방법 논문

CD63-GFP 리포터 마우스 모델을 이용한 지방세포 유래 세포외 소포 분비물의 특성 규격 연구(in vivo 및 in vitro)

DOI:

10.3791/69670

⸱

2025년 12월 5일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 2Fleischer Institute for Diabetes and Metabolism, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 6Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 지방세포 특이적 CD63-GFP 리포터 마우스 라인을 사용하여 지방세포 유래 세포외 소포(EV)의 분비를 시각화하고 정량화하며, 전구세포에 의한 흡수를 입증하여 지방 조직 내 파라크린 경로를 밝혀냅니다.

초록

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지방세포는 단백질, 지질, 핵산이 풍부한 EV를 상당량 분비하는 활성 내분비 세포로 점점 더 인식되고 있습니다. 그러나 EV 분비 메커니즘과 다양한 생물학적 맥락에서의 EV 방출 역학은 완전히 이해되지 않았습니다. 이 격차를 해소하기 위해, 우리는 GFP 표지 CD63의 발현이 아디포넥틴 프로모터에 의해 구동되는 새로운 지방세포 특이적 CD63-GFP 리포터 마우스 계통을 개발하여, 생체 내에서 AdEVs의 선택적 표지 및 추적이 가능해졌습니다. 이 리포터 모델을 사용하여 우리는 지방 조직 내 AdEV의 분비와 이를 APC로 전달하는 과정을 조사했습니다. 공초점 영상과 유세포 분석 결과, AdEV가 APC에 의해 적극적으로 흡수된다는 사실이 밝혀져, 지방 미세환경 내에서 파라크린 소통의 기전이 과소평가되었음을 강조합니다.

생 체 내 연구를 보완하기 위해, 분화된 지방세포의 EV 분비를 직접 모니터링할 수 있는 시험관 내 시스템이 구축되었습니다. APC는 리포터 마우스의 피하 백색 지방 조직에서 분리되어 성숙한 지방세포로 분화하도록 유도하였다. 이 세포들에서 CD63-GFP 신호는 이산된 지점으로 관찰되었으며, EV 분비가 억제될 때 원형질막에서 농축되었는데, 이는 차단된 방출 시 소포 축적과 일치합니다. 정상적인 성장 조건에서 배양지에 분비된 EV는 농축된 후 크기 배제 크로마토그래피를 사용해 정제하여 후속 기능 및 생화학적 분석을 가능하게 했습니다.

이 플랫폼은 부고체 백색 및 갈색 지방 조직과 같은 다른 지방 저장소에서 유래한 APC에 적용하거나, 저장소별 지방세포로 구분하여 서로 다른 지방세포 유형 간 EV 분비를 비교할 수 있게 합니다.

이 방법들은 함께 강력한 유전 도구와 상호 보완적인 시험관 내 시스템을 도입하여 AdEV 분비 및 표적 역학을 분석합니다. 이러한 진전은 지방 내 세포 간 소통에 대한 조명을 제공하며, AdEV가 건강과 질병에 미치는 광범위한 대사 영향을 이해하는 데 기반을 다집니다.

서론

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지방 조직은 전신 에너지 항상성(1,2,3,4,5)에서 핵심적인 역할을 하는 역동적인 내분비 기관으로 점점 더 인식되고 있습니다. 지방 세포는 고전적인 지질 저장 저장소 기능을 넘어 전신 인슐린 감수성을 조절하며, 지방 질량의 교란—과잉 또는 결핍—은 인슐린 저항성과 대사 질환과 연관되어 있습니다 6,7,8,9. 이러한 조절 능력에 기여하는 한 가지 메커니즘은 분비 인자를 통한 세포 간 소통입니다. 아디포카인은 지방 조직 10,11,12,13,14,15,16,17,18에서 주요 내분비 신호로 잘 알려져 있지만, 지방세포는 또한 지질, 단백질, 핵산, 대사산물을 포함하는 막 결합 입자인 세포외 소포(EV)를 상당수 방출합니다. 지방세포 분비 전기(AdEV)도 다른 유형의 전기차처럼 글리칸을 운반하는지는 아직 불분명하다. 지방세포는 EV의 주요 공급원임이 입증되었으며, 약 80%의 순환 외계체 마이크로RNA가 마우스 모델에서 지방세포에서 유래한다는 것이 입증되었습니다. 이는 지방세포 특이적 Dicer 녹아웃 마우스를 기준 조건25에서 입증했습니다. AdEVs가 대사, 염증, 인슐린 감수성, 지방 생성에 미치는 역할은 보고되었으나, 아직 완전히 이해되지 않았습니다 26,27,28,29. 특히 다른 세포 유형 및 기관과의 교차 교류를 매개하는 잠재적 기능은 아직 대부분 알려지지 않았습니다. 26개의 EVs 풍부도는 이들이 국소 및 전신 신호 전달에서 중요한 역할을 할 수 있음을 시사하지만, AdEVs의 생물학적 중요성과 작용 기전은 아직 거의 탐구되지 않았습니다. 이러한 지식 격차는 AdEV의 분비와 기능을 연구하기 위한 견고하고 전문화된 방법의 필요성을 강조합니다.

이 격차를 해소하기 위해 우리는 Adiponectin-Cre 마우스와 Stopfl/fl/CD63-GFP 마우스(균주#:036865, JAX)를 교배하여 지방세포 특이적 CD63-GFP 마우스(AdipCD63-GFP)를 생성하였습니다. Cre가 없을 때 CD63-GFP를 발현하지 않은 스톱fl/fl/CD63-GFP 형제를 대조군으로 사용하였다. CD63-GFP 리포터 균주는 내피 및 신경세포 유래 EV를 포함하여 생체 내에서 세포 유형 특이적 EV를 추적하는 데 성공적으로 사용되었습니다30,31. 아디포넥틴은 성숙한 지방세포에서만 발현되며 지방세포 전구세포(APCs)에서는 발현되지 않으며, CD63은 EVs의 표지자이기 때문에, 순환과 조직에서 검출되는 GFP+ EVs는 AdEVs로 특이적으로 식별할 수 있습니다. 따라서 본 연구에서는 APC 내에서 검출된 GFP+ EV를 이 전구세포에 의해 흡수된 AdEV로 해석합니다. 이 리포터 시스템은 생체 내외에서 소포 방출과 잠재적 표적 상호작용을 직접 모니터링할 수 있게 하여, 다른 세포 유형의 지방 조직 내 AdEV 연구를 가능하게 합니다. 중요한 점은, AdEV는 다른 세포 유형에 비해 지질이 특히 풍부하여 부력이 높고 취약하며 전통적인 초원심분리 방법으로는 회수가 어렵다는 것입니다 35,36,37. 강한 원심력은 이러한 소포를 손상시키거나 상당한 샘플 손실과 오염을 초래하여 하류 분석을 복잡하게 만들 수 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 여러 차례의 저속 원심분리 단계와 크기 배제 크로마토그래피를 결합한 워크플로우를 최적화하여 전단 응력을 최소화하고 소포의 완전성을 유지하며 순도와 수율을 개선하여 정확한 정량화와 기능 연구를 가능하게 했습니다. CD63-GFP 시스템과 이 최적화된 분리 파이프라인은 지방 조직 교차 반응 및 전신 대사 조절에서 AdEV 분비와 기능을 탐구하는 접근성 있고 재현 가능한 접근법을 제공합니다.

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프로토콜

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알버트 아인슈타인 의과대학의 동물 관리 및 사용 지침에 따라, 수컷 쥐는 22°C, 상대 습도 30-70%에서 12시간 빛/12시간 어둠 주기로 그룹에 배치되었고, 음식과 물을 자유 롭게 섭취할 수 있었으며, C57BL/6J 배경에서 유지되었습니다.

1. APC에 의한 흡수를 통한 분비된 AdEV의 생체 내 검출

  1. 완충 준비
    1. 소화 완충제: 1 M HEPES 0.5 mL와 지방산 부족 소 혈청 알부민(BSA)을 50 mL DMEM에 첨가하여 HEPES 완충 DMEM을 준비합니다. 녹을 때까지 섞어.
    2. 세척 완충제: PBS를 2.5 mM 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)과 4% 태아 소 혈청(FBS)으로 준비합니다.
    3. 리베라제와 DNase 1 스톡을 5 mg/mL, 5 KU/mL에서 준비합니다. -20°C에서 보관하세요. 사용 전에 바로 해동하세요.
  2. 서혜부 지방 조직 채취 및 소화
    참고: 4개월 된 AdipCD63-GFP 및 CD63-GFP 대조군 쥐는 이산화탄소 흡입으로 안락사되었습니다.
    1. 멸균 기법으로 지방 조직을 절제하고, 0.5mL의 소화 완충제에 조직 1g을 넣은 뒤, 멸균 가위로 조직을 1mm 이하로 곱게 다집니다.
    2. 다진 조직을 0.5 mg/mL 리베라제와 50 U/mL DNase 1이 포함된 소화 완충액 10 mL에 현탁합니다.
    3. 궤도 셰이커에서 37°C(100rpm)에서 30-60분간 인큐베이팅합니다. 배양 중에 튜브를 몇 번 뒤집어 조직을 부드럽게 섞으세요. 용액이 흐려지고 보이는 조직 조각이 없으면 소화가 완료된 것으로 간주됩니다.
  3. 장갑차의 격리
    1. 현탁액을 소화 버퍼 2부피로 희석한 후 튜브를 부드럽게 3-4번 뒤집어 넣으세요.
    2. 소화되지 않은 조직을 제거하기 위해 멸균된 100 μm 필터를 통과시킵니다.
    3. 300 × g 압력으로 4 °C에서 5분간 원심분리합니다.
    4. 상청액 지방세포 부분을 버리고 펠릿을 기질 혈관 분획(SVF)으로 표시합니다.
    5. 멸균수와 함께 신선한 1× 적혈구(RBC) 용해 완충제를 준비하세요. SVF에서 적혈구를 5분간 얼음 위에 배양하여 빛으로부터 보호합니다.
    6. 세척 완충제 2부피를 추가한 후, 400 × g 에서 4°C에서 5분간 원심분리기를 여과합니다.
    7. 지방 조직 전구체 분리 키트(마우스) 프로토콜을 따르고, 조직 1그램당 80 μLof 버퍼(PBS, pH 7.2, 0.5% BSA, 2 mM EDTA)에 SVF를 재현탁합니다.
    8. 조직 1그램당 20 μL 비지방세포 전구세포 고갈 칵테일을 추가합니다.
    9. 어두운 곳에서 2-8°C에서 15분간 배양하세요.
    10. 샘플을 LS 컬럼을 통과시키고 흐름을 수집합니다.
    11. 300 × g 에서 4°C에서 5분간 원심분리하여 연구용 APC를 얻습니다.
  4. 공초점 현미경을 통한 APC 흡수를 통한 분비된 AdEV 검출
    1. AdipCD63-GFP 또는 CD63-GFP 마우스에서 분리한 APC 250 μL(1×4 세포/ mL)을 콜라겐 코팅된 8웰 챔버 슬라이드에 씨앗 시아, 세포가 약 6시간 동안 부착되도록 합니다.
    2. 세포와 EV 구조를 보존하기 위해 세포를 4% 파라포름알데히드로 10분간 고정하여 영상 촬영을 위해 세포 및 EV 구조를 보존합니다.
      참고: 이 분석에서 GFP 신호는 AdEV를 표시하며, 공초점 현미경으로 APC 내에서 검출되면 이 전구세포가 AdEV를 흡수함을 나타냅니다.
    3. 슬라이드를 PBS로 세 번 세척하고, 안티페이드 매체를 장착한 후 63× 유성 침지 대물렌즈가 장착된 공초점 현미경으로 GFP 신호를 포착합니다. 488nm 레이저를 사용해 0.5 μm 스텝 크기의 z-시리즈 스택으로 이미지를 획득하고, GFP 여기와 500-550 nm 발광을 감지합니다.
  5. 유세포분석을 통한 APC 흡수를 통한 분비된 AdEV의 검출
    1. APC를 세고 생존성 염료(예: 좀비)를 1:1000 1X PBS에 희석하세요. 세포를 100 μL당 1 × 10 6 크기에 매립합니다. 빛으로부터 보호한 상태로 얼음 위에서 20분간 배양합니다.
    2. 셀을 한 번 세척 버퍼로 세척하세요. 300 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리기.
    3. 세포를 100 μL당 1× 106 셀의 밝은 염색 버퍼에 현탁합니다.
    4. Fc 수용체 차단 시약(예: 항CD16/CD32)으로 비특이적 결합을 1:100 비율로 얼음 위에 10분간 차단합니다.
    5. 6,000 × g 에서 4°C에서 10분간 Sca-1 항체를 프리스핀합니다. 그 다음 APC 튜브에 1 μL Sca-1 항체를 추가하고 얼음 위에 20분간 배양하며, 튜브를 호일로 덮은 상태로 유지합니다.
    6. 세척 완충제 1mL로 두 번 세척한 후, 300 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다.
    7. 세포를 워시 버퍼에 500 μL당 약 1×6 개의 세포로 현탁하여 유세포 분석을 진행합니다. 405nm 보라색 레이저(태평양 블루용 450/50 nm 필터)와 488nm 청색 레이저(GFP용 530/30 nm 필터)가 장착된 스펙트럼 유세포계에서 Sca1+ 및 GFP+ 세포 데이터를 획득합니다. Sca1+ 세포를 게이팅하고 이 집단 내 GFP+ 하위 집합을 분석한 상태에서 기기의 실행 소프트웨어를 사용하여 샘플을 분석하세요( 그림 2에 표시됨).

2. 분비된 AdEV의 시험관 내 검출 및 분석

  1. APC의 성숙한 지방세포로의 분화
    참고: 모든 배양은 별도 언급이 없는 한 37°C, 8%CO2 로 유지됩니다.
    1. 0일차: 0.2% 젤라틴을 30분간 실온(RT)에서 코팅하고, 흡입 후 갓 분리된 APC를 DMEM/F12 + 15% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S) + 0.1% 프리모신에 씨앗하여 분화 전 100% 융합에 도달함.
    2. 1-8일차: MesenCult 지방생성 분화 배양지(총 50 mL: 염기 45 mL + 보충제 5 mL + GlutaMAX 0.5 mL + 프리모신 50 μL)로 대체하고, 4일째에 신선한 분화 배지로 교체합니다.
    3. 9일차: 지방세포를 PBS로 두 번 세척한 후 성숙한 지방세포 배양액(DMEM +1% BSA + 0.2% 프리모신)으로 교체하여 16시간 유지합니다.
  2. AdEV 격리 및 정제
    1. 위에서 생성된 15mL 지방세포 배양물을 40 μm 필터, 그 다음 30 μm 필터를 통과시킵니다.
    2. 여과액을 500 × g에서 5 분간 원 심분리한 다음, 2,000 × g에서 10 분간 원 심분리하여 잔류 세포와 이물질을 제거합니다.
    3. 여과물을 0.8 μm 필터를 통과시킨 후, 100 kDa 차단 초여과 장치(15 mL 샘플 부피)를 사용해 4,000 × g 에서 15분간 원심분리하여 15 mL에서 0.5 mL 농축합니다.
    4. 자동 분획 수집기를 이용해 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 컬럼에 시료를 적재하고 F1-8 분획을 수집합니다.
    5. 수집된 EV 분획을 100 kDa 차단 초여과 유닛(4 mL 샘플 부피)으로 농축한 후, 웨스턴 블롯, 나노입자 추적 분석 기기, 투과 전자현미경(TEM)으로 각 분획의 EV 함량을 검증합니다.
  3. AdEV 검증, 정량화 및 크기/형태 평가
    1. EV 마커의 웨스턴 블롯 분석
      1. 각 분획을 400 μL에서 25 μL 사이로 농축한 후, 프로테아제와 인산효소 억제제를 보충한 방사면역침전 분석제(RIPA) 완충제 50 μL를 추가합니다. 시료를 변성시키고× 2나트륨 도데실 황산염(SDS) 로딩 버퍼를 첨가하여 4-12% 트리스-글리신 겔 위에 단백질을 분해합니다.
    2. 나노입자 추적 분석 기기를 이용한 EV 크기, 농도 및 품질 분석.
      1. 분석 전에 멸균된 0.1 μm 여과된 PBS로 EV 샘플을 1:1000 비율로 희석하여 입자 농도가 최적의 검출 범위(약 107-10 9 입자/mL) 내에 있도록 합니다. 희석된 샘플을 부드럽게 섞어 기포가 생기지 않도록 하세요.
      2. 샘플을 고감도 과학용 상보 금속산화반도체(sCMOS) 카메라, 532nm 녹색 레이저 모듈, 10 nm(최대 1,000 nm) / 106 to 109 입자/mL가 장착된 기기에 적재합니다.
      3. 동적 관측량 기반 집중 알고리즘을 적용하는 NS Xplorer 소프트웨어 제품군을 사용하여 영상 및 정량화를 수행합니다.
    3. 투과 전자현미경(TEM)을 통한 EV 형태 조사
      1. 농축 전에 수집한 50 μL 전기차를 코어 시설에 제출하여 전기차 음성 염색을 하십시오. 플라즈마 클리너로 플라즈마 청소를 마친 탄소 전용 400메시 구리 그리드에 전기차를 적용하세요.
      2. 짧은 흡착 후에는 증류수로 그리드를 헹구고, 1% 우라닐 아세테이트로 음성적으로 염색한 뒤, 필터 페이퍼로 과잉 얼룩을 제거한 후 자연 건조합니다. 그 후 120 KV에서 작동하는 투과 전자 현미경으로 그리드를 영상화합니다.

3. 안전 및 폐기물 정보

  1. 파라포름알데히드와 우라닐 아세테이트는 개인 보호 장비(PPE)와 함께 연기함에서 다루세요. 두 가지 모두 독성이 있습니다. 위험 용기로 표시된 용기에 우라닐 아세테이트 폐기물을 수집하세요.
  2. 모든 생물학적 샘플을 감염 가능성이 있는 것으로 간주하고, 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)가 승인한 기관 생물안전 정책과 프로토콜에 따라 물질을 폐기하십시오.

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결과

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공초점 현미경을 통한 APC 흡수를 통한 AdEV 검출 프로토콜을 사용하여, 우리는 AdipCD63-GFP 및 Stopfl/fl/CD63-GFP 마우스의 서하니 지방 조직에서 APC를 분리하고 핵을 시각화하기 위해 DAPI로 염색했습니다. 공초점 현미경으로 검사한 Stopfl/fl/CD63-GFP 마우스의 APC는 검출 가능한 GFP 지점이 없었습니다(그림 1A). 반면, AdipCD63-GFP 마우스에서 분리된 APC는 세포질 전반에 걸쳐 다수의 독특한 GFP 점점을 보였습니다(그림 1B). GFP 신호는 CD63-GFP 라벨이 성숙한 지방세포에서만 발현되고 APCs에서는 발현되지 않는 아디포넥틴 프로모터에 의해 구동되기 때문에 APCs에 의한 AdEVs의 흡수를 보여줍니다. 이...

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토론

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설명된 프로토콜은 AdEV와 APC에 의한 흡수를 분리하고 특성화할 수 있는 견고하고 재현 가능한 시스템을 제공함으로써 중요한 방법론적 공백을 메운다. 다른 원료의 EV와 비교할 때, AdEV는 지질이 더 풍부하고 부력이 높아, 고전적인 초원심분리 기반 EV 격리 기술의 효율성이 떨어집니다. 그러나 대부분의 AdEV 정제 프로토콜은 여전히 초원심분리에 의존하고 있으며, 이는 소포 형태에 영향을 미치고 EV 응집체를 유발하며 단백질 오염을 유발할 수 있습니다37,44. 저희 프로토콜은 대신 직렬 저속 원심분리(≤ 4,000 × g)와 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 결합하여 AdEV를 정제합니다. 유사한 직렬 원심분리-SEC 방법은 비지방세포 EV에서도 수율과 순도 향상으로 검증되었습니다

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공개 사항

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저자들은 재정적 이익을 선언할 권리가 없습니다.

감사의 글

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FACS를 제공해 준 아인슈타인 유동 세포 분석 센터와 모든 영상 분석을 제공해 준 분석 영상 시설에 감사드립니다. 이 연구는 국립보건원(NIH)의 보조금과 NCI 암센터 지원 보조금의 DK128839 P30CA013330 부분적으로 지원받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.5 M EDTA, pH 8.0피셔AM9260G500배 희석
10배 PBS피셔 사이언티브70-013-032물을 넣어 1000배 희석
1 M 헤페스깁코156300801000배 희석
지방 조직 전구체 분리 키트, 마우스밀텐이 바이오텍30-106-639사용 준비 완료
아미콘 울트라 원심 필터, 100 kDa MWCO시그마UFC910015 mL 샘플 부피
아미콘 울트라 원심 필터, 100 kDa MWCO시그마UFC91004 mL 샘플 부피
BSA시그마A6003사용 준비 완료
칼넥신 항체칼넥신AB225951000배 희석
CD63 항체ABCAMAB217345500배 희석
CD81세포 신호 전달 기술10037500배 희석
코닝  BioCoat   콜라겐 I 배양 슬라이드시그마CLS354630사용 준비 완료
코닝  셀 스트레이너시그마CLS43175040 & mu; m 공극 크기
코닝  셀 스트레이너시그마CLS431752100 & mu; m 공극 크기
콕스 IV 항체세포 신호 전달 기술48441000배 희석
DMEM깁코11965092사용 준비 완료
DMEM/F-12, GlutaMAX 보충제서모피셔10565018사용 준비 완료
DNASE 1시그마D4513기본 5 KU/mL, -20 & 도; C
글루타맥스 보충제깁코35050061100배 희석
정지 및 무역; 프로테아제 및 인산효소 억제제 칵테일 (100X)서모피셔78444사용 준비 완료
HSP70 항체ABCAMab1816061000배 희석
Invitrogen eBioscience 10X 적혈구 용해 버퍼 (다종)피셔 사이언티브50-112-9743물에 10배 희석
아이존 사이언스 USA Ltd QEVORIGINAL 70NMGEN2 5/PK SDP피셔 사이언티브NC2042225사용 준비 완료
라이카 스텔라리스 8 공초점 현미경라이카 현미경해당 없음
Liberase TM 연구 등급시그마립트므로-20 & 도수에 5 mg/mL 기본 투여; C
밀렉스 MCE 주사기 필터시그마SLAA0250.8 & mu; m 공극 크기
나노사이트 프로말번 파날리티컬해당 없음
노벡스 트리스-글리신 미니 단백질 젤, 4– 12%,서모피셔XP04120BOX사용 준비 완료
Novex 트리스-글리신 SDS 샘플 버퍼 (2개)서모피셔LC2676사용 준비 완료
Pacific Blue 항생쥐 Ly-6A/E (Sca-1) 항체바이오레전드10811925배 희석
파라포름알데히드 용액 (16%)피셔 사이언티브50-980-487PBS로 4%까지 희석하세요
pluriStrainer S / 30 및 마이크로; m (세포 체결기)피셔 사이언티브NC092245930 & mu; m 공극 크기
폰소 S 해법시그마P7170-1L사용 준비 완료
프리모신인비보젠NC9141851500배 희석
DAPI가 포함된 ProLong 금 안티페이드 시약세포 신호 전달 기술8961S사용 준비 완료
정제 항마우스 CD16/32 항체바이오레전드101301100배 희석
RIPA 버퍼 피셔 사이언티브PI89900물에 10배 희석
스펙트럼 플로우 사이토미터 (오로라 3)사이텍 바이오사이언스해당 없음
Syntaxin 4 항체시냅스 시스템1100425000배 희석
테크나이 20 (투과 전자현미경)FEI해당 없음
터지오-EMPIE 사이언티픽 LLC해당 없음
빈쿨린 항체ABCAMAB185085000배 희석

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kershaw, E. E., Flier, J. S. Adipose tissue as an endocrine organ. J Clin Endocrinol Metab. 89 (3), 2548-2556 (2004).
  2. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
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