여러 코호트에 걸친 통합 머신러닝을 사용하여 교모종에 대한 견고한 IMRG 예후 서명을 구축했습니다. IRAIN은 현저히 하향 조절되며, 등급 및 생존율과 역례로 연관되어 IGF1R-JAK2-STAT3-BIRC5 신호를 억제하여 증식, 이동 및 혈관신생을 억제합니다. 연구 결과는 IRAIN과 IMRG를 바이오마커 및 치료 표적으로 지명합니다.
연구 논문
롱 비암호화 RNA IRAIN은 IGF1R-JAK-STAT-BIRC5 축을 통해 교모세포종에서 면역대사 재프로그래밍을 유도합니다
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
교모세포종은 공격적인 악성 종양으로, 치료 옵션이 제한적이고 예후도 좋지 않습니다. 이 과정은 대사 재프로그래밍과 면역 회피와 밀접하게 연관되어 있어, 이러한 과정을 통합하는 분자 조절자를 규명할 필요성을 강조합니다. 여기서 우리는 강력한 면역대사 관련 유전자(IMRG) 예후 서명을 확립하고, IGF1R-JAK-STAT-BIRC5 축을 통해 교모종 면역대사 조절에 있어 긴 비암호화 RNA IRAIN의 역할을 규명하였습니다. TCGA, CGGA(693/325), GEO(GSE43378) 코호트의 전사체 및 임상 데이터를 분석하였습니다. 차별 발현과 가중 유전자 공동 발현 네트워크 분석(β = 8)은 척도 없는 위상을 보장했으며, 10개의 머신러닝 알고리즘을 결합한 생략 교차 검증 프레임워크는 101개의 예후 모델을 산출했습니다. 최적의 17유전자 IMRG 서명은 모든 코호트에서 검증되었으며, 독립적으로 전체 생존 기간을 예측하였습니다. 기능적 검사 결과, IRAIN 과발현이 IGF1R을 억제하고 JAK2/STAT3 인산화를 억제하며 BIRC5를 하향 조절하여 세포자멸사를 촉진하고 혈관신생을 감소시키는 것으로 나타났습니다. 낮은 IRAIN 발현은 면역억제 Tregs 및 M2 대식세포와 상관관계가 있었으며, 종양-미세환경 점수 상승과 상관하여 면역 회피 표현형을 시사합니다. 이 결과는 IRAIN이 교모세포종 면역대사 재프로그래밍의 핵심 조절자임을 입증하며, IMRG 서명이 신뢰할 수 있는 예후 도구임을 입증하며, IRAIN-IGF1R-JAK-STAT-BIRC5 경로가 교모세포종에서 면역 및 대사 조절 이상을 연결하는 기전적 다리로서 정밀 치료의 잠재적 표적임을 강조합니다.
서론
교모세포종은 중추신경계에서 가장 흔한 원발성 악성 종양으로, 신경외과, 방사선 치료, 화학요법의 발전에도 불구하고 여전히 가장 치명적인 인간 암 중 하나입니다. 고등급 교모세포종, 특히 다형성 교모세포종(GBM)은 빠른 증식, 확산성 침윤, 불가피한 재발이 특징입니다 1,2. 최근에는 수술적 개입, 면역치료, 화학요법3 등 다양한 효과적인 치료법이 등장했습니다. 최대 치료에도 중앙 생존율은 약 14-18개월로 유지되어, 새로운 치료 전략과 예후 바이오마커의 필요성을 강조합니다4.
종양 미세환경(TME)과 암세포 간의 상호작용은 교모세포의 공격적인 성장과 분자 이질성을 결정적으로 촉진합니다. 미세아교세포, 신경 전구세포, 혈관 세포, 적응 면역세포 등 수많은 면역 구성 요소들이 TME 5,6,7의 형성에 밀접하게 관여합니다. 최근 몇 년간 면역치료에서 놀라운 발전이 이루어지면서 종양학에 혁신적인 시대가 열렸습니다. 그럼에도 불구하고 면역 체크포인트 차단술(ICB) 및 기타 면역치료법은 교모종8에서 제한적인 성공만을 보였습니다. 이 맥락에서 면역치료가 실패한 이유는 교모세포종 미세환경의 여러 내재적 특징, 즉 낮은 종양 돌연변이 부담, 뚜렷한 종양 내 이질성, 혈액-뇌 장벽 투과성 저하, 주요 조직적합성 복합체 분자의 하향 조절, 그리고 T세포 침윤이 드문드문하다는점에서 비롯됩니다.
점점 더 많은 증거가 나타나면서, 대사 기능 장애를 보이는 종양 미세환경(TME)은 산성 상태, 영양분 결핍, 면역 반응을 억제하는 대사산물의 축적이 특징임을 시사합니다. 이 상태는 이후 종양에 침투하는 면역세포의 기능 장애를 초래하여 면역치료의 효과를 저하시킵니다13. 동시에 TME 내 면역 세포들은 분화와 효과기 기능을 결정하는 맥락 의존적 대사 변화를 겪습니다. 예를 들어, 활성화된 T 세포는 빠른 증식을 위해 당당융합에 의존하는 반면, 조절 T 세포(Tregs)와 종양 관련 대식세포(TAM), 특히 M2 아형은 면역억제 활동을 유지하기 위해 산화적 인산화와 지방산 대사에 의존한다14,15.
따라서 면역 및 대사 신호를 통합하는 것은 교모세포종을 더 잘 분류하고 환자의 예후를 예측할 수 있는 합리적인 틀을 제공합니다. 롱 비암호화 RNA(lncRNA)는 최근 염색질 구조, 유전자 전사, 전사 후 변형의 다재다능한 조절자로 부상하고 있습니다. 여러 lncRNA가 교모세포종 발병에 관여하여 증식, 침입, 면역 조절에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌습니다16. 그중 인프린팅된 안티센스 전사체 IRAIN(IGF1R 안티센스 임프린트 비단백질 코딩 RNA)은 인슐린 유사 성장인자 1 수용체(IGF1R) 유전자를 시스-작용하는 크로마틴 상호작용을 통해 조절하는 역할로 주목받고 있으며, 이는 특히 유방암, 백혈병 세포주와 같은 암세포에서 시스 경쟁 조절을 하향 조절하고 감소시키는 것으로 입증되었습니다. 후두암과 급성 골수성 백혈병은 IGF1R 17,18,19의 상향 조절을 직접적으로 유발합니다. IGF1R 신호전달이 종양 성장과 면역 조절에 중심적인 하류 경로인 JAK-STAT 및 PI3K-AKT 경로를 활성화하기 때문에, IRAIN 발현의 변화는 종양 면역대사에 치명적인 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나 IRAIN이 교모세포종에서 차지하는 역할과 면역대사 환경에 미칠 잠재적 영향은 아직 명확히 밝혀지지 않았습니다. 이 지식 공백을 해소하면 비암호화 RNA가 교모종에서 대사 적응과 면역 회피를 어떻게 조정하는지에 대한 기전적 통찰을 제공할 수 있습니다.
본 연구에서는 다코호트 전사체 데이터와 실험적 검증을 결합하여 교모세포종에서 면역대사 조절을 탐구하였습니다. TCGA, CGGA(693/325), GEO(GSE43378) 코호트 전반에 걸쳐 통합된 머신러닝 프레임워크를 사용하여, 데이터셋 전반에 걸쳐 환자 생존율을 층화할 수 있는 강력한 17유전자 면역대사 관련 유전자(IMRG) 예후 서명을 확인했습니다. 이후 우리는 IGF1R-JAK-STAT 신호 축과의 상호작용이 예측된 IRAIN을 고려하여 이 네트워크의 잠재적 상류 조절자로 집중했습니다. 기능적 분석 결과, IRAIN 과발현은 IGF1R 발현과 STAT3 하류 인산화를 억제하여 교세포종 증식과 혈관형성을 억제하여 항세포자사파괴 단백질인 BIRC5(Survivin으로도 알려짐)의 발현을 감소시키는 것으로 밝혀졌습니다. 이 결과들을 종합해 보면, IRAIN이 교모종에서 면역 조절과 대사 재프로그래밍을 연결하는 기전적 다리 역할을 한다는 작동 모델을 뒷받침합니다. 우리는 IRAIN 발현 조절 이상이 이 균형을 깨뜨려 종양 진행을 촉진하여 면역억제 미세환경을 촉진하고 치료 내성을 부여한다고 가설을 세웠습니다.
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프로토콜
인간 조직을 이용한 모든 시술은 기관 지침과 헬싱키 선언을 준수했으며, 푸젠 의과대학 기관심사위원회(승인번호 2021KYB089)의 승인을 받았습니다. 조직 채취 전에 모든 참가자로부터 서면 동의서를 받았습니다.
유전자 발현 및 생존 분석
RNA 시퀀싱 데이터와 관련 임상 정보는 여러 공개 데이터베이스에서 수집되었습니다. 1) TCGA 코호트: 175개의 교모세포종(GBM)과 534개의 저등급 교모세포(LGG) 샘플에 대한 RNA-seq(FPKM) 데이터를 The Cancer Genome Atlas(https://portal.gdc.cancer.gov/)에서 다운로드; 2) 정상 대조군: UCSC Xena 데이터베이스에서 211개의 정상 뇌 조직과 662개의 교세포종 조직의 발현 프로필을 다운로드했습니다(https://xenabrowser.net/datapages/); 3) 외부 검증: 중국 교모세포종 게놈 아틀라스(http://www.cgga.org.cn)에서 CGGA693 및 CGGA325 코호트 데이터를 획득; 4) GEO 데이터셋: 50개의 교모세포종 샘플에 대한 발현 및 임상 데이터를 포함한 GSE43378 데이터셋은 유전자 발현 옴니버스(Gene Expression Omnibus, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)에서 다운로드되었습니다. 모든 원시 집계 데이터는 백만당 전사본(TPM)으로 변환되었으며, 로그2 변환을 거쳤습니다. 이미 정규화된 데이터셋에 대해서는 비교 가능한 분포를 위해 표현 행렬을 검토하였습니다. TPM 값이 80% 이상에서 1< 있는 유전자는 제외되었다. 누락된 임상 정보(나이, IDH 상태, 1p/19q 코드렛, MGMT 메틸화)는 완전 케이스 필터링을 통해 제거하였습니다. 데이터 세트 간 배치 효과는 R 패키지 sva에 구현된 ComBat 알고리즘을 사용해 조정되었습니다. 각 데이터셋 내에서 z-점수 변환을 통해 표현 값이 표준화되었습니다. 생존 분석은 R 패키지인 생존 및 생존 데이터를 사용하여 수행되었습니다. 환자들은 IRAIN의 중앙값 발현 수준에 따라 고발현군과 저발현군으로 이분법되었습니다. Kaplan-Meier 생존 곡선을 생성하고, 통계적 유의성은 로그 랭크 검정으로 평가하였다. 위험비(HR)와 95% 신뢰구간(CI)은 Cox 비례 위험 회귀 모델을 사용하여 추정하였습니다.
면역 및 대사 유전자 집합의 정의
면역 관련 유전자(IRGs, n = 2,483)는 ImmPort 데이터베이스(https://www.immport.org/shared/)에서, 대사 관련 유전자(MRGs, n = 948)는 분자 서명 데이터베이스(MSigDB, https://www.gsea-msigdb.org/)에서 얻었습니다. 이 유전자들의 결합은 면역대사 관련 유전자(IMRGs)로 정의되었습니다. 이 유전자 목록은 이후 차별 발현 및 네트워크 분석의 참고 자료로 활용되었습니다.
차별 발현 및 가중 유전자 공동 발현 네트워크 분석
정상 뇌와 교모세포종 조직 간의 차등 발현 유전자(DEGs)는 R 패키지 limma를 사용하여 확인되었습니다. 발현 데이터는 선형 모델에 적합된 후 경험적 베이즈 조절을 적용했습니다. |log₂ 접수 유전자가 변하는 | > 1.5와 거짓 발견률(FDR) < 0.05는 유의하게 차별적으로 발현된 것으로 간주되었습니다. 가중 유전자 공동 발현 네트워크 분석(WGCNA)은 R 패키지 WGCNA를 사용하여 수행되었습니다. 이상치 표본은 계층적 군집화를 통해 배제하였습니다. 부드러운 임계값 배곱은 β = 8로 설정되어 적절한 평균 연결성을 유지하면서 스케일 프리 토폴로지 적합 지수(R2 ≥ 0.85)를 달성했습니다. 위상적 겹침 행렬(TOM)이 구성되었고, 동적 트리컷 알고리즘을 사용해 최소 50개의 모듈로 유전자를 그룹화했습니다. 모듈 고유유전자는 임상 형질과 상관관계가 있었으며, 교양종과 가장 강하게 연관된 모듈(Pearson's r > 0.7, P < 1×10-10)이 허브 유전자 식별에 선택되었습니다.
머신러닝 기반 예후 모델 구축
10개의 머신러닝 알고리즘을 통합한 포괄적인 '생략-제외 교차검증(LOOCV) 프레임워크가 예후 모델을 구축하고 평가하기 위해 적용되었습니다. 총 101개의 조합 워크플로우가 TCGA 코호트를 훈련 데이터셋으로 사용하여 구현되었습니다. 예후 관련 면역대사 관련 유전자(IMRGs)는 단변량 콕스 회귀분석(P < 0.05)을 통해 처음 확인되었습니다. 최적 모델은 세 개의 검증 데이터셋(CGGA693, CGGA325, GSE43378)에서 평균 하렐 코코던스 지수(C-지수)를 최대화하여 결정되었습니다. 결과적으로 생성된 RSF-Enet 모델(α = 0.3)은 가장 높은 예측 성능을 보였으며, 독립적인 코호트 간에 견고한 일반화 가능성을 유지했습니다22.
TME와 면역 침윤
면역유전체 환경을 포괄적으로 특성화하기 위해 다층 분석 접근법을 사용했습니다. 먼저, 면역 및 기질 침윤 수준을 ESTIMATE 알고리즘을 사용해 정량화하였다23. PDCD1, CTLA4, LAG3 등 주요 면역 체크포인트 분자의 차별 발현은 리마 기반 분석을 통해 평가되었고, 체크포인트 유전자 간 상관관계는 상관행렬을 사용해 시각화하였다. TCGA 코호트의 903개 교세포종 샘플에서 체세포 돌연변이 프로필을 사용하여 종양 돌연변이 부담(TMB), 마이크로새틀라이트 불안정성(MSI), 종양 면역 기능 장애 및 배제(TIDE) 점수를 계산하여 면역치료에 대한 잠재적 반응을 예측하였습니다. 환자들은 이후 TMB 상태(높음/낮음)와 위험 점수(높음/낮음)에 따라 네 개의 예후 그룹으로 층화되었고, 생존 결과는 Kaplan-Meier 분석을 통해 비교되었습니다.
기능 풍부 분석
유전자 온톨로지(GO) 및 교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG) 경로 풍부도 분석은 R 패키지 clusterProfiler를 사용하여 수행되었습니다. 조정된 P 값 0.05< 농축 결과는 통계적으로 유의미하다고 간주되었습니다. 과대대표된 생물학적 과정, 세포 구성 요소, 분자 기능은 점플롯과 막대 플롯을 사용해 시각화되었습니다. 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크는 STRING 데이터베이스(≥ 0.4)를 사용하여 구축되었고 Cytoscape에서 시각화되었습니다. PPI 네트워크 내의 기능 모듈은 MCODE 알고리즘을 사용하여 식별되었습니다. GeneMANIA(https://string-db.org; 신뢰도 점수 ≥ 0.4)를 사용하여 유전자-유전자 상호작용 및 공동발현 네트워크를 추가로 분석하고 Cytoscape에서 시각화하였습니다. PPI 네트워크 내의 기능 모듈은 MCODE 알고리즘을 사용하여 식별되었습니다. 유전자-유전자 상호작용과 공동발현 네트워크는 GeneMANIA(https://genemania.org)를 사용하여 추가로 분석되었으며, 이 도구는 물리적 및 유전적 상호작용, 공유 경로, 공동 발현 패턴에 대한 정보를 통합하여 잠재적 기능적 연관성을 추론하였습니다.
임상 표본
푸젠의과대학 장저우 부속병원에서 1차 교모세포종 절제술을 받은 환자들로부터 신선한 교모종 조직(n = 6)과 인접한 비종양 뇌 조직(n = 6; 종양 경계에서 최소 3cm 이상 위치하며 조직학적으로 종양 없음으로 확인됨)을 수집하였다. 수술 전 환자 중 누구도 화학요법이나 방사선 치료를 받은 적이 없습니다. 모든 병리학적 진단은 2021년 세계보건기구(WHO)의 중추신경계 종양 분류에 따라 두 명의 신경병리학자가 독립적으로 확인하였습니다. 수술 직후, 조직 표본은 얼음처럼 차가운 인산염 완충 생리식염수(PBS)로 헹구어 잔여 혈액을 제거하고, 액체 질소(-196 °C)에 급동하여 -80 °C에서 RNA 추출 시까지 보관했습니다.
세포주 및 세포 배양
인간 교모세포종 세포주 SHG44, U251, A172, T98G와 정상 인간 교세포(HEB)를 인증된 저장소에서 확보했으며, 사용 전에 마이코플라즈마 오염이 없음을 확인하였습니다. 세포는 10% 태아 소 혈청(FBS), 2 mM L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신을 37°C에서 5% CO₂ 가습 인큐베이터에서 유지하였다. 세포는 80-90% 합류율에 도달하면 4-5일마다 통과되었습니다. IRAIN 과발현 및 대조 세포주를 확립하기 위해, 대조군으로 전체 길이의 IRAIN 전사체를 가진 렌티바이러스 벡터 또는 빈 벡터를 대조군으로 전개했습니다. 안정적인 클론은 14일간 푸로마이신(2 μg/mL)을 사용하여 선별하였다. 과발현 효율성은 하위 분석 전에 정량적 역전사 PCR(qRT-PCR)으로 확인되었습니다.
3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT) 세포 증식 분석법
세포는 100 μL 완전 배양지에 1×4 세포 밀도 로 96웰 플레이트에 시딩되었습니다. 파종 후 24, 48, 72시간마다 각 웰에 20 μL MTT 용액(인산염 완충 생리식염수 5 mg/mL)을 첨가하고 37 °C에서 4시간 배큐했습니다. 그 후 상청액을 제거하고, 150 μL 디메틸설폭산(DMSO)을 첨가하여 포르마잔 결정체를 용해시켰습니다. 판을 10분간 부드럽게 저어 완전한 용해를 보장했습니다. 마이크로플레이트 분광광도계를 사용해 490 nm에서 흡광도를 측정했습니다. 빈 우물에서 얻은 배경 측정값은 빼졌습니다. 세포 생존율은 24시간 또는 대조군(1.0으로 설정)을 기준으로 계산되었습니다. 모든 실험은 6개의 기술적 복제체와 3개의 독립적인 생물학적 복제체로 수행되었습니다. 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 표현되며, 통계적 유의성은 양측 t-검정을 사용하여 산출되었습니다.
세포자살사를 위한 유세포검사 (Annexin V - FITC/PI 염색)
세포는 60-70% 합류율에 시딩되어 지정된 조건에서 24시간 동안 처리되었습니다. 부유 및 부착 세포는 EDTA 프리 트립신을 사용해 수집하고, 결합하여 얼음 냉각 PBS로 두 번 세척하였습니다. 세포 펠릿은 Annexin V 결합 버퍼(10 mM HEPES pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2)에서 1 ×10 6 cells/mL 용량으로 재현탁되었습니다. 각 샘플에 대해 100 μL의 현탁액을 5 μL Annexin V-FITC 및 5 μL 프로피디움 요오다이드(PI; 50 μg/mL 스톡)와 함께 실온에서 어두운 곳에서 15분간 배열했습니다. 400 μL 결합 버퍼를 추가한 후 샘플은 얼음 위에 보관되어 유동 세포계(여기 488nm; FITC 530/30 nm, PI >585 nm)로 1시간 이내에 분석되었습니다. 보상을 위해 적절한 단일 염색 및 형광-1 대조군을 포함하였다. 샘플당 최소 10,000건의 사건이 기록되었습니다. 데이터는 사분면 게이팅(생 개체군(Annexin V⁻/PI⁻), 초기 세포자멸사(Annexin V⁺/PI⁻), 후기 세포자살자사(Annexin V⁺/PI⁺), 괴사 개체군(Annexin V⁻/PI⁺) 집단으로 분석되었습니다. 초기 + 후기 세포멸사 세포의 비율이 보고되었습니다(평균 ± SD, n = 3).
정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)
총 RNA는 제조사 프로토콜에 따라 산성 페놀-구아니디늄 시약을 사용해 분리되었습니다. RNA 순도는 분광광도계(A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.1)로 검증되었고, 겔 전기영동으로 무결성이 확인되었습니다(RNA 무결 번호 ≥ 7). 총 RNA 1마이크로그램을 DNase I로 처리하고, 무작위 헥사머와 올리고(dT) 프라이머를 사용해 20 μL 반응으로 역전사했습니다. 반응은 25°C에서 10분, 50°C에서 30분, 85°C에서 5분간 진행되었습니다. 정량 PCR은 2× SYBR 그린 마스터 믹스 5 μL 프라이머, 각 프라이머 각 0.3 μM, 그리고 1 μL cDNA(≈ 20 ng RNA 환산)를 포함한 10 μL 시스템에서 수행되었습니다. 열 사이클 조건은 95 °C에서 5분, 이어서 95 °C에서 15초, 60 °C에서 30초 40회 사이클, 그리고 65 °C에서 95 °C까지 0.3 °C 단위로 녹는 곡선 분석이 이루어졌습니다. 모든 반응은 무템플릿 및 마이너스 RT 대조군과 함께 3회로 수행되었습니다. CT 값> 35 또는 기술적 복제 SD > 0.5는 제외하였습니다. 상대 발현은 2⁻ΔΔCt 방법으로 계산되었으며, 내부 대조군은 GAPDH였습니다. 세 개의 독립적인 생물학적 복제에서 평균 ± SD 값이 보고되었고, 그룹 차이는 양측 t-검정을 사용해 분석되었습니다.
서부 블롯 분석
세포는 RIPA 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 디옥시콜레이트 나트륨, 0.1% SDS)에 녹여 프로테아제 및 인산효소 억제제를 보충하여 얼음 용해했습니다. 용해액은 얼음에서 30분간 간헐적 소용돌이로 배양한 후, 12,000 × g 에서 4°C에서 15분간 원심분리하여 제거했습니다. 단백질 농도는 BCA 분석법으로 측정하고 1-2 μg/μL로 조정한 후 4× Laemmli 버퍼(최종 1× 완두액 100 mM DTT를 포함)와 1:3으로 혼합하였습니다. 샘플은 95°C에서 5분간 변성되었습니다. 동일한 양의 단백질(50 μg)을 100 V에서 12% SDS-PAGE로 90분간 분해한 후, 250 mA 전압에서 PVDF 막으로 전기전사하여 90분간 투여하였습니다. 막은 5% 무지방 우유(0.1% Tween-20)를 TBST에서 1시간 동안 상온에서 차단하고(인산단백은 5% BSA), 그리고 IGF1, IGF1R, JAK2, p-JAK2(Y1007/1008), STAT3, P-STAT3(Y705), BIRC5, β-액틴(일반적인 희석 1:1000, β-액틴 1:5000)에 대한 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 배양하였다. TBST에서 10분간 세 차례 세척한 후, 막을 HRP 결합 2차 항체(1:5000)와 상온에서 1시간 배양한 후 다시 세척한 후 화학발광 기판을 사용해 현상하였다. 밴드 강도는 ImageJ로 정량화하여 β-액틴 또는 전체 단백질로 정규화한 후 세 개의 독립 실험에서 평균 ± SD로 표현하였습니다.
면역세포화학
멸균 유리 커버슬립에 배양된 세포는 PBS로 두 번 헹구고 4% 파라포름알데히드에 상온에서 15분간 고정시켰습니다. 세 번의 PBS 세척 후, 세포는 0.2% Triton X-100으로 10분간 투과되고, 5% 소 혈청 알부민(BSA)으로 1시간 차단했으며, 4°C에서 1차 항CD31 항체(1% BSA에 1:200 희석)와 함께 하룻밤 배양하였습니다. 세 번의 PBS 세척 후, 세포는 Alexa Fluor 결합된 2차 항체(1:500 희석)와 함께 어두운 환경에서 1시간 배양하고, DAPI(1 μg/mL, 5분)로 교환한 후 안티페이드 배지에 장착하였습니다. 이미지는 동일한 노출 및 이득 설정에서 형광 현미경을 사용해 촬영되었습니다. CD31 양성 면적의 비율은 ImageJ 소프트웨어를 사용해 샘플당 무작위로 선택된 다섯 개의 겹치지 않는 필드에서 정량화하였습니다. 이 분석은 조직 절편이 아닌 세포 모델에서 수행되었습니다.
통계 분석
통계 분석은 R 버전 4.3.0과 관련 패키지를 사용하여 수행되었습니다. 범주별 변수를 비교하기 위해 카이제곱 검정이 사용되었고, 연속 변수는 윌콕슨 랭크합 검정 또는 T 검정을 사용해 평가하였습니다. 연속 변수의 평가는 피어슨의 상관계수를 통해 이루어졌다. 생존 분석은 Cox 비례 위험 모델링과 Kaplan-Meier 곡선 생성을 포함한 생존 패키지를 사용하여 수행되었으며, 최적 층화 임계값은 survminer 패키지와 Riskscore = 
공식으로 설정되었습니다. CompareC 패키지는 다양한 변수의 C-지수를 평가하는 데 사용되었습니다. 이진 범주 변수 예측을 목표로 한 수신기 운행특성 곡선(ROC)은 pROC 패키지를 사용하여 생성되었습니다. 또한, 생존 지표를 위한 ROC 곡선(AUC) 하의 시간 의존 면적도 timeROC 패키지를 사용하여 분석하였습니다. 모든 통계 검정은 양측 접근법으로 수행되었습니다. 유의수준은 P < 0.05로 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
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결과
IRAIN은 교모종에서 하향 조절되며, 부정적인 임상병리학적 특징과 연관되어 있습니다
분석 과정은 그림 1에 나와 있습니다. IRAIN 발현은 처음으로 qRT-PCR로 1차 성상교세포, 교세포종 조직 및 교세포주에서 평가되었습니다. IRAIN 수치는 저등급 및 고등급 교모종 조직 모두에서 정상 성상교세포와 비교했을 때 4개 교세포주 모두(SHG44, A172, U251, T98G)에서 현저히 감소하였습니다(그림 2A). 이러한 결과와 일치하게, TCGA 및 CGGA 코호트의 RNA-seq 데이터 분석 결과, 교모세포종 샘플에서 정상 뇌 조직보다 IRAIN 발현이 유의하게 낮았다(그림 2B). IRAIN 발현에 따라 계층화된 환자들, 낮은 IRAIN 그룹은 높은 IRAIN 발현군보다 전체 생존 기간과 무진행 생존 기간이 유의하게 짧았습니...
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토론
교모세포종은 중추신경계에서 가장 치명적인 악성 종양 중 하나로, 심각한 종양 내 이질성과 기존 치료에 대한 저항성을 특징으로 합니다. 외과적 절제와 화학방사선 치료를 병행했음에도 불구하고 재발과 사망률은 여전히 높으며, 특히 교모세포종 환자의 중앙값 생존율은 최근 수십 년간 제한적인 개선을 보였습니다 4,24. 점점 더 많은 증거가 종양 미세환경(TME) 내 대사 재프로그래밍과 면역 억제가 교모종 공격성의 주요 결정 요인임을 시사합니다15,25. 그러나 유사한 임상 특성을 가진 환자들은 종종 상당한 분자 및 대사 이질성을 보이며, 이는 교모세포종 생물학의 면역 및 대사 차원을 모두 포착하는 통합 바이오마커의 필요성을 강조합니다.
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공개 사항
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감사의 글
유전자형-조직 발현(GTEx) 프로젝트와 TCGA, CGGA 데이터베이스에 참여한 모든 참가자와 연구자 여러분께 이용 가능한 데이터를 공유해 주셔서 감사드립니다. 이 연구는 푸젠성 보건기술프로젝트(2024GG01010154)와 장저우병원 박사 워크스테이션 등반 프로젝트(PDA202306)의 지원을 받았습니다. 자금 지원자는 우리의 연구를 위한 자금을 제공했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 부합신 V-PI 세포자멸증 키트 | 그리고 nbsp; 서던 바이오테크놀로지, 버밍햄, 앨라배마, 미국 | NA | 세포자멸사 평가에 사용됨 |
| 부록 V-PI 세포자멸증 키트 | 서던 바이오테크놀로지 | 10010-02 | 유세포분석법을 이용한 세포자멸사(apoptosis) 평가에 사용됩니다. |
| 항-IGF1, 항-IGF1R, 항-JAK2, 항-STAT3, 항-생존, 항-&베타-액틴 | 앱캠 | AB182408, AB108596, AB109085, AB76424, AB8227 | 서부 블롯 분석에 사용되는 항체. |
| 바이오크매니저 | 크랜 | 1.30.25 | R &ge에서 Bioconductor 패키지를 설치하고 관리하세요; 3.6. |
| 바이오-래드 Cfx96 시스템 | 생체도체 | 1.5.1 | STRING protein&ndash에 대한 프로그래밍적 접근; 단백질 상호작용. |
| 카렛 | 크랜 | 0.4 | 생존 모델에 대한 시간 의존적 ROC/AUC. |
| 중국 교모세포종 게놈 아틀라스 (CGGA) | NA | CGGA693 그리고 CGGA325 | 모델 구성 및 검증에 사용됩니다 |
| 클러스터프로파일러 | 생체도체 | 2.18.0 | MAF 파일 파싱; 종양 돌연변이 부담(TMB)과 돌연변이 지형을 계산합니다. |
| 코르플롯 | 크랜 | 3.5.0 | 일반적인 플롯(박스플롯, 바이올린 플롯, 산란, 추세선 등). |
| 콕스부스트 | 크랜 | 7.3-60 | stepwise Cox 모델 선택을 위한 stepAIC. |
| Data.Table | 크랜 | readr2.1.5 | 구분된 파일의 빠른 읽기; 견고한 UTF-8 처리. |
| 용량 | 생체도체 | 3.17.0 | 인간 유전자 주석(Entrez, Ensembl, SYMBOL 매핑). |
| 다이내믹트리컷 | 크랜 | 1.73 | 가중 유전자 공동 발현 네트워크 분석; 픽소프트 스레드레숄드, TOM, 모듈 감지. |
| 에저 | 생체도체 | 3.56.2 | 차별표현(부움/선형 모델); 윌콕슨/경험적 베이즈; 화산/히트맵 입력. |
| 엔리치 플롯 | 생체도체 | 3.26.2 | 질병 온톨로지 풍부화 및 GSEA 보조 도구(클러스터프로파일러와 함께 사용). |
| 플래시클러스트 | 크랜 | 1.63-1 | WGCNA 모듈 검출을 위한 적응형 분기 절단. |
| Gbm | 크랜 | 1.12 | 생존 분석을 위한 감독 주성분. |
| 유전자 발현 옴니버스 (GEO) | NA | GSE43378 | 모델 구성 및 검증에 사용됩니다 |
| GEO쿼리 | 생체도체 | NA | GEO 데이터셋을 다운로드 및 파싱하세요. |
| GGPLOT2 | 크랜 | 1.0.12 | 표현 서명의 열맵을 출판 즉시 제공합니다. |
| 글름넷 | 크랜 | 3.3.1 | 적절한 검열 결과를 위한 무작위 생존 숲. |
| 고추냉이 과산화효소 표지된 항토끼 2차 항체 | 앱캠 | AB6721 | 서부 블롯 검출을 위한 2차 항체. |
| 인간 교모세포종 세포주 (SHG44, U251, A172, T98G) | 미국 조직 배양 컬렉션 | NA | 교모세포종 연구를 위한 인간 교모세포종 세포주. 세포는 DMEM + 10% FBS, 2 mM L-글루타민에서 배양하였다. |
| 이그래프 | 크랜 | 10.0.1 | MSigDB 유전자 집합(예: 대사 MRG); 편리하고 깔끔한 액자. |
| 이미지 J 소프트웨어 | 그리고 nbsp; 미디어 사이버네틱스, 미국 | 152 | 시각화에 사용 |
| lncRNA-IRAIN을 암호화하는 렌티바이러스 벡터 | GeneChem, 상하이, 중국 | NA | 안정적인 클론을 형성하기 위해 교모세포종과 HEB 세포의 형질전환에 사용되는 렌티바이럴 벡터. |
| 림마 | 생체도체 | 3.48.0 | 배치 보정(ComBat) 및 대리 변수 분석. |
| 마프툴스 | 생체도체 | 1.52.0 | 해럴' S의 코코던스 인덱스(C 지수) 및 생존 비교 유틸리티. |
| 미사 | 크랜 | 4.1-8 | 페널티를 받는 콕스 모델: 올가미, 능선, 탄성 그물. |
| 므시그브르 | 크랜 | 0.0.5 | 생존 데이터를 위한 지지 벡터 기계 방법. |
| MTT | 시그마-올드리치 | M2128 | 세포 증식 분석에 사용됩니다. |
| 정상 교세포(HEB) | 미국 조직 배양 컬렉션 | NA | 비교 연구를 위한 정상 인간 교세포주. DMEM + 10% FBS에서 배양됨. |
| 조직 고등부 예비 | 생체도체 | 4.8.3 | Go/KEGG 농축 및 GSEA; 여러 ID 유형을 지원합니다. |
| 피트맵 | 크랜 | 2.0.0 | 데이터 과학 문법; dplyr, tidyr, purrr, ggplot2 등 정리 및 플롯 작성용이 포함되어 있습니다. |
| 플스르콕스 | 크랜 | 1.5 | Cox 모델의 가능성 기반 부스트. |
| PVDF 멤브레인 | 밀리포어 | IPVH00010 | SDS-PAGE 이후 단백질 전달에 사용된 막. |
| 랜덤포레스트르크 | 크랜 | 6.0-94 | 통합 재샘플링(LOOCV 포함), 튜닝 그리드, 모델 파이프라인. |
| 리더 | 크랜 | NA | UCSC Xena에서 행렬/표현형(예: TCGA/GTEx 허브)을 검색하세요. |
| SDS-페이지 젤 (12%) | 바이오-래드 | 185-5096 | 정량적 PCR에 사용되는 시스템입니다. |
| 스트링DB | 생체도체 | 1.20.3 | 풍부도 결과 시각화(점도, cnetplot, ridgeplot). |
| 슈퍼PC | 크랜 | 1.7.7 | Cox 모델에 적응한 편소제곱 회귀. |
| 생존 | 생체도체 | 3.42.4 | 필요 시 정규화 및 분산 추정도 포함합니다(선택 사항, limma voom 보완). |
| 생존 | 크랜 | 1.01-2 | WGCNA에서 사용하는 빠른 계층적 클러스터링(선택 사항). |
| 서바이벌스VM | 크랜 | 2.2.2 | 일반화된 부스트 회귀 모델링(구배 부스트). |
| 서브마이너 | 크랜 | 3.8-3 | 콕스 비례 위험 모델; 카플란과 대쉬; 마이어 곡선. |
| TCGAbiolinks | 생체도체 | T9039 | TCGA 데이터에 대한 프로그래밍적 접근; 발현 및 임상 데이터를 다운로드/준비하세요. |
| 암 게놈 아틀라스 프로그램(TCGA) | NA | https://www.cancer.gov/tcga; 175 GBM과 534 LGG | 모델 구성 및 검증에 사용됩니다 |
| 타이디버스 | 크랜 | 1.17.6 | 대형 행렬/테이블을 위한 고성능 데이터 조작. |
| 타임록 | 크랜 | 0.5.0 | KM 시각화와 위험 표 렌더링. |
| 트리졸 | 인비트로젠 | 15596026 | 세포에서 RNA 추출을 위한 시약. |
| UCSC 제나 | NA | https://xenabrowser.net/datapages/ | 모델 구성 및 검증에 사용됩니다 |
| Ucscxenatools | 바이오-래드 | 4561044 | 서부 블롯 분석에서 단백질 분리에 사용됩니다. |
| WGCNA | 크랜 | 0.95 | 체크포인트 유전자와 특징 관계에 대한 상관 행렬. |
참고문헌
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