CAR T 세포에서 CRISPR-Cas9 스크리닝 개선: 라이브러리 준비를 위한 정교한 방법

요약

우리는 원발성 CAR T 세포에 대한 최적화된 CRISPR-Cas9 녹아웃 스크리닝 프로토콜을 개발했습니다. 효소 소화와 sgRNA 카세트 풀다운을 통한 gDNA 운반을 줄임으로써 PCR 인공물을 최소화하고 정확한 sgRNA 검출과 기능성 유전자 표적의 견고한 식별을 보장합니다.

초록

키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 치료는 여러 혈액학적 악성 종양에서 놀라운 효능을 입증했으나, 고형종양에서는 그 성공이 완전히 재현되지는 않았습니다. 더욱이 혈액암에서도 CAR T 세포 주입 후 재발은 장기적 결과를 계속 저해하고 있습니다. 이러한 도전 과제는 CAR T 세포의 효능, 지속력, 종양 및 미세환경 매개 내성 극복을 위한 전략 개발의 긴급함을 강조합니다. 클러스터 규칙 간격 짧은 회문 반복 복제(CRISPR)-Cas9 기반 스크리닝 플랫폼은 CAR T 세포 기능을 조절하는 유전자를 체계적으로 식별하는 강력한 접근법을 제공합니다. 유전적 교란과 표현형 결과를 연결함으로써, 이러한 분석은 활성화, 증식, 기억 형성, 세포독성을 조절하는 경로를 발견할 수 있게 합니다. 표준 워크플로우는 단일 가이드 RNA(sgRNA) 라이브러리를 이용한 다수의 세포 전도, Cas9 매개 편집, 편집된 세포 선별, 그리고 시퀀싱 전에 게놈 DNA(gDNA)에서 sgRNA 카세트의 PCR 증폭을 포함합니다. 그러나 대량의 gDNA를 이용한 PCR 증폭은 상당한 도전 과제를 안고 sgRNA를 선택적으로 증폭하거나 회수하지 못하는 경우가 많습니다. 여기서는 1차 인간 CAR T 세포에서 테스트한 최적화된 CRISPR-Cas9 녹아웃 스크리닝 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 sgRNA 라이브러리 준비 중 효소 소화와 sgRNA 카세트의 선택적 풀다운을 통해 gDNA 운반을 줄이는 중간 단계를 포함하여, 첫 번째 PCR 증폭의 효율을 높입니다. 이 변형 덕분에 기존 1단계 및 2단계 PCR 증폭 프로토콜로 시도했을 때 찾기 어려웠던 CAR T 세포 스크리닝에서 sgRNA 정보를 얻을 수 있게 되었습니다. 결론적으로, 이 최적화된 워크플로우는 까다로운 샘플에서 CRISPR 스크리닝 라이브러리 준비를 용이하게 하고, 치료 효과를 향상시키기 위해 표적화할 수 있는 주요 유전적 결정 인자를 식별할 수 있게 합니다.

서론

면역치료는 암 치료를 혁신적으로 변화시켰으며, 면역 체계를 활용하고 조절하는 새로운 전략을 제시했습니다. 이 중 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 치료는 가장 혁신적인 접근법 중 하나로 떠올랐습니다. 이 치료는 환자의 T 세포를 합성 수용체를 통해 특정 종양 항원을 인식하도록 설계된 유전공학을 포함하며, 이를 통해 항종양 활성을 증진시킵니다^. CAR T 세포는 혈액학적 악성 종양에서 놀라운 성공을 보였으며, CD19 또는 BCMA 표적 치료를 받은 환자에서 단기적인 관해부터 최소한의 독성 없이 장기간 무질병 생존까지 다양한 결과를 보였습니다^2. 현재까지 FDA는 혈액암을 위한 7개의 CAR T 세포 제품을 승인^{했습니다.} 이러한 발전에도 불구하고 상당한 한계가 남아 있습니다. 문제는 CAR T 세포 제품 자체에서 발생하며, 이는 제조 과정이나 환자의 T 세포 적합성에 의해 영향을 받으며, 질병 진행, 이전 치료법, 또는 나이 증가로 인해 손상될 수 있습니다. 항원 하향 조절과 같은 종양 내성 내성 기전도 효능을 저해할 수^{있습니다.} 더욱이, 면역억제 종양 미세환경은 특히 고형 종양^환자에서 CAR T 세포의 지속과 기능을 심각하게 제한하는 추가 장벽을 제공합니다. 따라서 CAR T 세포 치료제의 초기 및 장기 효능 모두를 시급히 향상시킬 필요가 있습니다.

CRISPR-Cas9 유전자 편집의 등장은 대규모 스크리닝 접근법을 통해 유전자 기능을 해부할 수 있는 강력한 도구를 제공했습니다. 이 분석에서 세포는 일반적으로 렌티바이러스 벡터에 의해 전달되는 단일 가이드 RNA(sgRNA) 라이브러리로 전도되어, 세포당 하나의 sgRNA와 안정적인 유전체 통합을 보장합니다. Cas9 매개 편집 및 형질전환 세포 선택 후, 유전체 DNA(gDNA)를 추출하고, sgRNA 카세트는 PCR로 증폭되어 라이브러리 준비를 수행합니다. 고처리량 시퀀싱은 다양한 표현형에 걸친 sgRNA 분포를 정량화하여 연구^과정의 긍정적 또는 부정적 조절 유전자를 식별할 수 있게 합니다.

CRISPR 스크리닝은 T 세포 생물학 탐구에 널리 적용되어 왔으며, 최근에는 CAR T 세포 성능 향상에도 활용되고 있습니다. 유전체 전면 스크리닝은 활성화, 증식, 분화 등 기본 T 세포 과정을 조절하는 요인을 확인했습니다. 예를 들어, FAM49B는 T 세포 수용체^{신호 전달 7}의 조절자로 확인되었고, SOCS1, TCEB2, RASA2, CBLB는 자극⁸ 후 증식에 필수적인 것으로 나타났습니다. 이러한 핵심 경로를 넘어, CRISPR 스크리닝은 T 세포 기억과 고진에 관여하는 유전자들도 밝혀냈습니다. 생체 내 연구에서는 Fli1이 기억이나 피로 전^구체를 방해하지 않고 효과기 반응을 강화할 후보로 확인되었으며, 염색질 재모델링 Arid1a는 T 세포 소진을 감소시키는 조절자로 확인되었습니다¹⁰. T 헬퍼 타입 2(Th2) 분화의 조절자도 이 접근법으로 특징지어졌습니다¹¹. 25개의 키나아제를 표적으로 하는 맞춤형 sgRNA 라이브러리를 사용하여, p38은 확장, 기억 형성, 산화 및 유전체 스트레스로부터의 보호를 촉진하는 것으로 밝혀졌다¹². 마찬가지로, CD8⁺ T 세포에서 REGNASE-1 녹아웃은 장수명 효과기 표현형을 부여하여 흑색종 및 백혈병 모델에서 종양 조절을 개선했습니다¹³. 추가적인 전유전체 스크리닝에서는 Dhx37이 T 세포 활성화 및 세포독성의 조절자로 확인^{되었으며,} LTBR 및 기타 유전자는 CAR T 및 γδ T 세포에서 T 세포 기능 증강자로 검증되었습니다¹⁵. 최근에는 CRISPR 스크리닝이 CAR T 세포에 직접 적용되어, PRODH2(프로린 대사에 관여하여 CAR T 항종양 활성을 증진시키는 효소)와 같은 새로운 표적(¹⁶), TLE4 및 IKZF2(이들의 비활성화가 교모세포종 모델에서 CAR T 효능을 향상시킨다)와 같은 새로운 표적을 발견했다¹⁷.

CRISPR 스크리닝에서 중요한 단계는 매우 많은 양의 gDNA로부터 sgRNA 카세트를 선택적으로 증폭하는 것으로, CRISPR 스크리닝에 사용되는 세포 수가 매우 많아 이를 극복하기 어려운 과제입니다. 이렇게 많은 양의 DNA 운반에서 PCR 증폭은 DNA 및 중합효소 분자의 물리적 확산을 제한하는 분자 과밀, 프라이머와 중합효소가 DNA 배경에 일시적으로 비특이적으로 결합하는 것, 프라이머 고갈로 인한 비표적 증폭, DNA 인산염 골격에 의한 Mg²⁺ 격리 등 여러 기술적 도전 과제를 안겨줍니다^{18, 19, 20, 21}. 이로 인해 PCR 실패나 편향이 발생하는 경우가 많습니다. 이러한 문제를 완화하기 위해, 어댑터 추가에서 sgRNA 증폭을 분리하여 두 단계의 PCR^단계로 분리하거나, 비티닐화 올리고와 자기 구슬 포획을 이용한 표적 농축^23,24, 또는 sgRNA 카세트 양옆에 제한 부위를 둔 플라스미드를 설계하여 조각 풍부화²⁵를 사용하는 등 다양한 전략이 제안되었습니다.

본 연구에서는 원발성 인간 CAR T 세포에 대한 최적화된 CRISPR-Cas9 녹아웃 스크리닝 프로토콜을 제시합니다. 사용되는 CRISPR 라이브러리는 Brunello Kinome 1로, 763개의 인간 키나제 유전자(표적당 4개의 sgRNA)를 표적으로 하는 3052개의 고유한 20nt 길이 sgRNA를 포함하고 있습니다. T 세포는 건강한 기증자의 말초 단핵세포(PBMC) 농축 분획에서 CD4⁺ 및 CD8⁺ 자기 양성 선택을 통해 분리하였다. 항-CD3 및 항-CD28으로 활성화된 후, T 세포는 CRISPR 스크리닝 라이브러리로 스핀펙션된 후 CAR 렌티바이러스로 전개되었습니다. 세포를 확장한 후 핵 분리되어 Cas9 단백질을 도입했습니다. CRISPR 보유 세포는 푸로마이신과 함께 선별되었고, CAR 양성 T 세포는 분류되었습니다. 추출 후, 유전체 DNA는 제한효소(RE)로 소화되었고, sgRNA가 포함된 조각들은 비오틴 프로브-스트렙타비딘 포획에 의해 추출되었습니다. 다음으로 sgRNA를 선택적으로 증폭하고 두 차례의 연속 PCR로 인덱싱한 후, 생성된 라이브러리가 시퀀싱되었습니다. gDNA 이월을 줄이는 중간 단계를 포함함으로써, 우리는 관심 있는 sgRNA를 선택적으로 회수하고 증폭할 수 있었고, 이를 통해 CAR T 세포에서 키나아제의 역할을 연구할 수 있게 되었습니다.

프로토콜

이 프로토콜은 나바라 대학교 지침에 따라 수행되었습니다. 모든 대상자는 서면 동의서를 제공했습니다. 이 연구에 사용된 시약과 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. T 세포 분리 및 활성화

1. PBMC 격리
   1. 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA) 튜브를 통해 헌혈자의 혈액 샘플을 채취하고, 혈액 샘플을 50mL 원뿔 튜브로 옮기며, PBS(희석 1:1)로 혈액을 희석합니다.
   2. 50mL 원뿔형 튜브 바닥에 밀도 구배 배지 15mL를 추가합니다(PBMC 밀도: 1.07). 그 다음, 밀도 구배 배지 층(피펫 컨트롤러의 가장 느린 속도) 위에 희석된 혈액 25mL를 조심스럽게 첨가합니다. 브레이크 없이 800× g 에서 30분간 원심분리기.
   3. PBMC 링/층을 파스퇴르 피펫으로 50mL 원뿔 튜브에 채취한 후 PBS를 총 50mL에 첨가하여 세척합니다. 650 × g 에서 원심분리기를 8분간 돌렸습니다. 상원액은 버리세요.
      참고: 상정액의 탁도를 확인하여 세포가 없는지 확인하세요. 의심스러울 경우, 현탁액을 원래 50mL 원뿔관 수의 두 배로 나누고, PBS를 50mL까지 추가한 후 다시 원심분리합니다.
   4. 50mL PBS에 재현탁합니다. 세포 계수기에서 아크리딘 오렌지-프로피듐 요오다이드(AOPI)로 세. 650 × g 에서 원심분리기를 8분간 사용했습니다.
2. CD4 및 CD8 자기 선택
   1. 형광 활성화 세포 분류(FACS) 버퍼를 준비합니다: PBS, EDTA 2.5 μM, BSA 0.5% 및 0.2 μm 필터.
   2. PBMC를 10×^{10 6 세포당} 무균 80 μL FACS 완충액에 재현탁하고, 10 6 세포당 10 μL CD4와 10 μL CD8 마이크로비즈를 추가× 10 6 세포당 투여합니다. 4°C에서 20분간 배양하세요.
   3. FACS 완충제 10mL를 추가하고 650 × g에서 8분간 원심분리기를 사용하세요. 상정액은 완전히 버리세요.
   4. 15mL 원뿔관 안에 FACS 완충액 1× 10당 500 μL에 재현탁합니다.
      참고: 한 구간은 200 x 10⁶ 셀을 수용할 수 있습니다.
   5. AutoMac(고속 자기 셀 분류기) 격리에는 Possel 프로그램을 사용하세요.
   6. PBS 10mL를 더한 후 형광 셀 카운터에서 AOPI로 계수한 후 650 × g 에서 8분간 원심분리합니다.
   7. 3% 인간 혈청(HS), 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S), 625 IU/mL 인터루킨(IL)-7, 85 IU/mL 이-15를 포함한 T 세포 성장 배양지에 세포 1 x 10⁶/mL를 재현탁합니다. 1mL당 10 μL T 세포 자극 시약을 첨가하고 잘 섞습니다. 24웰 플레이트(p24w)에 웰당 2mL를 배납하고 37°C에서 24시간 배양합니다.

2. CAR T 세포 생성 및 CRISPR 스크리닝

1. 라이브러리 감염 및 CAR 전개
   1. 해당 양의 렌티바이러스 CRISPR 라이브러리(예: Brunello Kinome 1 라이브러리)를 추가하세요. 보충표 1 참조), 적정 분석으로 결정된 후 8 μg/mL polybrene을 투여합니다.
   2. 700 x g 에서 원심분리하여 32°C에서 1시간 30분간 감염시킵니다.
   3. 배지를 3% HS, 1% P/S, 625 IU/mL IL-7, 85 IU/mL IL-15(최종 [세포]= 10⁶ 세포/mL)를 포함한 신선한 T 세포 배양지로 교체하세요.
   4. 6시간 후에는 해당 양의 CAR 렌티바이러스 벡터를 감염 배수(MOI)로 3에 추가하고 4일간 인큐베이팅합니다.
2. Cas 9 전기천공
   1. CAR T 세포를 채취하고, PBS로 한 번 세척한 뒤, 형광 세포 계수기에서 AOPI로 세포를 세세요.
   2. 전기천공 완충액에 4 μM Cas9을 준비합니다.
   3. CAR T 세포를 5개 × 10개⁶개 세포당 50 μL에 재현탁합니다. 기포가 생기지 않도록 멀티웰 큐벳 스트립의 각 웰에 50μL의 셀 현탁액을 조심스럽게 섞어 넣으세요. 그런 다음 피펫 팁을 사용해 가능한 기포를 제거하고 웰 가장자리를 따라 팁을 움직입니다.
      참고: 큐벳 내 어떤 웰에도 샘플이 없으면 같은 부피의 전기천공 버퍼를 추가하세요. 이 단계는 매우 중요합니다: 기계가 기포나 부피 차이를 감지하면 오류를 표시합니다.
   4. 프로그램 EXPAND T CELL 3 을 사용해 CAR T 세포를 핵 완성하세요.
   5. 세포를 큐벳 안의 인큐베이터에 37°C에서 40분간 보관하세요.
   6. 핵 세포를 3% HS, 1% P/S, 625 IU/mL IL-7, 85 IU/mL IL-15(최종 [세포]= 10⁶ cells/mL)를 포함한 T 세포 성장 배양지에 재현탁하여 37 °C에서 3일간 인큐베이션합니다.
3. 푸로마이신 선택
   1. 형광 세포 계수기에서 AOPI로 카운트하세요.
   2. IL7과 IL15가 포함된 T 세포 배양지를 사용하여 1 x 10⁶ 세포/mL로 조정하세요.
   3. 배지에 푸로마이신(2.5 μg/mL)을 첨가합니다.
   4. 세포를 2일마다 6일간 세고, 3% HS, 1% P/S, 625 IU/mL IL-7, 85 IU/mL IL-15, 2.5 μg/mL 푸로마이신을 포함한 세포 배양지를 사용하여 1 x 10^{6 세포} /mL로 조정합니다.
   5. % CAR 확인.
4. CAR T 세포 집단을 분리하여 -80 °C에 샘플(건성 세포 펠릿)을 보관합니다.

3. gDNA 분리

참고: 과정 전반에 걸쳐 세포나 gDNA 손실을 피해야 하며, 이는 sgRNA의 대표성을 저하시킬 수 있습니다. sgRNA 커버리지를 최소 500배 이상으로 목표로 하세요.

1. 세포 및 조직 DNA 추출 키트를 사용하여 샘플에서 gDNA를 추출합니다. gDNA 회수를 극대화하기 위해 두 번 용출하세요.
   참고: gDNA를 더 효율적으로 회수하기 위해 4 x 10⁶ 세포 한 컬럼을 초과하지 마십시오.
2. dsDNA 정량 키트로 gDNA 농도를 측정하세요.
   참고: 농도가 프로토콜의 후속 단계에 너무 낮으면 고체 상 가역적 고정(SPRI) 비드 기반 정화 시약을 사용하여 DNA를 농축하세요.

4. sgRNA 카세트 농축(및 gDNA 운반 제거)

1. 제한효소 소화
   1. 최대 5 μg gDNA와 20 U 효소/초(예: 브루넬로 키노메 1 라이브러리의 lentiGuide-puro 백본은 NdeI와 PspXI를 조합하여 사용)를 총 50 μL 용량으로 소화합니다. 원하는 sgRNA 표현도를 달성하기 위해 반응 수를 늘립니다.
      참고: 카세트 측면 영역에서 절단할 제한효소를 선택하되, 일부 sgRNA에 제한 부위가 포함될 수 있음을 유념하세요. 이 sgRNA들은 이 단계에서 손실되어 시퀀싱에 나타나지 않습니다. 이 가이드가 없으면 소화 조절 역할을 합니다. 보충 표 1은 PspXI와 NdeI에 의해 절단된 Kinome 1 sgRNA 목록을 보여줍니다.
   2. 37°C에서 열순환기에서 하룻밤 배양하세요.
   3. SPRI 정화 2회 수행.
      1. 10mL의 용출 완충제(EB)(10 mM Tris-HCl, pH 8.0)와 50mL의 신선 70% 에탄올을 준비합니다.
      2. 구슬을 소용돌이로 돌려 소화 산물에 100 μL을 추가합니다.
      3. 피펫팅으로 충분히 섞고 5분간 인큐베이팅하세요. 자석을 5분 더 자극하세요.
      4. 자석 위에 있을 때, 펠릿을 방해하지 않고 70% 에탄올 200 μL를 추가하세요. 30초 기다린 후 상원액을 버리세요.
      5. 4.1.3.3 단계를 반복해서 총 2번 세척합니다. 구슬을 2분간 말리세요.
      6. 자석에서 분리하고 40 μL 용출 버퍼를 추가한 후 피펫팅으로 비드를 재현탁합니다. 2분간 부양하세요.
      7. 2분간 자화시키고 상정액을 새 튜브로 옮기세요.
         참고: 이 프로토콜을 처음 설정할 때는 (모세관) 전기영동을 통해 소화를 검증하세요. 반드시 지시를 관찰하세요.
2. sgRNA 카세트를 풀어내는 모습.
   1. 스트렙타비딘 자기 구슬 제제.
      1. 세척/결합 버퍼 2회: 10 mM 트리스-HCl pH 7.5, 2 M NaCl, 1 mM EDTA. 부피의 절반을 H_2O에서 1x로 희석하세요.
      2. 비즈를 1분 동안 소용돌이로 돌리세요.
      3. 원하는 양의 비즈를 튜브(보통 1mg면 충분)로 옮기고, 같은 부피의 워시/바인딩 버퍼를 1배 또는 최소 1mL 정도 추가한 후 재현탁합니다.
      4. 튜브를 자석에 1분간 대고 상원액을 버리세요.
      5. 튜브를 자석에서 분리하고, 세척된 구슬을 바이알에서 채취한 초기 구슬 부피와 같은 1배 워시/바인딩 버퍼 부피에 다시 매달립니다.
      6. 이 과정을 총 3번 세척할 수 있습니다.
      7. 비즈를 2x 워시/바인딩 버퍼에 재현수하세요.
   2. 표 1에 나열된 10 μM 풀다운 프라이머 5 μL을 4.1.3.6단계의 정제 소화에 추가합니다.
   3. 96°C의 건조 욕조에서 5분간 배양한 후 즉시 얼음에 5분간 넣습니다.
   4. 미리 세척된 스트렙타비딘 자기 구슬 1mg을 추가하세요.
      참고: 비오틴-스트렙타비딘 결합은 1M NaCl에서 가장 효과적입니다. 비즈와 비티닐화된 DNA를 같은 양으로 섞으세요.
   5. 20분간 배양하면서 혼합물을 4분마다 다시 부유 시키세요.
   6. 5분간 자석화하세요.
   7. 비즈는 1× 워시/바인딩 버퍼로 3번 세척하세요.
   8. 구슬을 EB 8.0 50 μL 용액에 재현탁하세요.
      참고: 여기서 사용된 sgRNA 카세트는 스트렙타비딘 구슬에 결합되어 있습니다. 절대 버리지 마세요.

5. sgRNA 라이브러리 준비

1. PCR1
   1. PCR1 혼합물을 20 μL Herculase 5x 버퍼, 1 μL dNTP(100 mM), 1 μL DNA 중합효소, 표 1에 명시된 10 μM PCR1 프라이머 2.5 μL 및 PCR 등급 물 23 μL로 준비합니다. 피펫으로 4.2.8 단계의 비드에 PCR1 혼합물을 섞어 넣으세요.
      참고: 표 1에는 Brunello Kinome 라이브러리 1용으로 설계된 PCR1 프라이머가 나열되어 있습니다.
   2. 튜브를 열사이클러에 넣고 표 2에 설명된 PCR1 프로그램을 실행합니다.
      참고: 열사이클러가 100 μL 반응을 수용할 수 있는지 확인하세요. 그렇지 않으면 50 μL 반응으로 알리코트를 사용하세요. 필요에 따라 확장하세요.
   3. 동일한 샘플에서 모든 PCR1을 하나의 튜브에 모으세요.
   4. 150 μL(1.5x) 비드를 사용한 SPRI 정화 PCR1(4.1.3.3-4.1.3.7 단계를 따라). 각 PCR 반응을 EB 8.0 100 μL에 재현탁합니다.
      참고: 이 프로토콜을 처음 설정할 때는 30사이클 PCR 제품 2 μL을 모세관 전기영동 시스템(예: Agilent의 TapeStation Systems)에서 돌려 PCR 제품의 크기와 품질을 확인하세요.
2. PCR2
   1. PCR1 생성물 10 μL, 5X 버퍼 10 μL, dNTP 0.5 μL (100 mM), DNA 중합효소 1 μL, 표 1 에 명시된 10 μM PCR2 프라이머 1.25 μL (각 샘플마다 다른 rP7-i7-BC 및 P5-i5-BC 조합 사용), PCR 등급 물 26 μL 혼합물로 PCR2 혼합물을 준비하여 총 50 μL를 만듭니다.
      참고: 라이브러리 표현을 유지하기 위해, 라이브러리 내^{10 4} 개의 구성체마다 한 번의 PCR2 반응을 수행하세요.
   2. 튜브를 열사이클러에 넣고 표 2에 설명된 PCR2 프로그램을 실행하세요.
   3. SPRI PCR2 정화 작업: 75 μL(1.5배) 비드(4.1.3.3-4.1.3.7 단계를 따라). 각 PCR 반응을 EB 8.0 50 μL 용량에 재현탁합니다.
3. dsDNA 정량 키트를 사용하여 PCR2(즉, sgRNA 라이브러리)를 정량하고, 모세관 전기영동(예: TapeStation Systems)으로 앰플리콘 크기를 검증합니다. 샘플을 모으세요.
4. 일루미나 기기의 시퀀스.
   참고: 여기 있는 3052 sgRNA Brunello Kinome 1 라이브러리의 경우, 샘플당 1억-2억 번의 시퀀싱 깊이가 일반적으로 충분합니다.

6. 분석

1. bcl2fastq를 사용해 샘플을 디멀티플렉스합니다.
2. FastQC로 생성된 fastq 파일의 품질을 확인하세요.
3. sgRNA 양옆에 있는 카세트 서열과 가이드 길이(20 nt)를 패턴으로 추출합니다.
4. Bowtie2를 사용해 추출한 서열을 라이브러리 참조문헌과 정렬하여 가상의 가이드 중 몇 개가 라이브러리의 진짜 sgRNA인지 확인하세요. samtools를 사용해 정렬 정보가 담긴 SAM 파일을 BAM 형식으로 변환하고 요약 파일을 생성합니다.
5. MAGecK 소프트웨어의 카운트 함수로 편집 및 대조군 샘플의 각 sgRNA 리드 수를 세고 정규화합니다.
6. MAGecK의 검사 기능과 이 개수를 비교하여 RRA 점수와 후보 유전자 목록을 얻으세요.

결과

프로토콜 섹션에서 설명한 바와 같이, CAR T 세포는 우리가 정립한^{프로토콜 26}에 따라 생성되었습니다. CRISPR 스크리닝을 위해 우리는 Wang 등이 개발한 워크플로우를 적용했습니다. ¹⁷ (그림 1A). 간단히 말해, 두 명의 독립 기증자로부터 T 세포를 분리 및 활성화한 후 CRISPR sgRNA 라이브러리와 CAR 렌티바이러스 벡터로 연속 전도하여 5일째에 67%와 72% CAR 양성 세포에 도달하였습니다. 일부 세포는 Cas9 단백질로 핵 결합하여 녹아웃을 유도했고, 나머지 세포는 sgRNA 표현의 기준선 역할을 했습니다. 형질전된 세포는 항생제로 선별되었고, 이후 연구 대상의 표현형에 따라 뚜렷한 집단이 분류되었습니다. CAR T 세포 증식은 AOPI 기반 세포 수를 사용하여 스크리닝 전반에 걸쳐 모니터링되었으며, 접힘 변화로 표현되었습니다(그림 1B). 8일, 10일, 12일에 푸로마이신 보충 투여 후, CRISPR 라이브러리로 전달된 CAR T 세포가 두 기증자 모두에서 성공적으로 농축되었음을 확인했으며, 생존율과 증식이 계속 확인되었습니다. 항생제 선택 대조군으로 CRISPR 라이브러리 전도가 없는 비형질전변 T 세포(UTD)와 CAR T 세포를 사용하였다.

유전체 DNA 추출 후, PCR 증폭을 통해 sgRNA 라이브러리를 준비했습니다. 과도한 gDNA 운반으로 인한 문제를 극복하기 위해, 제한효소 소화와 sgRNA 카세트의 비오틴-스트렙타비딘 풀다운을 포함하는 프로토콜을 도입했습니다(그림 2A, B). gDNA는 sgRNA 카세트 양옆에 위치한 제한 효소 NdeI와 PspXI 표적 부위와 함께 소화되었습니다(그림 2C). PCR1 프라이머 어닐링 부위의 상류에 결합하도록 설계된 바이오티닐화 올리고가 sgRNA 카세트 조각을 포획하는 데 사용된 후, 스트렙타비딘 비즈로 끌어내어 운반되는 gDNA를 제거했습니다. sgRNA를 포함한 조각들은 선택적으로 증폭되어 2회의 연속 PCR을 통해 인덱싱되었습니다.

각 샘플의 라이브러리는 차세대 시퀀싱(NGS)을 사용하여 시퀀싱되었습니다. 탈다중화, 품질 관리 및 sgRNA 식별 후 MAGeCK 파이프라인으로 데이터를 분석하였습니다. 먼저, count 명령어가 대조군(기저) 및 Cas9 편집 샘플에서 sgRNA 읽기 수를 정량하고 정규화했습니다(그림 3A,B). 피어슨과 스피어먼 상관관계는 실험 기간 동안 sgRNA(기증자 gDNA)의 재현성이 플라스미드 라이브러리와 비교해 유지되었음을 나타냅니다(그림 3C). 다음으로, 테스트 명령은 두 조건을 비교하여 각 유전자에 견고한 순위 집계(RRA) 점수를 부여했습니다(그림 3D). 유의치 풍부하거나 고갈된 유전자는 p < 0.05, 로그 폴드 변화(LFC) > 0.5의 임계값을 사용하여 확인되었습니다(그림 3E). 마지막으로 Metascape를 사용하여 후보 유전자의 경로 풍부 분석을 수행하여, 확인된 조절자와 관련된 주요 유전자 온톨로지 용어를 밝혀냈습니다(그림 3F).

그림 1: CAR T 세포에서의 CRISPR 스크리닝. (A) CAR T 세포에서의 CRISPR 스크리닝 방식. (B) 푸로마이신(P)을 이용한 형질 세포 선별. 플라스미딘 라이브러리에는 양성 선택을 위한 푸로마이신 내성 유전자가 포함되어 있습니다. 항생제는 8일째에 비형질형변 샘플인 비형질(UTD) 및 CAR T 세포 및 형질전형화된 CAR T 세포에 첨가되었습니다. 퓨로마이신이 없는 샘플을 증식 통제군으로 사용했습니다. 두 명의 독립 기증자의 데이터가 제시되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: sgRNA 농축 분석을 위한 라이브러리 준비. (A) 도서관 준비를 위한 프로토콜 체계. (B) 제한효소(가위)의 절단 크기 상대적 위치 및 PCR1 프라이머(화살표) 및 비오티닐화 프라이머(녹색 점이 있는 화살표)의 어닐링 영역 도표. (C) re-re의 전후 소화 전후 gDNA의 전기영동. (D) PCR1 이후 sgRNA 카세트의 선택적 농축. 두 표현형의 기저 및 Cas9 샘플에서 두 명의 독립 기증자의 데이터가 제시되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: MAGeCK를 이용한 가이드 농축 분석. (A) MAGeCK 카운트 함수의 출력 요약. (B) 읽기 횟수의 분포. (C) 기증자 gDNA와 플라스미드 라이브러리 카운트 간의 상관관계를 위한 피어슨 및 스피어먼 계수. (D) 수정된 강건 순위 집계(RRA 점수)에 따른 잠재적 풍부/고갈 유전자. (E) 유의미한 유전자(p값 < 0.05, LFC > 0.5)를 빨간색으로 표시한 화산 플롯. (F) 메타스케이프 경로 분석 후 유전자 유전자 풍부화 유전자 온톨로지(GO) 용어를 최우선으로 제시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

표 1: 프라이머 순서. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 2: PCR 조건. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충표 1: Kinome 1 라이브러리 내 sgRNA 목록 및 NdeI 및 PspXI를 이용한 소화 과정에서 손실된 sgRNA 파일을 다운로드하시려면 여기를 클릭하세요.

토론

CRISPR 스크리닝은 단일 가이드 교란 원리에 의존하므로, 한 세포당 하나의 sgRNA만 통합되어야 합니다. 이를 위해 sgRNA는 일반적으로 렌티바이러스 벡터를 통해 전달되며, 감염 중복도(MOI)는 신중하게 조절되어야 합니다. 한 가지 MOI . 일반적으로 0.3이 권장되며, 전체 세포의 25%에서 30%가 단일 바이러스 입자⁶으로 형전환됩니다. 따라서 필요한 바이러스 입자의 양을 결정하는 데 정확한 적정이 필수적입니다. 또 다른 중요한 단계는 프로토콜 중 sgRNA 커버리지가 상실되는 것입니다. 채취 중 세포 손실, gDNA 추출 시 비효율(특히 컬럼 과부하 및 DNA 불완전 용출), PCR 증폭 시 과도한 주형이 이 손실에 기여하여 sgRNA 분석을 왜곡할 수 있습니다. 비오티닐화 올리고에 관해서는, 합성에 사용되는 자유 비오틴이 스트렙타비딘 구슬에 포화되는 것을 방지하기 위해 HPLC 정제하는 것이 가장 좋습니다. 더불어, 이후 PCR에서 바이오티닐화 프라이머의 증폭을 방지하기 위해 3' 아미노 조절제가 강력히 권장됩니다. 또한, 이 올리고를 설계할 때는 증폭 중 경쟁을 방지하기 위해 PCR1 프라이머와의 중복을 피해야 합니다. 또한 생물정보학적 분석은 세심한 주의가 필요합니다: sgRNA 추출 패턴은 플라스미드 골격(예: lentiGuide-puro 또는 lentiCRISPR v2)에 따라 달라지며, 정렬 엄격성은 정확한 일치에서 불일치에 대한 어느 정도의 허용 범위까지 다양할 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜에는 소화 단계가 포함되어 있기 때문에, 제한 부위를 포함한 일부 sgRNA가 손실될 수 있어 참조 라이브러리 조정이 필요합니다.

본 연구에서는 소화와 더 중요한 풀다운 단계를 통해 sgRNA 함유 조각을 농축하는 최적화된 CRISPR 스크리닝 라이브러리 준비 프로토콜을 제안합니다. 제한효소 소화는 이전에 gDNA 입력을 줄이고 sgRNA 카세트를 농축하는 전략으로 제안된 바 있다²⁷. 마찬가지로, 비오티닐화 프로브는 분자생물학에서 특정 핵산 또는 단백질-핵산 복합체^{28, 29, 30, 31}을 포획하는 데 널리 사용되어 왔습니다.

우리 프로토콜은 이러한 원칙을 기반으로 하여 1차 CAR T 세포의 CRISPR 스크리닝에 적용하지만, 몇 가지 한계가 있음을 인정해야 합니다. 첫째, 1차 CAR T 세포는 확장 용량이 제한되어 스크리닝 규모에 제약을 가합니다. 충분한 커버리지와 sgRNA 표현을 유지하기 위해서는 많은 수의 시작 세포가 필요합니다. 이 방법이 불가능할 때는¹²개의 작은 맞춤형 라이브러리를 사용할 수 있지만, 이는 유전적 조사의 폭을 줄입니다. 생물학적 변이성도 또 다른 도전 과제입니다; 기증자 간 차이는 예상되며, 중요한 타격 중 겹치는¹⁷은 보통 적은 정도입니다. 둘째, 농축 전략은 제한효소 절단 부위의 존재와 위치에 의존합니다. 드물게는 이들 부위가 sgRNA 서열 내에 존재할 수 있는데, 이는 중복성이 제한된 작은 라이브러리에서는 더 문제가 됩니다. 하지만 대부분의 라이브러리, 특히 유전체 전체 설계에서는 표적당 여러 개의 sgRNA를 포함하여 가이드 손실의 전반적인 영향을 최소화합니다. 마지막으로, 프로브 캡처²⁴와 결합된 초음파 검사와 같은 대안적 분열 기반 농축 전략은 제한효소 소화가 적합하지 않은 경우 유연성을 제공할 수 있습니다.

전반적으로 sgRNA 카세트는 CRISPR 편집 세포 내 전체 유전체 DNA의 극히 일부에 불과하므로, 효율적인 농축이 성공적인 라이브러리 준비에 매우 중요합니다. 표준 프로토콜과 비교할 때, 최적화된 워크플로우는 gDNA 운반을 줄이고 관심 있는 sgRNA의 PCR 증폭을 우선시합니다. gDNA 단편화와 비티닐화 프로브 풀다운, 그리고 스트렙타비딘 비즈의 조합은 개념적으로 새롭지 않지만, CRISPR 스크리닝에 통합함으로써 일반적인 PCR 함정을 피하고 CRISPR 스크리닝의 재현성을 높입니다. 더불어, 각 핵심 단계(분류 후 T세포 순도, 퓨로마이신 내성 세포 비율, gDNA 무결성, CAR 전도 효율 등)에 표준화된 품질 관리 지표를 도입하면 워크플로우의 견고성과 재현성을 더욱 높일 수 있습니다. 결론적으로, 원발 CAR T 세포 맥락에서 개발되었고 기증자가 두 명뿐인 경우(각 기증자로부터 여러 샘플을 사용했음에도 제한이 있을 수 있음), 이 최적화된 프로토콜은 대량 gDNA 운반이 있는 다른 CRISPR 스크리닝 및 NGS 워크플로우에도 널리 적용할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
4200 테이프스테이션	애질런트	G2991A
아크리딘 오렌지	인비트로젠	A1301
플루어 XP	벡먼 쿨터	A63881
autoMACS NEO 분리기	밀텐이	130-120-327	고속 자기 셀 분류기
비오티닐화 올리고	IDT
BSA	시그마	A9647
셀로미터 K2 형광 세포 계수기	리비티	CMT-K2-MX-150	형광 세포 계수기
CHT4 카운팅 챔버	리비티	CHT4-SD100-002
CytoSinct CD4 나노비즈	젠스크립트	L00863-1
CytoSinct CD8 나노비즈	젠스크립트	L00864-1
dNTP	애질런트	200418-51
다이나비즈 M-280 스트렙타비딘	인비트로젠	11206D
다이나매그-2 자석	인비트로젠	12321D
EDTA 0.5 M pH 8.0	인비트로젠	15575-038
에탄올	머크	1,00,98,31,000
ExPERT ATX 전기포공기	맥스사이트	엑스퍼트 ATx
피콜-파케	시티바	17544203
필트로푸르 S 0.2 및 마이크로; m	사르스테트	83,18,26,001
GenCRISPR 울트라 NLS-Cas9-연구	젠스크립트	Z03621-1
허큘레이즈 버퍼 5X	애질런트	600675-52	5배 버퍼
허큘라스 II 융합 효소	애질런트	600679-51	DNA 중합효소
IL-15	밀텐이	130-095-765
IL-7	밀텐이	130-095-362
마스터사이클러 X50a	에펜도르프	6313HG006059
맥스사이트 전기천공 버퍼	시티바	EPB1
NdeI	뉴잉글랜드 바이오랩스	R0111L
뉴클레오스핀 조직	마셰레이-나겔	74,09,52,250
PBS	깁코	14190-094
폴리브렌	머크	TR-1003-6
프라이머	서모피셔
프로피듐 요오드	시그마	P4864
PspXI	뉴잉글랜드 바이오랩스	R0656S
푸로마이신	깁코	A11138-03
큐비트 3.0 형광도계	인비트로젠	Q33216
큐비트 HS DNA 분석법	인비트로젠	Q32851
R-50x3 무균 우물 처리 조립체	맥스사이트	LM243882
T 세포 트랜스액트 인간	밀텐이	130-111-160	T 세포 자극 시약
테이프 스테이션 HSD1000	애질런트	5067-5585
텍스맥스	밀텐이	130-097-196	T 세포 배양지
트리스 버퍼, 1.0 M, pH 8.0, 분자생물학 등급	EMD 밀리포어	648314
분자생물학을 위한 물, DNAse, RNAse 및 프로테아제 프리	열과학	327390010