알려진 히스톤 탈아세틸화 억제제인 부티산나트륨으로 처리했으며, 이는 히스톤 아세틸화를 증가시키고 크로마틴 조절 탐색의 기준점이 됩니다 ^9,10. 대조군과 부티산나트륨 처리 구상체를 단일 세포 해상도로 비교함으로써, 우리는 대표성 결과의 원리 증명을 입증하며, 염색질 생물학과 암 후생유전학 분야에서 더 넓은 응용 가능성을 강조합니다. 특히 프로토콜에 대해서는 3D 구상체의 성장 및 처리에 관한 이전 논문인¹⁰, 질량분석법¹¹에서의 히스톤 펩타이드 획득, 그리고 EpiProfile¹² 소프트웨어를 이용한 데이터 분석을 참조합니다.

Protocol

1. 완충재 및 시약

1. HepG2/C3A 세포용 세포 성장 배지: 10% 태아 소 혈청(FBS), 비필수 아미노산(1% v/v), L-글루타민(1% v/v), 페니실린/스트렙토마이신(0.5% v/v)을 포함한 Dulbecco's 변형 독수리 배지(DMEM, 4.5g/L 포도당)를 준비합니다. 성장 배지는 4°C에 보관됩니다.
2. 마스터 믹스: LC-MS 등급의 물에 ArgC Ultra 60 ng/μL, HEPES 6 mM, n -도데실-β-D-말토사이드(DDM) 0.03%, 디티오트레이톨(DTT) 10 mM 을 LC-MS 등급 물에 준비합니다.
3. HA 용액: LC-MS 등급의 물에 1%(v/v) 하이드록실아민을 준비합니다.
4. 세척액: 0.1%(w/w) 포메믹산(모두 LC-MS 등급)을 포함한 50:50 아세토니트릴/물 혼합물 10mL를 준비합니다.
5. 이동상 A(MPA) - 0.1% 개미산: 999mL HPLC 등급 물에 1mL 농축 개미산을 첨가하고 잘 섞습니다.
6. 이동상 B(MPB) - 80% HPLC 등급 아세토니트릴 + 0.1% 개미산: HPLC 등급 아세토니트릴 800 mL를 HPLC 등급 물 199 mL에 첨가합니다. 다음으로 이 용액에 1mL의 농축 개미산을 넣고 혼합합니다.

2. 구형 준비

1. 구체체 준비에 대해서는 Stransky S et ^al.11을 참고하라.
2. HepG2/C3A 간세포암세포를 회전하는 3차원(3D) 생물반응기에서 5-7일간 배양하여 구체 형성을 촉진하여 ~400-600 μm 직경에 도달할 때까지 촉진합니다. DMEM을 10% FBS, 1% 비필수 아미노산, 1% L-글루타민, 0.5% 페니실린/스트렙토마이신을 보충하여 사용하세요. 치료 전까지 구형 온도는 37°C,_CO2 5%로 유지하세요.
   참고: 그림 1A 는 참고문헌에서 구형 준비에 사용된 장비를 나타냅니다.

3. 세포 배양 및 처리

1. 2mL의 성장 배지를 포함한 조직 배양 6웰 플레이트에 ~10개의 구체체를 넣습니다.
2. 세포를 37°C에서 5%_CO2 가습 인큐베이터에서 배양합니다.
3. 구상체를 5 mM 부티르산나트륨으로 24시간 동안 처리하거나 대조군에 같은 양의 물을 추가하세요(그림 1B).

4. 세포 분리 및 단일 세포 현탁 준비

1. 치료 24시간 후, 37°C에서 1mL 트라이플LE를 3-5분간 배양합니다.
2. 피펫을 부드럽게 위아래로 움직여 구형이 분해되고 단일 세포가 나올 때까지 반복합니다.
3. 세포를 15mL 튜브에 담아 세척하고, 얼음처럼 차가운 1x PBS로 최대 10mL까지 희석한 후 500g에서 4°C에서 5분간 원 심분리한 후 상원액을 빼냄.
4. 세포를 얼음 냉각 1x PBS 1mL에 재현탁하고, 최종 농도는 1 μM인 Sytox 그린 죽은 세포 염색액을 첨가합니다.
5. Sytox Green과 함께 어두운 환경에서 얼음 위에 20분간 배양하세요.
6. 얼음 냉각 1x PBS 10mL로 세포를 세척하고, 500g에서 4°C에서 5분간 원심 분리한 후 상원액을 흡취합니다.
7. 세포를 얼음처럼 차갑게 넣은 1x PBS 1mL에 재현탁시키고, 최종 농도는 0.5%인 파라포름알데히드(PFA)를 첨가합니다.
8. 세포를 얼음 위에서 15분간 PFA로 배양하세요.
   참고: Sytox Green은 막 투과로 인해 고정과 일반적으로 호환되지 않지만, 세포의 경우 고정 후 최대 8시간까지 Sytox Green 세포의 비율이 동일하며 히스톤 단백질 누출 징후가 없음을 시험했습니다.
9. 얼음 냉각 1x PBS 10mL로 세포를 세척하고, 500g에서 4°C에서 5분간 원심 분리한 후 상원액을 흡취합니다.
10. 최종 농도인 200-500 세포/μL로 세포를 재구성합니다.
    참고: 침착이 잘 되지 않는 작은 세포는 500 cells/μL 농도가 권장되며, 침착이 잘 되는 큰 세포는 200 cells/μL 농도가 권장됩니다. 세포 현탁액이 응집에 취약한 경우, 흡인 전에 40μm 체에 걸어 노즐 막힘을 방지하세요. 40 μm 이상의 세포가 관심 대상이고 샘플 내에 존재할 가능성이 높다면, 70 μm 체를 사용해 매우 큰 응집체를 제거할 수 있습니다.
11. 셀은 분류할 때까지 얼음 위에 보관하세요.

5. 소프트웨어 연결 및 시스템 초기화

1. cellenONE 시스템을 켜고(그림 2A), 제어 컴퓨터를 부팅하고, 소프트웨어를 실행한 후 v2.0-nPOP2 사용자 작업 공간을 열어라; nPOP에 필요한 모든 필드 파일과 실행 템플릿이 미리 로드되어 있습니다.
2. 계측기의 칠러가 켜져 있는지 확인한 후, 계측기에서 현재 보고하는 내부 온도에 따라 이슬점 추적 값을 설정하세요.
3. PDC-70 코팅형 2 분배 노즐(그림 2B)을 슬롯 1과 3에 설치하여 화면에 표시된 지시에 따라 시스템을 프라이밍합니다.
4. 각 노즐의 펄스 폭과 구동 전압을 제조사 포장에 명시된 값으로 설정하세요.
   참고: 두 개의 별도 노즐을 사용하면 분배 일관성을 유지합니다: 하나는 셀 현탁을, 다른 하나는 시약을 전달하므로, 노즐에 부착된 이물질이 이후 낙하에 영향을 주지 않습니다. 최종 수집 단계에서 두 노즐을 모두 사용하면 샘플 회수를 가속화할 수 있습니다.
   1. (중요한 발걸음) 최대 픽업 효율을 위해 두 노즐 간의 z-오프셋은 <50 μm 차이가 있어야 합니다. 각 노즐의 최적 접촉 위치를 정의하고 노즐 설정 탭에서 Z-높이 측정값을 비교하여 이를 확인하세요.
5. 가습기 저장소에 표시된 주입선까지 탈이온화된 물을 채우세요.

6. 액체 핸들러의 사전 실행 구성

1. 준비할 유리 슬라이드의 수량(그림 2C)을 선택하세요. 이 선택은 분석할 셀의 총 수를 직접 정의합니다.
2. 2-플렉스 다중화 방식(그림 3A)의 경우, 320셀이 있는 단일 슬라이드를 로드합니다.

7. 슬라이드 가장자리 주변에 디메틸 설폭화물(DMSO) '해자'를 분사합니다

참고: 그림 3B 는 DMSO 해자에서 시작하여 cellenONE에서 샘플을 준비하는 단계를 나타냅니다. 방울 증발을 방지하기 위해 DMSO가 슬라이드 가장자리에 분사됩니다.

1. 메인 탭에서 0_Dispense_DMSO_Moat 런을 선택하세요.
2. Target Setup 탭으로 가서 적절한 scheme 폴더에서 DMSO_Moat.fld 파일을 불러와, 처리할 슬라이드 수와 일치하는 Y로 필드 수를 설정하세요.
3. LC-MS 등급 DMSO 150 μL을 새로운 PCR 튜브에 넣어 CellenWASH 스테이션 2번 위치에 넣고, 튜브 캡은 기기 문 쪽을 향하게 합니다.
4. 달리기 탭을 열고 실행 시작을 클릭하세요. 시스템은 10 μL DMSO를 흡입한 후 사용자가 액상 안정성을 확인하기 위해 잠시 정지합니다. 자동 낙하 시험 방울 3개를 발사합니다(그림 4A); 세 가지 모두 완벽하게 형성되어 있다면, 계속해서 실행을 클릭하세요.
5. 분배 후 노즐은 자동으로 플러싱되고, 기기는 모든 슬라이드에서 이미지를 캡처하여 품질 관리를 합니다. 모든 슬라이드에서 균일한 DMSO 방울이 있는지 확인하고, 누락되거나 표적에서 벗어난 방울이 있는지 확인하기 위해 이미지를 검토합니다(그림 4B).

8. DMSO 조제

1. 메인 탭에서 1_Dispense_DMSO 런을 선택하세요.
2. Target Setup 탭을 열고 적절한 스킴 디렉터리에서 필드 파일 DMSO.fld(그림 4C)를 가져오고, 처리하려는 슬라이드 수와 일치하는 필드 수를 Y로 설정하세요.
3. LC-MS 등급 DMSO 150 μL을 새로운 PCR 튜브에 넣어 CellenWASH 스테이션 2번 위치에 넣고, 튜브 캡은 기기 문 쪽을 향하게 합니다.
4. 달리기 탭을 열고 실행 시작을 클릭하세요. 시스템은 10 μL DMSO를 흡입한 후 사용자가 액상 안정성을 확인하기 위해 잠시 정지합니다. 자동 낙하 테스트 방울 3발을 발사하세요; 세 가지 모두 완벽하게 형성되어 있다면, 계속해서 실행을 클릭하세요.
5. 디스펜싱이 끝나면 소프트웨어가 노즐을 자동으로 세척하고 모든 슬라이드에 걸쳐 이미지를 캡처하여 품질 보증을 합니다. 모든 슬라이드에서 균일한 DMSO 방울이 있는지 확인하고, 누락되거나 목표에서 벗어난 방울이 있는지 확인하기 위해 이미지를 검토하세요.

9. 세포 분배

1. 메인 탭에서 2_Dispense_Cells 런을 선택하세요.
2. Target Setup 탭에서 선택한 다중화 방식 디렉터리의 Cells Field Files 하위 폴더를 엽니다.
3. 실험에는 두 가지 조건이 포함되어 있으므로, 정렬될 샘플과 일치하는 필드 파일을 선택하세요 - CellType_A.fld 또는 CellType_B.fld 중 하나입니다.
4. 파일이 로드된 후에는 필드 수를 Y로 설정하여 이번 실행 시 총 슬라이드 수와 같게 하세요.
5. 4.11단계부터 진공 펌프로 셀 현탁액을 얼음 위에서 10분간 제가스하세요.
6. 준비된 셀 현탁액 150 μL를 깨끗한 CellenVIAL에 옮긴 후, 캡이 기기 문 쪽을 향하도록 CellenWASH 회전목마의 슬롯 1에 바이알을 넣습니다.
7. 노즐 설정 탭> 작업 수행 탭으로 가서 바이알에서 샘플을 흡입하는 Take10ul_CellenVIAL_nozzle1을 실행하세요.
8. 노즐 설정 탭에 머무르고 셀 디스펜싱 뷰어(그림 5A)를 실행한 후 크기와 길이에 따라 배출 존과 게이트 객체를 정의하는 매핑 루틴을 실행하세요. 그림 5A에 표시된 단일 세포 분리 매개변수는 구상체에서 해리된 HepG2/C3A 세포를 분사하는 데 사용되는 정확한 설정과 일치합니다.
9. 그 다음 T > F를 선택하여 형광 모드를 활성화하세요. 선택 모드를 음으로 설정하세요. 크기와 강도에 대한 격리 매개변수 범위를 최소값에서 최대값으로 늘려 죽은 세포가 분리되지 않도록 합니다.
10. 매핑 매개변수로 확인하고, 실행 탭을 열고 실행 시작을 선택한 후 소프트웨어 안내를 따라 하세요. 분배가 끝나면 기기는 자동으로 노즐을 세척하고 슬라이드 이미지를 캡처하여 물방울 위치와 균일성을 검토합니다.
    참고: 셀 분류 중에는 실행 중 분리된 각 개별 셀의 이미지가 촬영됩니다(그림 5B).
11. 셀 분류가 끝나면 분배 창을 닫으세요.
12. 남은 셀 서스펜션은 섹션 9가 끝날 때까지 얼음 보관; 잉여분은 이후 벌크 샘플, 경험적 라이브러리 구축, 추가 검증 연구에 활용될 수 있습니다.

10. 소화 마스터 믹스 디스펜스

1. 메인 탭에서 2_Dispense_Digest_10ulPickup 런을 선택하세요.
2. Target Setup 탭을 열고 적절한 multiplexing-scheme 폴더에서 Digest.fld를 불러와, 필드 수를 Y로 설정해 이 실행 슬라이드 수와 같게 하세요.
3. 신선한 소화 마스터 믹스를 준비하고 진공 펌프로 얼음 위에서 10분간 용액을 제거하세요(마스터 믹스: ArgC Ultra 60 ng/μL, HEPES 6 mM, DDM 0.03%, DTT 10 mM LC-MS 등급 물에 담기).
4. 마스터 믹스 20 μL의 피펫을 384웰 플레이트에 넣고 플레이트를 X1 시스템 안에 넣습니다.
5. Run 탭에서 Start Run을 클릭하고 안내를 따라가세요. 시스템이 시약을 흡입한 후, 요청 시 액적 안정성을 확인합니다.
6. 디스펜싱이 끝나면 기기가 자동으로 노즐을 세척하고 모든 슬라이드를 촬영합니다; 각 방울이 소화 혼합물에 균일하게 공급되었는지 확인하기 위해 이미지를 검토하세요.
7. 소화를 위해 하룻밤 동안 배양하며 지정된 습도와 이슬점 설정을 유지하세요. 각 방울에는 ~13.5 nL의 소화 혼합물이 들어 있습니다. 소화는 ~75% 상대습도에서 하룻밤 동안 수행하며, 이슬점은 챔버 온도보다 1-2 °C 낮게 유지하여 방울 증발을 방지합니다.

11. 하룻밤 부화

1. 메인 탭에서 4_Incubation_16h 런을 선택하세요.
2. Run 탭으로 전환해서 Start Run을 클릭하세요.
   참고: 기기들은 30분마다 슬라이드 사진을 찍어 비말 상태를 모니터링합니다. 부화 중에 건조하거나 부풀면 필요에 따라 이슬점 설정을 조절하세요.
3. 인큐베이션이 완료되면 인큐베이션이 완료되었다는 메시지가 뜨게 됩니다.
   참고: 효소와 기질의 효율이 높은 조건에서 빠른 소화(≤4시간)가 가능할 수 있습니다; 이 부분은 여기서 평가되지 않았으므로 검증된 조건은 16시간으로 유지됩니다.

12. 증발

참고: 라벨링 단계로 넘어가기 전에, 물방울이 너무 부풀어 오르지 않았는지 확인하는 것이 좋습니다. 물이 라벨링 효율을 방해할 수 있기 때문입니다. 이를 위해 증발 단계가 권장됩니다.

1. 메인 탭에서 5_Evaporation 런을 선택하세요.
2. 파일, 냉각 장치 제어로 가서 이슬점 제어에서 고정 제어 온도를 23°C로 설정하세요.
3. Run 탭으로 전환해서 Start Run을 클릭하세요. 건조는 5분간 진행되며, 기구는 건조 후 자동으로 슬라이드 사진을 촬영합니다.
4. 사진을 살펴보세요; 물방울이 충분히 건조하면 흐름을 멈추세요. 그렇지 않으면 계속 을 클릭하고 5분 더 건조하세요(그림 6A).
5. 주행이 끝나면 이전 이 슬점 제어로 다시 전환하세요.

13. 라벨 배포

1. 메인 탭에서 6_Dispense_PA_Labels 런을 선택하세요.
2. Target Setup 탭으로 가서 적절한 scheme 폴더에서 Labels.fld 파일을 불러와, Field 수를 Y로 설정해 처리할 예정 슬라이드 수와 일치시키세요.
3. CellenWASH 스테이션 슬롯 2에 LC-MS 등급 DMSO 150 μL 분량을 분비합니다.
4. 두 개의 표지 스톡을 혼합한 스톡 용액을 준비하여 다중화 히스톤 유도화를 수행합니다: DMSO에 25%(v/v) 프로피온 무수물, DMSO에서 25%(v/v) 프로피온 무수물-d₁₀ .
   참고: 두 용액을 플레이트로 옮기기 전에 기포 형성을 최소화하기 위해 반드시 탈기를 하세요.
5. 각 라벨링 시약 20 μL을 384웰 플레이트의 지정된 웰에 분사한 후 플레이트를 X1 시스템 내부에 배치합니다. 각 방울은 표지 시약 ~10 nL(25% 프로피온 무수물 또는 25% 프로피온 무수물-d₁₀ DMSO)를 받습니다.
6. Run 탭으로 전환해 Start Run을 클릭한 후 안내를 따라 하세요.
7. 슬라이드에서 1시간 동안 라벨이 반응하도록 두세요.
8. 분배 후 기기는 자동으로 노즐을 세척하고 모든 슬라이드를 촬영합니다. 이미지를 검토하여 모든 슬라이드에 고르게 분포하고 방울 위치가 정확한지 확인하세요.

14. 하 디스펜스

1. 사용 전에 HA 용액을 준비하고 가스를 제거하세요.
2. 바이알을 장전해. HA 용액 150 μL을 깨끗한 PCR 튜브에 피펫팅한 후 CellenWASH 슬롯 2에 위치시키고, 캡을 기기 문 쪽으로 향하게 합니다.
3. 런 프로필을 선택하세요. 메인 탭에서 7_Dispense_Quench를 선택하세요.
4. 필드 파일을 구성하세요. Target Setup 탭을 열고 적절한 multiplexing-scheme 폴더에서 HA.fld를 불러와, 필드 수를 Y로 설정해 총 슬라이드 수와 같게 하세요.
5. 달리기 시작해. 달리기로 이동해 실행 시작을 클릭한 후 화면에 표시되는 지시를 따라가세요.
6. 인큐베이팅. HA가 슬라이드에 반응하도록 30분간 두세요.
7. 조제 확인. 완료 후 시스템은 노즐을 세척하고 각 슬라이드의 이미지를 캡처하여 방울 위치와 부피의 균일함을 확인합니다.

15. 샘플 픽업

1. WashTray XL에 세척액을 준비하세요.
2. 헌금함 준비해. 신선한 384웰 플레이트의 각 웰에 0.01% (w/w) DDM 2μL LC-MS 등급 물을 투여한 후 플레이트를 액체 핸들러 안에 넣습니다.
3. 픽업 런을 선택하세요. 메인 탭에서 프로필 8_Pickup_2plex을 선택하세요.
4. 필드 파일을 불러와. Target Setup 탭을 열고 올바른 다중화 방식 디렉터리에서 Pick-up.fld를 가져오고, 필드 수를 Y로 설정해 슬라이드 수와 일치하게 하세요.
5. 실행해. Run 탭으로 전환해 Start Run을 클릭한 후 안내를 따라 하세요. 기기는 각 방울을 수집하고 노즐을 세척한 뒤, 모든 샘플이 채취되었는지 확인하기 위해 슬라이드를 촬영합니다.

16. 픽업 후 처리

1. 384 웰 플레이트를 접착 호일로 잠시 밀봉하고 원심분리기를 통해 방울을 웰 바닥으로 끌어들입니다.
2. 호일을 제거하고 진공 농축기에서 저온으로 샘플을 건조하세요.
3. 접착 호일로 판을 밀봉한 후 건조판을 -80 °C에서 보관하여 LC-MS/MS 분석을 위해 준비하세요.

17. 벌크 샘플 준비

1. 9구역에서 남은 현탁액을 사용해 셀을 스핀다운하고 1배 PBS에 재현탁하여 2,000 셀/μL의 농도를 얻습니다. 이는 섹션 10을 완료한 후에 수행되어야 합니다.
2. 열분해: 남은 현탁을 -80°C에서 10분간 급동시키고, 90°C에서 10분간 열충격을 가합니다.
3. 튜브를 실온으로 식히세요.
4. 25 μL 용해액을 PCR 튜브에 옮기고 미리 준비한 소화 혼합물 5 μL을 추가합니다.
5. 열 사이클러에서 37°C에서 하룻밤(≈ 16시간) 배양하세요.
6. 라이트 라벨 유도화: 신선한 25%(v/v) 빛 표지 5μL를 아세토니트릴에 첨가하고 1시간 배양합니다.
7. 반응 담금: 1% (w/w) 하이드록실아민(HA) 용액 5 μL를 추가하고 30분간 배양합니다.
8. 샘플을 진공 농축기에서 저온으로 건조한 후 -80 °C에서 보관하여 LC-MS/MS 준비를 마칩니다.

18. LC/MS 설정 및 데이터 수집

참고: 이 원고의 데이터를 수집하기 위해, 75 μm 내경 x 25 cm x 1.7 μm 분석 컬럼을 가진 이온 광학 시스템을 구성한 LC-MS\MS 시스템을 사용합니다.

1. HPLC에서 작동할 이동 단계를 준비하세요:
   이동형 A상 (MPA): HPLC 등급 물에 0.1% 개미산
   이동성 B 상(MPB): HPLC 등급 아세토니트릴에 0.1% 개산 함유
2. HPLC 방법을 30분 활성 구배에 맞춰 프로그래밍하세요: 25.7분 동안 5-23% MPB, 2.6분 동안 23-35% MPB, 1.7분 동안 35-45% MPB, 200 nL/분의 유량으로 진행됩니다. 오토샘플러를 0.1% FA + 0.01% DDM으로 재현탁하도록 프로그래밍하여 '드라이' 채취 시를 적용하세요.
3. 데이터 독립적 획득(DIA)을 수행하기 위해 MS 획득 방법을 설정하세요:
   참고: 이 설정은 FAIMS Pro Duo가 장착된 Thermo Exploris 480에 특화된 것이며, 악기에 따라 다를 수 있습니다. 아래에서 설명한 m/z 범위와 유사한 DIA 단세포 단백질체학에서 흔히 사용되는 검사를 사용하는 것이 권장됩니다.
   1. MS를 300-1100 m/z 완전 스캔, 해상도 120,000, AGC 목표 300%, 최대 주입 시간 246ms, FAIMS CV -50 V로 설정하세요.
   2. MS/MS는 300-1100 m/z 범위의 DIA 스캔, 해상도 60,000, 격리 윈도우 50 m/z, HCD 충돌 에너지 27%, 첫 질량 120 m/z, AGC 타겟 1000%, 최대 주입 시간 118 ms, FAIM CV -50 V로 설정하세요.
4. 단일 셀을 포함하는 384웰 플레이트의 호일 씰을 제거하세요. 0.1% FA + 0.01% DDM에서 100 셀/μL로 대량 샘플을 재구성하고, 10 μL을 P24와 같은 빈 우정에 옮깁니다. 그 후 피어싱 가능한 고무 매트로 플레이트를 밀봉하고 오토샘플러에 넣습니다.
5. 큐업 실행: 먼저 대량 샘플을 실행한 후 단일 셀 집합을 실행합니다.

19. 데이터 분석

1. EpiProfile2.1로 원시 데이터를 실행하면, 프로피온 무수물로 표지된 세포의 펩티도폼 풍부도 출력을 얻으세요.
   참고: 데이터 처리에 EpiProfile 2.1을 사용하려면 샘플을 열(Thermo) 기기에서 채취해야 합니다. 이 소프트웨어는 표준 버전으로 약 250개의 펩티도폼을 추출하지만, 생물체, 관심 있는 추가 변형, 돌연변이 등에 따라 편집 가능하다.¹².
2. 원시 데이터를 EpiProfile2.1_D5와 함께 실행하여 프로피온 무수물-d10으로 표지된 세포의 펩티도포름 풍부도 출력을 얻으세요.
3. 양자품질 검사 프로그램에서 메타데이터와 에피프로필 출력을 연결하는 매핑을 수행합니다.
4. 빈 샘플과 비교하여 실패한 샘플을 걸러내세요.
5. 샘플의 최소 50% 이상에 포함되지 않는 펩티도폼을 걸러내세요.
6. 단일 세포 강도 신호가 빈 세포의 150% 신호보다 크지 않은 펩티도폼을 걸러냅니다.
7. 결과 표(그림 7A)를 얻고 필요에 따라 데이터를 추가로 처리하세요.

Results

저희 시스템을 이용한 단일 세포 히스톤 단백질체학 워크플로우의 적용을 시연하기 위해, 5 mM 부티산나트륨으로 처리된 HepG2/C3A 세포의 구형체를 24시간 동안 분석했습니다. LC-MS/MS 획득 후, 원시 데이터를 EpiProfile으로 처리하여 경(프로피온 무수물) 및 무(프로피온 무수물-d10) 표지가 모두 이루어졌으며, 펩타이드와 히스톤 표지의 풍부도를 나타내는 정규화된 데이터를 얻었습니다. 이후 QuantQC R 패키지를 사용해 액체 핸들러의 획득 메타데이터를 EpiProfile 출력에 매핑하여 각 세포의 펩타이드 함량과 관련 풍부도 정보를 얻었고, 단일 세포의 최소 50%에서 일관되게 검출되지 않은 펩티도폼을 필터링하고, 단일 세포 강도 신호가 빈 세포의 150% 신호보다 크지 않은 펩티도폼은 제외했습니다. 데이터는 이후 log(1+x) 변환을 통해 정규화되어 후속 분석에 사용되는 결과 표를 얻었는데, 이 표는 다양한 펩티도폼이 나타난 열과 각 개별 셀별로 식별된 펩티도폼의 풍부도를 포함한 열로 구성되어 있습니다...

Discussion

단일 세포 수준에서 히스톤 번역 후 변형을 측정할 수 있는 능력은 염색질 조절의 진정한 이질성을 이해하는 데 중요한 진전입니다. 전통적인 대량 방법은 조직 간 hPTM의 평균 분포에 대한 귀중한 통찰을 제공했지만, 점점 더 생물학적으로^{의미 있는 것으로} 인식되는 세포 간 변동성을 가립니다5. 단세포 단백질체학적 접근법은 이제 이 숨겨진 복잡성을 해소할 수 있게 해주며, 유전자 조절의 차이, 세포 가소성, 질병 취약성의 기저가 될 수 있는 뚜렷한 염색질 상태를 밝혀냅니다^. 히스톤 변형은 전사 결과를 지시하는 조합 정보를 암호화하기 때문에 단일 세포 조사에 특히 적합합니다¹³. 예를 들어, H3K9ac와 H3K14ac 마크가 동시에 존재하는 것은 이 중 하나보다 전사 활성화를 더 강력하게 나타내는 지표입니다¹⁰

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL 마이크로 원심분리관	바이오-래드	2239480
1000 & 마이크로; L 와이드 보어 피펫 팁	피셔 사이언티브	14222703
200 & 마이크로; L 와이드 보어 피펫 팁	피셔 사이언티브	14222730
384웰 PCR 플레이트 Lo Bind	에펜도르프	30129547
96웰 진공 매니폴드	밀리포어	MAVM0960R
아세토니트릴, 옵티마 LC-MS/MS 등급	피셔 사이언티브	A955-1
접착식 PCR 플레이트 포일	써모피셔	AB0626
무수성 아세토니트릴	피셔 사이언티브	AA42311AK	라벨 재고 용액 대용량
Arg-C 울트라, 질량 사양 등급	프로메가	VA1831
세포 배양 등급 물에 사용해	코닝	25-055-CV
셀렌비알(CellenVIAL)	스키니온	/	카탈로그 번호에는 인용문이 포함되어 있습니다
DMSO, 무수성	써모피셔	D12345	라벨 스톡 솔루션
DTT	시그마	D0632-5G
둘벡코의 변형 독수리 미디엄 (DMEM)	피셔 사이언티브	MT17205CV
태아 소 혈청	피셔 사이언티브	MT35010CV
개미산	열학	28905
개미산 98% – LC-MS 리크로푸르에 100% 동의합니다	시그마	5330020050
행크의 밸런스 소금 솔루션 (HBSS)	피셔 사이언티브	MT21022CV
HEPES (울트라 퓨어)	써모피셔	11344041
HPLC 등급 아세토니트릴	피셔 사이언티브	A955-4
HPLC 등급 물	피셔 사이언티브	W5-4
하이드록실아민 용액은 H2O 내 50 wt. %	시그마	438227-50ML
L-글루타민	피셔 사이언티브	MT25015CI
n-도데실-베타-말토사이드(DDM) 세제	피셔 사이언티브	BN2005
비필수 아미노산	피셔 사이언티브	MT25025CI
오비트랩 익스플로리스 480 질량분석기	써모피셔	BRE725539
파라포름알데히드 16% 수용액 EM 등급	전자현미경 과학	15710-S
PDC-CM (타입 2 코팅)	스키니온	/	카탈로그 번호에는 인용문이 포함되어 있습니다
페니실린-스트렙토마이신	피셔 사이언티브	MT3002CI
인산염 완충 식염수(PBS), 10배, pH 7.4, RNase 무첨가	써모피셔	AM9625
피어스 디메틸설폭사이드(DMSO), LC-MS 등급	써모피셔	85190
피펫 건	에펜도르프	Z666467 (밀리포어 시그마)
프로피온 무수물과 Ge; 99%	시그마	240311-50G
프로피온 무수물-d10 ≥ 98 원자 % D, 그리고 ge; 99% (CP)	시그마	615692-1G
냉장 원심분리기	열학	75-217-420
SciCHIP H1 코팅 유리 슬라이드	스키니온	/	카탈로그 번호에는 인용문이 포함되어 있습니다
SpeedVac 진공 집중기 (96웰 플레이트)	열학	15308325	천재 SPD1010
멸균 후드	열학	1375
멸균 혈청 피펫	피셔 사이언티브	1367549
SYTOX 그린 데드 셀 스테인, 유세포검사용	써모피셔	S34860
TrypLE Express 효소 (1X), 페놀 레드 없음	써모피셔	12604013
소용돌이	시그마	Z258415
물욕	피셔 사이언티브	FSGPD10