란소프라졸은 뇌내출혈 마우스 모델에서 장 손상을 완화 하여 장기적인 신경학적 기능을 향상시킵니다

요약

콜라겐제 유도 생쥐 모델의 뇌내출혈(ICH)을 란소프라졸로 치료하였다. 란소프라졸은 ICH로 인한 장 손상을 완화하고 지지다당(LPS)과 IL-1β 수치를 낮췄을 뿐만 아니라 뇌 염증도 억제했습니다. 란소프라졸은 ICH 마우스의 학습 및 기억(장기 신경 기능)을 향상시켰습니다.

초록

뇌내출혈(ICH)은 위장관을 손상시키고 장 손상을 유발하여 임상 결과 저하에 기여할 수 있습니다. 이 연구는 ICH 마우스에서 란소프라졸이 장 손상과 신경 기능에 미치는 영향을 조사하였습니다. 마우스에 콜라겐제를 입체주사하여 ICH 모델을 구축하였습니다. 신경 기능, 뇌수분 함량, 혈뇌장벽 투과성, 장 손상 및 장 투과성을 평가하였다. 혈액과 뇌 내 LPS와 IL-1β 수치도 검사하였다. 란소프라졸 치료는 ICH 마우스에서 장 손상 완화, 혈액 및 뇌 내 LPS 및 IL-1β 수치 감소, 뇌 수분 감소, 뇌 염증 억제와 연관이 있었습니다. 란소프라졸 투여는 가르시아, 전肢 배치, 로타로드 검사(단기 신경 기능)에서 성능 향상을 가져오지는 않았으나, 학습과 기억력(장기 신경 기능)을 크게 향상시켰습니다. 이 결과는 란소프라졸 치료가 ICH 마우스에서 장기 신경학적 결과 개선과 장 손상 감소와 연관됨을 시사하였습니다.

서론

출혈성 뇌졸중은 높은 사망률과 장애율을 보입니다. 최근 중국에서 뇌졸중 유병률이 증가하여 사망 원인의 주요 원인이 되었습니다^. 비록 덜 흔하지만, 뇌내출혈(ICH)은 허혈성 뇌졸중보다 현저히 더 치명적입니다. 연구들은 ICH 발생 후 1개월 내 사망률이 40%로 보고되어 있습니다; 더불어, 약 75%의 생존자가 1^{년 후 독립}적으로 생활할 수 없다고 합니다.

뇌는 미주신경, 장내 신경계, 장내 미생물 대사 등 여러 경로를 통해 위장관과 소통합니다. 뇌-장 축은 잘 알려져 있고 임상적으로도 중요한 조절 시스템입니다³. 장 점막은 수분, 전해질, 영양분의 흡수를 조절하면서 병원체와 독소가 혈류로 유입되는 것을 방지합니다. ICH는 이 장 장벽을 손상시켜 위장 손상을 유발할 수 있습니다. 장벽 기능 장애는 영양실조, 면역 억제, 그리고 낮은 임상 결과 등으로 이어^집니다. ICH로 인한 장 투과성 증가는 유해 내인성 물질이 혈류로 들어오게 하여 전신 염증 반응과 다기관 기능 장애 증후군을 유발합니다. ICH 후 장 점막 손상은 장내 세균이 혈류로 이동할 수 있게 하여 전신 감염으로 이어질 수 있습니다⁵. 많은 환자들이 장 운동 이상, 미생물 이혼, 점막 출혈, 패혈증을 겪습니다. 이전 연구에서는 ICH가 장내 병원체와 독소를 뇌로 이동시키는 원인이 있음을 보여주었습니다^.

란소프라졸은 양성자 펌프 억제제(PPI)로, 양성자 펌프를 돌이킬 수 없이 억제하여 위산 분비를 감소시킵니다. 위장 및 십이지장 궤양, 부식성 식도염, 위식도 역류 질환, 비스테로이드 항염증제 관련 위궤양 치료에^{사용됩니다.} 이전 연구에 따르면 PPI 예방요법이 허혈성 뇌졸중 환자의 결과에 부정적인 영향을 미친다는 결과가^나타났습니다. 다른 발표된 연구들은 PPI 사용과 인지 저하 사이의 연관성을 제안했습니다. 역학 연구에 따르면 PPI를 투여받은 환자들은 치매와 알츠하이^{머병 발}병 위험이 증가했습니다. 장기 PPI 사용자와 비사용자 비교한 전향적 코호트 연구에서는 PPI 사용이 치매 위험 증가와 연관되어 있음을 발견했으며, 저자들은 위험군 환자에게는 예방 조치로서 PPI 사용을 권장하지 않았습니다¹⁰. 본 연구는 ICH 마우스의 장 손상뿐만 아니라 단기 및 장기 신경 기능(특히 학습 및 기억)에 대한 란소프라졸의 영향을 조사하기 위해 수행되었습니다. 우리는 란소프라졸이 장 장벽 보호 효과로 인해 LPS의 투과를 억제하여 전신 및 신경학적 염증을 완화하고, 따라서 ICH 마우스의 신경 기능을 개선할 수 있다고 가설을 세웁니다.

프로토콜

이 실험들은 미국 국립보건원(NIH) 실험동물 관리 및 사용 가이드(NIH 출판물 번호 8023, 1978년 개정)에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 옌타이대학교 윤리위원회(승인 번호)에서 승인되었습니다. YTDX20240526). 유해 물질은 기관의 화학 폐기물 처리 프로토콜에 따라 처리되었습니다. 그림 1 은 실험 설계의 회로도를 보여줍니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 동물 관련 정보

22-25g의 수컷 CD-1 쥐는 12시간/12시간 빛/어둠 주기가 있는 방에 보관되었습니다. 동물들은 자유롭게 음식과 물을 얻을 수 있었다.

2. ICH 마우스 모델 준비

ICH의 마우스 모델은^{이전 보고서에} 따라 확립되었습니다. 간단히 말해, 쥐들은 자일라진(10 mg/kg)과 케타민(90 mg/kg)으로 마취한 후 입체 정체 프레임에 위치시켰습니다. 오른쪽 관상봉합선(정중선 외측 2.2mm, 브레그마 뒤쪽 0.2mm)에 작은 버 홀이 뚫렸다. 마이크로 주사기가 두개골 표면에서 3.5mm 깊이의 우뇌에 삽입되었다. 마이크로 인퓨전 펌프를 사용해 0.15 μL/분의 속도로 0.15 μL의 박테리아 콜라겐제(0.075 U in 0.5 μL 인산 완충 식염수[PBS])를 주입했습니다. 5분 후 바늘을 부드럽게 뺐습니다. 가짜 그룹의 쥐들은 콜라겐제 대신 동등한 양의 PBS를 받았습니다. 버 홀을 뼈 왁스로 봉합하고, 두피 절개 부위를 봉합했습니다. 동물의 체온은 각성 전까지 37°C로 유지되었다.

3. 실험 설계

수컷 CD-1 쥐는 샴, 모델, 란소프라졸의 세 그룹에 무작위로 배정되었습니다. 위에서 설명한 대로 ICH 모델이 확립되었습니다. ICH 유도 30분 후, 란소프라졸 그룹 쥐들은 30 mg/kg 용량의 란소프라졸(이전 보고서¹²에 따라 선정됨)으로 3일 연속 하루 1회 투여했습니다. 가짜 및 모델 그룹의 쥐들은 복강 내 PBS 주사를 받았습니다. ICH 발생 3일째에 Garcia 검사, 전肢 위치 검사, 로타로드 검사를 통해 단기 신경 기능을 평가하였습니다. ICH 유도 후 29일째에는 장기적인 신경 기능을 평가하기 위한 새로운 물체 인식 및 수중 미로 검사가 실시되었습니다.

4. 가르시아 검사

두 명의 연구자가 그룹을 눈가리키지 않은 채, 이전에 보고된 프로토콜¹³에 따라 가르시아 검사를 수행했습니다. 신경 기능은 0에서 21까지의 점수 체계로 평가되었습니다. 평가는 7개의 하위 검사로 구성되며, 각각 0에서 3 사이(0 = 최악, 3 = 최고 점수)로 구성됩니다.

5. 앞다리 위치 검사

가르시아 검사 이후, 앞다리 위치 검사는 앞서 설명한 방법¹⁴에 따라 수행되었습니다. 쥐들은 테이블 상판과 평행하게 수직으로 잡혀 비브리세이가 표면을 스치도록 했습니다. 앞쪽 위치는 10회의 연속 시험에서 관찰되었습니다. 왼쪽 전肢 위치 비율은 다음과 같이 계산되었습니다: 왼쪽 전肢 위치 / (왼쪽 앞다리 위치 + 오른쪽 앞다리 위치) × 100%.

6. 로타로드 시험

앞다리 위치 테스트 후, 쥐들은 5분간 회전하는 막대에 3분간 훈련을 위해 올려졌습니다. 로드는 4분 만에 5rpm에서 30rpm으로 가속되었습니다. 각 쥐가 막대에 머문 시간은 5분 동안 기록되었고, 탈출 잠시는¹⁵로 기록되었습니다.

7. 장 투과성 및 뇌부종 검사

로타로드 테스트 후, 각 그룹에서 무작위로 6마리의 쥐가 선정되었습니다. 이전 방법¹⁶에 따르면, FITC-덱스트란은 위내 투여 용량 300 mg/kg이었습니다. 3시간 후, 마우스들은 이소플루란으로 마취되었고, 후방안도 정맥신경총에서 혈액을 4°C, 11,000 g × 원심분리하여 5분간 측정했습니다. FITC-덱스트란 함량은 형광판 리더기를 사용해 485nm 여기와 528nm 방출 파장으로 분석했습니다. 동물들은 목을 잘렸고, 뇌의 오른쪽 반구를 채취해 무게를 측정하여 젖은 무게를 얻었다. 조직은 100°C에서 24시간 건조되어 건조 중량을 측정했습니다. 뇌 수분 함량(%)은 [(습식 중량 − 건조 중량) / 습식 중량] × 100%로 계산되었습니다.

8. 혈액-뇌장벽(BBB) 투과성 평가

로타로드 테스트 후, 각 그룹에서 무작위로 6마리의 쥐를 선정하여 BBB 투과성을 평가했다. 2% 에반스 블루 용액을 복막 내 4 mL/kg로 투여하였다. 3시간 후, 쥐들은 이소플루란으로 마취되었고, PBS를 이용한 경심관 관류가 시행되었습니다. 뇌의 오른쪽 반구는 3:1 비율로 50% 트리클로로아세트산에 균질화되었다(뇌 조직: 트리클로로아세트산). 호모지네이트는 15,000 × g , 4 °C에서 20분간 원심분리되었습니다. 그 후 500 μL 상청액과 70% 에탄올 500 μL을 혼합하여 4 °C에서 어두운 환경에서 하룻밤 배큐했습니다. 에반스 블루의 농도는 610nm에서 측정되었고 표준 곡선을 사용해 정량화되었습니다. 데이터는 뇌 조직 1mg당 에반스 블루 μg 단위로 제시됩니다.

9. 장과 뇌의 조직병리학적 검사

로타로드 테스트 후, 각 그룹에서 무작위로 세 마리의 쥐를 선정했습니다. 마우스들은 이소플루란으로 마취되었습니다. 공주, 회장, 뇌를 채취하여 10% 포름알데히드에 고정했습니다. 조직은 두께 5μm로 절개되었고, 헤마톡실린-에오신(HE) 염색이 시행되었습니다. 장과 뇌의 조직병리학적 검사는 두 명의 실험자가 그룹 과제를 눈가리키지 않고 현미경으로 수행했습니다. 혈종을 둘러싼 미소교세포 수는 대표적인 절편으로 집계되었다. 세포 수는 동물당 세 개의 구역에 걸쳐 다섯 개의 임의의 시야에서 수행되었습니다.

10. LPS와 IL-1β의 측정

로타로드 테스트 후, 각 그룹에서 무작위로 6마리의 쥐가 선정되었습니다. 쥐들은 이소플루란으로 마취되었고, 혈액을 채취했습니다. 혈액 샘플은 5,000 × g , 4 °C에서 10분간 원심분리한 후 혈청을 채취했다. 뇌의 오른쪽 반구를 채취하여 뇌 균질 물질을 1:3(뇌 무게 1그램 대 PBS 부피 밀리리터 비율)으로 준비했습니다. 동질체는 12,000 × g , 4 °C에서 10분간 원심분리되었습니다. 상액 내 단백질 농도는 BCA 키트를 사용해 측정하였습니다. 혈청과 뇌 균질제 내 LPS와 IL-1β 수치는 제조사의 지침에 따라 ELISA 키트를 사용해 측정하였습니다.

11. 투과전자 현미경

전자현미경 검사를 위해 각 그룹에서 세 마리의 동물을 로타로드 테스트 후 무작위로 선정했습니다. 쥐들은 이소플루란으로 마취를 받고 2% 글루타알데히드와 2.5% 파라포름알데히드를 0.1 M PBS에 투여한 경심 관류를 받았다(기관에서 승인한 프로토콜에 따라). 뇌, 공주장, 회장은 채취하여 2% 글루타알데히드에 0.1M 카코딜레이트 완충제(pH 7.4)에 4°C에서 하룻밤 동안 넣었다. 샘플들은 이후 1% 오스뮴 테트로옥사이드에 상온에서 1시간 동안 옮겼습니다. 조직은 초박방(50nm) 절단되었습니다. 탈수 후에는 우라닐 아세테이트와 시트레이트 납으로 염색하여 투과전자 현미경으로 관찰했습니다. 모든 절편은 블라인드 방식으로 평가되고 투과전자현미경으로 촬영되었습니다.

12. 새로운 객체 인식

ICH 모델링 29일째에 쥐의 학습 및 기억 기능을 평가하기 위해 새로운 물체 인식 검사가 수행되었습니다. 첫날에는 기기에 아무것도 넣지 않았으며(길이: 40cm, 너비: 40cm, 높이: 40cm), 쥐들이 5분간 자유롭게 탐색할 수 있었습니다. 둘째 날에는 동일한 물체 두 개를 장치에 넣고 쥐들이 5분간 탐색하도록 허용했습니다. 24시간 후, 그 물체 중 하나가 새로운 물체로 교체되었다. 쥐들은 다시 5분간 두 물체를 탐색했습니다. 탐색 시간은 쥐의 코가 물체에 닿거나 머리가 1cm 이내의 물체를 향해 향했을 때 기록되었습니다. 새로운 물체를 탐사하는 데 소요된 시간은 측정되고 계산되었다. 새로운 물체를 탐험하는 시간이 길수록 학습 능력과 기억력이 더 좋아집니다.

13. 모리스 워터 미로

ICH 모델링 32일째에 모리스 워터 미로를 사용해 학습 및 기억 기능을 평가하였습니다. 이 장치는 원형 웅덩이(직경: 100cm, 높이: 40cm)와 깊이 25cm의 물이 채워져 22°C± 1°C로 유지되는 형태였습니다. 탈출 플랫폼(직경: 9cm)은 수면 아래 1cm 깊이에 잠겨 있었다. 항해 테스트에서는 쥐들이 하루에 네 번의 실험을 받았다. 플랫폼을 찾는 데 걸린 시간은 탈출 지연 시간으로 기록되었습니다. 60초 이내에 플랫폼을 찾지 못한 쥐들은 부드럽게 유도되었습니다. 5일째에는 60초 탐사 시험이 실시되었다. 메모리 기능은 탈출 지연, 플랫폼 통과 횟수, 목표 사분면에서 머무는 시간을 기록하여 평가했습니다. 데이터는 비디오 추적 소프트웨어를 사용해 분석되었습니다.

14. 통계 분석

데이터는 GraphPad 프리즘 소프트웨어 버전 7.0을 사용하여 분석되었습니다. 결과는 표준편차± 평균으로 제시됩니다. 샤피로-윌크 검정은 각 그룹의 데이터가 정규 분포를 따르는지 평가하는 데 사용되었다. 그룹 간 차이는 일원 ANOVA와 Tukey의 사후 검사로 분석되었습니다. 비모수 비교에는 Kruskal-Wallis 검정 뒤에 던스 검정을 사용했습니다. p 값 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

결과

ICH 마우스에서 란소프라졸이 단기 신경 기능에 미치는 영향

가짜군과 비교했을 때, ICH 그룹의 쥐들은 가르시아 검사에서 유의하게 낮은 점수를 보였다(p < 0.01). 그러나 란소프라졸 그룹의 쥐들은 ICH 그룹에 비해 가르시아 점수가 개선되지 않았습니다(p > 0.05)(그림 2A). 마찬가지로, ICH 그룹에서 왼쪽 전肢 위치 비율이 가짜 그룹에 비해 유의하게 감소했습니다(p < 0.01). 가르시아 검사 결과와 일치하게, 란소프라졸 치료는 왼쪽 전肢 위치 비율을 증가시키지 않았습니다(p > 0.05)(그림 2B). 로타로드 테스트에서는...

토론

장 손상은 ICH 환자에서 흔히 발생하는 합병증입니다. ICH로 인한 장 손상은 영양실조, 장기 입원, 불화, 심지어 사망까지 초래할 수 있습니다¹⁷. ICH 동물 모델을 사용하여 이 연구는 처음으로 란소프라졸이 ICH 생쥐에서 장 손상을 완화한다는 것을 입증했습니다. 란소프라졸은 단기적인 신경학적 기능에 유익한 효과를 보이지는 않았으나, 장기적인 신경학적 결과를 유의미하게 개선했습니다.

허혈성 또는 출혈성 뇌졸중은 전 세계적으로 주요 사망 원인 중 하나입니다. 뇌졸중 후 신체는 전신 스트레스 반응을 겪으며, 이는 뇌 밖 장기의 병리적 변화를 유발할 수 있습니다. 장은 이러한 전신 반응의 주요 표적 중 하나입니다. 임상적으로 뇌졸중으로 인한 소화 증상인 점막 손상, 복부 팽창, 변비가 흔히 관찰됩니다^18,19

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BCA 키트	비요타임 바이오테크놀로지컬	P0009
콜라겐제	시그마-올드리치	128M4107v
에반스 블루 염료	시그마-올드리치	MKCG7507
FITC-덱스트란	시그마-올드리치	46944
그래프패드 프리즘 7.0	GraphPad 통계 소프트웨어, 보스턴, MA, 미국, www.graphpad.com	프리즘 7.0
란소프라졸	산둥 유신 제약유한회사.	524093053
LPS ELISA 키트	쿠사비오 바이오텍 주식회사	M25036407
쥐들	진남펑월 실험동물 육종 주식회사	SCXK20220006
마이크로 인퓨전 펌프	월드 프리시전 인스트루먼트	마이크로 3
마이크로시린기와 nbsp; 그리고 nbsp;	해밀턴 컴퍼니	시르 10 & 뮤; L
올림푸스 현미경	올림푸스 주식회사	IX-70
로타로드	판랩 주식회사	LE8205
입체 택시 프레임	코프 악기	모델 902-A
TNF-&α; ELISA 키트	비요타임 바이오테크놀로지컬	PI301
투과 전자현미경	JEOL  Ltd.	JEM-100SX
비디오 추적 소프트웨어	판랩 주식회사	스마트 3.0