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연구 논문

심부전에서 DBNL의 분자 기전: 대식세포 면역대사에서 치료적 함의까지

445 조회수

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DOI:

10.3791/69756

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2026년 1월 2일

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1Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Ningbo University, 2Department of Cardiology, the Second Affiliated Hospital of Zhejiang University

이 논문에서

요약

우리는 다체체학 멘델 무작위화, 단세포 전사체학, 구조 기반 사리코 스크리닝을 통합하여 심부전에서 드레브린 유사(DBNL)-대식세포 축을 체계적으로 구분하는 프로토콜을 제시합니다. 우리는 DBNL을 약물 가능한 면역대사 표적으로 제안합니다.

초록

심부전(HF)은 여전히 전 세계적으로 주요 보건 과제로 남아 있으며, 그 핵심 병태생리학적 메커니즘을 겨냥한 효과적인 치료법은 제한적입니다. 본 연구에서는 멘델 무작위화(MR)와 단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)을 결합한 통합 다중체학 접근법을 사용하여 HF의 잠재적 바이오마커와 치료 표적을 규명하였습니다. 우리는 유전체 전역 연관 연구(GWASs), 발현 정량 형질 유위(eQTLs), 메틸화 정량 형질 유위(mQTLs), 단백질 정량 형질 유위(pQTLs) 데이터를 활용하여 HF의 유전적 메커니즘을 조사하였습니다. 단세포 RNA 시퀀싱을 통해 심장 대식세포의 유전자 발현을 분석했고, 의사시간 분석을 통해 대식세포 분화 중 DBNL의 동적 조절을 연구하였습니다. 분자 도킹 및 역학 시뮬레이션을 통해 피리닉식산(WY-14643; PubChem CID: 4594; 동의어: 50892-23-4; WY-14643)는 DBNL의 잠재적 규제기관으로 평가받고 있습니다. 멀티오믹스 분석 결과 DBNL(드레브린 유사)이 HF 위험과 관련된 핵심 유전자임이 밝혀졌습니다. 단세포 RNA 시퀀싱 결과 DBNL은 주로 심장 대식세포에서 발현되며 병리학적 조건에서 상향 조절된다는 사실이 밝혀졌습니다. 대식세포에 의한 DBNL 발현은 면역 대사 및 전섬유화 경로, 특히 IL-6/JAK/STAT3, PI3K/AKT/mTOR, TGF-β 신호 전달 경로와 관련이 있습니다. 의사 시간 분석에 따르면 DBNL은 특히 만성 염증에서 대식세포 분화에 동적 조절 효과를 가진다. 분자 도킹과 동적 시뮬레이션 결과 피리딘산이 DBNL 조절에 잠재적 역할을 할 수 있음이 밝혀졌습니다. 이 연구는 DBNL이 심부전 진행에서 어떤 역할을 하는지 밝히고, 치료 표적으로서의 잠재력을 시사합니다. 중요한 점은 치료적 관련성이 계산적 예측에서 추론된다는 것입니다. 이 발견들은 면역 대사와 대식세포 매개 세포간 소통에 대한 새로운 통찰을 제공하며, DBNL 표적 약물 최적화 및 기능 연구의 향후 응용을 위한 이론적 기반을 마련합니다. 그럼에도 불구하고 DBNL이 치료 표적으로서 임상적 효능을 입증하려면 추가적인 실험적 검증과 전임상 연구가 필요합니다.

서론

심부전(HF)은 전 세계 수백만 명에게 영향을 미치고 의료 시스템에 상당한 경제적 부담을 주는 중대하고 점점 커지는 글로벌 보건 문제를 대표합니다. 따라서 심부전(HF) 관리에 효과적인 개입이 시급히 필요합니다.

심부전의 복잡한 병태생리는 좌심실의 심근 수축력 저하에서 비롯되며, 이는 폐 및 말초 울혈과 같은 전신 합병증의 연쇄 연쇄 반응으로 이어집니다2. 그러나 심부전 진행의 근본적인 병태생리학적 기전, 특히 심근 재형성에 대한 직접적인 해결은 여전히 중요하고 해결되지않은 과제로 남아 있습니다. 최근 수십 년간 생의학 연구 분야는 주로 다중체학 기술과 첨단 생물정보학 방법론의 도입으로 촉진된 상당한 패러다임 전환을 겪었습니다. 이러한 도구들은 새로운 질병 바이오마커와 치료 표적을 식별할 수 있는 탁월한 기회를 제공합니다. 엄격한 유전학적 역학 접근법인 멘델 무작위화(MR)는 단일 염기-다형성(SNP)을 도구적 변수로 사용하여 유전 노출과 임상 결과 간의 인과관계를 추론합니다. 무작위 대조 시험의 방법론적 틀을 채택함으로써, 멘델 무작위화(MR)는 교란 및 역인과관계 문제를 효과적으로 해결하여 약물 표적 식별과 재용도에 대한 강력한 증거를 제공합니다. 동시에 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)은 조직의 이질성을 탁월한 해상도로 밝혀내어, 심장과 같은 복잡한 기관 내 세포 유형 특이적 유전자 발현과 세포 간 통신망에 대한 깊은 통찰을 제공합니다. 유전, 전사체, 단백질체 데이터를 종합하는 다중체학 접근법은 질병 기전을 밝히고 치료 경로를 규명하는 데 상당한 잠재력을 제공합니다.

이러한 기술 발전에도 불구하고, 심부전에서 심장 염증과 재형성을 촉진하는 구체적인 세포 및 분자 기전에 관한 상당한 지식 공백이 여전히 존재합니다. 누적된 증거는 면역 세포, 특히 대식세포가 심근 손상 및 만성 심부전 과정에서 염증 반응과 이후 조직 재형성을 조율하는 데 매우 중요하며, 이는 질병 진행에 매우 중요하다는 것을 시사합니다6. 이전 연구들은 주로 광범위한 염증 매개체나 세포 표면 표지자에 집중되어 이 중요한 면역 세포 집단 내에서 세포 내 조절 표적 탐구에 상당한 공백이 생겼습니다. 또한, 전통적인 전유전체 연관성 연구(GWASs)는 심부전과 관련된 수많은 유전적 연관성을 확인했지만, 명확한 인과관계를 확립하는 데 어려움을 겪는 경우가 많아 직접적인 치료 번역에 적용 가능성이 제한됩니다7. 따라서 DNA 메틸화(mQTLs), 유전자 발현(eQTLs), 단백질 풍부도(pQTLs)에 영향을 미치는 유전적 변이들을 포함하는 포괄적인 다체체 멘델 무작위화(MR) 프레임워크의 구현은 여러 생물학적 조절 계층에 걸쳐 보다 견고한 인과 추론을 달성하는 데 필수적입니다. 이 접근법은 단일 층 QTL 연구의 고유한 한계를 해결합니다. 특히 Drebrin-like(DBNL) 단백질은 신경 발달과 세포골격 역학 맥락에서 광범위한 연구의 대상이 되었습니다8; 그러나 심혈관 질환, 특히 심부전에서의 기능적 중요성과 치료 잠재력은 아직 거의 탐구되지 않았습니다. 이러한 이해의 큰 격차는 DBNL을 심부전 치료에서 신약개발의 새롭고 잠재적 타깃으로 고려하는 데 장애가 됩니다.

이러한 중요한 지식 공백을 해소하기 위해, 본 연구는 eQTL, mQTL, pQTL 데이터를 결합한 통합 다중체학 MR 프레임워크를 통해 심부전 위험과 인과적으로 연관된 핵심 유전자를 견고하게 규명하는 것을 목표로 합니다. 본 연구는 발현 정량 형질 유위(eQTLs), 메틸화 정량 형질 유적위(mQTLs), 단백질 정량 형질 유위(pQTLs)를 포함한 다중체학 멘델 무작위화 분석과 고해상도 단세포 전사체 데이터(GSE161470) 및 대량 전사체 데이터(GSE161472)를 통합하여 DBNL 유전자를 심부전의 중요한 인과 위험 인자로 체계적으로 규명하는 새로운 접근법을 제시합니다. 이 연구 결과는 DBNL이 주로 심장 대식세포에서 특이적으로 발현되며, 분화 과정에서 그 발현이 동적으로 변화함을 보여줍니다. 더불어, 본 연구 결과는 DBNL이 심장 면역 미세환경 조절과 IL-6/JAK/STAT3 신호 전달 연쇄 및 전섬유화 신호 경로와 같은 심부전 관련 면역대사 경로를 조율하는 데 있어 중추적 역할을 함을 밝혀냈습니다. 또한, 계산생물학 기법을 활용해 본 연구는 피리딜산(WY-14643)이 DBNL에 대한 고친화성 리간드임을 예측하여, DBNL을 심부전의 새로운 치료 표적으로 지정하고 표적 약물 중재 개발을 촉진하는 포괄적이고 다차원적인 이론적 틀을 제공합니다. 단일 세포 RNA 시퀀싱을 사용하여 심장 미세환경에서 확인된 핵심 유전자 DBNL의 세포 특이적 발현과 기능 경로를 특성화하고, DBNL이 면역대사 및 전섬유화 신호 전달 경로, 그리고 심장 세포 간 세포 간 소통에서 어떤 역할을 하는지 조사하였습니다. DBNL에 잠재적 소분자 리간드는 계산적 분자 도킹과 분자 동역학 시뮬레이션을 통해 확인되었습니다. 우리는 주로 심장 대식세포에서 발현되는 DBNL이 면역대사 경로와 세포 간 교차 반응을 조절함으로써 심부전 진행에 인과적 영향을 미칠 것이라고 가설을 세웠습니다. 요약하자면, 첨단 다중체학 멘델 무작위화와 고해상도 단세포 분석을 통합함으로써, 우리는 심부전의 새로운 치료 표적을 체계적으로 규명하고 특성화했으며, 잠재적 소분자 조절자 표적을 탐구했습니다.

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프로토콜

데이터 다운로드
유전자 발현 데이터
본 연구에 사용된 단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq) 데이터는 국립생명공학정보센터(NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)가 관리하는 유전자 발현 옴니버스(GEO) 저장소에서 가져온 것으로, 특히 9번 GSE161470( 인간 심장 조직, 4개의 대조 표본과 1개의 병리학적 표본으로 구성)의 데이터셋에서 수집되었습니다. 이 데이터셋은 원래 2022년 Zhang 등에 의해 발표되었습니다. 원래 연구의 주요 목적은 심부전 상태에서 인간 심장 조직의 세포 이질성과 분자 조절 메커니즘을 조사하는 것이었습니다. 현재 분석을 위해 이 데이터셋에서 인간 심장 조직에서 얻은 포괄적인 단일 세포 발현 프로필을 포함하는 5개의 샘플을 선정하였습니다. 이 연구에서 사용된 다른 데이터셋도 NCBI GEO 공개 저장소에서 얻었으며, 특히 등록번호 GSE161472에 해당하는 시리즈 매트릭스 파일과 주석 파일 GPL11154. 발현 프로필은 총 84개의 샘플로 구성되며, 이 중 37개는 대조군 샘플, 47개는 질병 샘플입니다. 이 연구는 통합적 다중체학 분석을 포함하며, 모든 조사는 공개적으로 접근 가능한 데이터를 사용하여 수행됩니다.

eQTL 데이터
eQTL 데이터는 eQTLGen 컨소시엄에서 얻어, 혈액 내 유전자 발현의 유전적 틀과 복잡한 형질에 영향을 미치는 유전적 요인을 밝히는 데 중점을 둡니다3. 컨소시엄은 현재 광범위한 프로젝트의 2단계에 참여 중이며, 혈액 유전자 발현과 관련된 전장 유전체 데이터의 메타분석을 수행하고 있습니다.

노출 데이터 - mQTL
mQTL 데이터는 유럽(EUR) 코호트에 대한 발표된 메타분석에서 얻어졌으며, 이는 유럽 혈통11 집단 3,701표본의 유전적 틀 내에서 전혈 DNA 메틸화를 조사한 것입니다. 데이터셋에는 426,636개의 mQTL 형질에 대한 정보가 포함되어 있습니다.

노출 데이터-pQTL
혈장 pQTL 데이터는 deCODE 데이터베이스(https://www.decode.com/summarydata/)4에서 수집되었습니다. 이 연구는 2021년 deCODE pQTL 데이터셋을 활용하여, 유럽계 35,559명의 코호트에서 4,907개의 앱타머를 이용해 혈장 단백질 수준을 측정한 전유전체 연관 연구(GWAS)를 포함합니다.

결과 데이터
심부전의 요약 통계는 주로 유럽계 혈통 참가자를 대상으로 한 대규모 유전체 전역 연관 연구(GWAS)에서 얻어졌으며, 유럽 생물정보학 연구소(EBI) 데이터베이스(GCST90162626)를 통해 접근하였습니다. 심부전 데이터셋에는 115,150건의 사례와 1,550,331명의 대조군이 포함되었습니다. GWAS 카탈로그는 출판물, 주요 협회, 상세 요약 통계를 포함하며, 현재 Genome Assembly와 dbSNP Build에 매핑된 데이터를 제공합니다.

mQTLs, eQTLs, pQTL의 멘델 무작위화 분석
유전자 발현, 단백질 풍부도, DNA 메틸화 수준, 심부전 위험 간의 잠재적 인과관계를 체계적으로 조사하기 위해, 발현 정량 형질 유위(eQTLs), 단백질 정량 형질 유위(pQTLs), 메틸화 정량 형질 유위(mQTLs) 데이터셋을 활용한 멘델 무작위화(MR) 분석이 수행되었습니다. 노출 데이터 전처리 단계에서 각 노출 변수(유전자, 단백질 또는 메틸화 부위)와 관련된 단일 염기다형성(SNP)을 해당 데이터베이스에서 유전체 유의치 값 P < 1 × 10⁻⁵로 추출하여 초기 후보 기기 변수(IV)로 사용했습니다. 이후 각 노출 인자의 IV에 대해 10,000 킬로베이스(kb)의 윈도우 크기와 LD R² 임계값 0.001을 사용하여 연관 비평형(LD) 집결을 수행하여 기기 간 독립성을 보장하였습니다. 이 선정된 IV들은 심부전 전역 유전체 연관 연구(GWAS; ID: GCST90162626) read_outcome_data 함수를 사용하여 결과 데이터셋에서 5×10⁻⁵ 미만의 연관 P 값을 보이는 SNP만 유지합니다. 약한 기기 편향을 완화하기 위해 각 IV의 F 통계량은 F = (β_exposure/SE_exposure)²로 계산되었으며, 이후 분석에는 F > 10을 가진 기기만 포함되었습니다. 인과 효과 추정을 위해 TwoSampleMR 패키지의 harmonize_data 함수를 사용하여 노출 데이터셋과 결과 데이터셋 간의 대립유전자 정렬을 수행했습니다. 이후 MR 분석은 네 가지 보완적 통계적 접근법을 사용하여 수행되었습니다: (1) SNP 간 Wald 비율 추정치의 메타분석을 제공하는 역분산 가중(IVW) 방법; (2) MR-에거 회귀, 즉 직접효과 독립적 기기 강도(Instrument Strength Independent of Direct Effect, InSIDE) 가정 하에 인터셉트 항을 포함하여 방향성 다면전사를 설명하는 방법; (3) 가중 중앙값 방법으로, 최대 50%의 도구가 무효하더라도 일관된 인과 추정치를 제공합니다; 그리고 (4) 가장 빈번한 인과 효과 추정 군집을 식별하는 가중 모드 방법으로, MR-Egger에 비해 통계적 검정력이 향상되고 제1형 오차가 감소합니다. 단일 기기 변수만 가능한 경우에는 Wald 비율 방법만 적용되었습니다. 결과의 견고성을 평가하기 위해, mr_heterogeneity 함수를 이용한 이질성 검사, mr_pleiotropy_test를 이용한 다면형성 평가, 그리고 개별 변이가 전체 결과에 미치는 영향을 평가하기 위해 각 SNP를 반복적으로 배제하는 mr_leaveoneout 함수를 통한 리브-원아웃 분석 등 포괄적인 민감도 분석이 수행되었다. 중요한 연관성은 mr_scatter_plot와 mr_forest_plot 같은 그래픽 도구를 사용해 시각화되었습니다. 이 분석 파이프라인은 eQTL, pQTL, mQTL 데이터셋 전반에 걸쳐 일관되게 적용되어 연구 전반에 걸쳐 방법론적 일관성을 유지하였습니다.

공동위치 분석
Coloc 방법, eQTL 요약 데이터, 심부전5의 GWAS 분석을 통해 공동 위치 분석을 수행하였습니다. 지수 단일 염기체 다형성(SNP)을 사용하여 100 kb 덩어리 창 내 사후 확률을 계산하였습니다. 공동 위치(coloc) 분석에서 가설 H3는 유전자 발현과 심부전이라는 두 특성이 상관관계가 있지만 뚜렷한 인과 변이를 가질 사후 확률을 나타냅니다. 반대로, H4 가설은 두 특성 간의 연관성이 단일 공통 인과 변이에 기인할 사후 확률을 나타냅니다. SNP의 임계값. 추진 H4가 0.90보다 큰 값을 사용하여 공존 위치를 결정하였다.

면역 침윤
CIBERSORT 방법은 미세 환경 내 면역 세포 유형을 평가하는 데 널리 채택된 기법입니다. 지원 벡터 회귀 원리를 활용하여 면역 세포 아형의 발현 매트릭스에 대한 디컨볼루션 분석을 수행할 수 있습니다. 547개의 바이오마커를 통합함으로써, CIBERSORT는 T 세포, B 세포, 형질세포, 다양한 골수세포 하위 집단 등 22가지 인간 면역 세포 표현형을 구분할 수 있습니다. GSE161472 데이터셋을 활용하여 CIBERSORT 알고리즘과 통합 LM22 서명 행렬을 결합해 분석이 수행되었으며, 이 행렬은 22가지 서로 다른 인간 면역 세포 유형의 유전자 발현 프로필을 특성화합니다. 이 22개 면역 세포 집단의 침윤 수준은 각 개별 샘플에 대해 정량화되었습니다. 이후 cor.test 함수를 적용하여 주요 유전자의 발현과 해당 면역 세포 침윤 수준 간의 상관관계를 평가하였습니다.

단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터 처리 및 품질 관리
단일 셀 발현 프로필 데이터는 R(V4.3.0) 환경6에서 Seurat (V4.3.0) 패키지를 사용하여 처리되었습니다. 이 연구는 단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터 분석을 위한 전통적인 워크플로우를 활용했습니다. 초기에는 표현식 프로필이 Seurat 패키지를 사용하여 가져왔습니다. 세포는 각 세포의 총 UMI 수, 발현 유전자 수, 미토콘드리아 리드 비율, 리보솜 리드 비율 등 여러 품질 지표를 기준으로 필터링되었습니다. 이상치는 중앙값에서 3개 이상의 절대 중앙값 편차(MADs) 이상으로 벗어난 값으로 식별되었습니다. 적용된 특정 필터링 임계값은 다음과 같았습니다: nFeature_RNA ≥ 200, percent.mt ≤ 2.15718, nFeature_RNA ≤ 2840.941, nCount_RNA ≤ 5194.27. 일반적으로 총 UMI 수와 발현 유전자 수가 지나치게 높은 세포는 이중형으로 분류되었고, 미토콘드리아 또는 리보솜 리드 비율이 높은 세포는 저질로 간주되어 세포자사멸사나 분열이 발생할 가능성이 있었습니다. 이러한 필터링 단계를 거쳐, DoubletFinder(버전 2.0.4)가 각 샘플에서 더블릿을 개별적으로 식별하고 제거하여 세포 품질 관리 과정을 완성했습니다. 초기에는 정규화 기능이 있어서 데이터 정규화가 수행되었습니다. 세포주기 상태는 이후 CellCycleScoring 함수를 통해 평가되었고, FindVariableFeatures 방법을 통해 매우 변이가 큰 유전자가 확인되었습니다. 데이터셋은 ScaleData를 사용해 데이터를 표준화하고 미토콘드리아 유전자, 리보솜 유전자, 세포 주기 영향이 하위 분석에 미치는 영향을 완화하기 위해 확장되었습니다. 선형 차원 감소는 RunPCA 함수를 통한 주성분 분석(PCA)을 사용하여 수행되었으며, 주요 성분은 추가 분석을 위해 선택되었습니다. 서로 다른 샘플 간 배치 효과를 해결하기 위해 Harmony 알고리즘(버전 1.1.0)이 사용되었습니다. 이 접근법은 PCA 공간 내에서 서로 다른 배치의 유사한 세포들을 반복적으로 클러스터링하면서 클러스터 내 배치 다양성을 유지합니다. 데이터셋에서 관찰된 비교적 약한 배치 효과를 고려하여 기본 매개변수(θ = 2)를 적용하였습니다. 이후 RunUMAP을 사용하여 비선형 차원 축소가 수행되었고, 이어서 FindNeighbors를 통한 셀 이웃 그래프와 FindClusters를 통한 셀 클러스터링이 이루어졌습니다. 세포 유형 주석을 위해서는 계층적 주석 프레임워크가 구현되었습니다: 1차 수동 주석은 CellMarker 데이터베이스와 관련 문헌에 기반한 특징적인 유전자 발현 패턴을 기반으로 했고; 참고 자료로 SingleR 소프트웨어에서 얻은 자동 주석 결과도 보완되었습니다. 세포 유형 식별의 정확성과 포괄성을 더욱 높이기 위해 인간 일차 세포 지도(HPCA), BlueprintEncode, MonacoImmune, DatabaseImmuneCell, Novershtern Haematopoietic 등 여러 권위 있는 데이터베이스를 참고하였습니다. 셀 주석은 CellMarker(http://117.50.127.228/CellMarker/CellMarkerBrowse.jsp) 데이터베이스를 조회하고 문헌을 검토하는 방식으로 수행되었으며, SingleR(V2.4.0) 소프트웨어13의 자동 주석 지원을 받았습니다. 해당 조직에 존재하는 세포 유형과 그에 따른 마커 유전자를 식별하는 것을 목표로 합니다14.

리간드 - 수용체 상호작용 분석
본 연구에서는 CellCall(버전 1.0.7)을 사용하여 셀룰러 간 통신망에 대한 포괄적인 분석을 수행했습니다. Seurat에서 파생된 세포 유형 주석과 원시 계수 행렬을 함께 활용하여 인간 게놈에 맞게 구성된 매개변수를 가진 정규화된 분석 객체가 구축되었습니다. TransCommuProfile 함수는 가중 알고리즘을 통해 세포-세포 상호작용의 강도를 정량화하는 데 적용되었으며, 신뢰할 수 있는 리간드-수용체 쌍을 식별하기 위해 p값 0.05< 유의한 임계값을 구현했습니다. 유의미한 상호작용 쌍들은 getHyperPathway 함수를 통해 KEGG 경로 풍부 분석을 수행했으며, 세포 유형과 경로 간의 관계는 버블 플롯을 통해 설명되었습니다. 전체 통신망은 궁극적으로 원형 플롯을 통해 시각화되었으며, 여덟 가지 뚜렷한 색상이 서로 다른 세포 유형을 나타냈다. 상호작용 강도와 방향성은 화살표 특징으로 표현되어 세포 간 신호 전달 역학을 상세히 특성화할 수 있었습니다.

의사시간 분석
심부전 진행 전반에 걸친 대식세포의 동적 전사 조절을 조사하기 위해, 본 연구는 단클 알고리즘을 사용하여 대식세포 아집단에 대한 의사시간 분석을 수행하였습니다. 목표 세포 하위 집단에 대응하는 유전자 발현 행렬을 추출하여 단일 세포 궤적 분석 객체를 구성했으며, 고가변 유전자를 순서 특징으로 선택했습니다. DDRTree 차원 축소 기법을 사용하여 세포를 2차원 공간에 매핑하여 분화 경로를 재구성했습니다. 가시 시간 축을 따라 세포의 분포를 파악하고, 의사 시간에 따라 유의미하게 변한 유전자를 식별하기 위해 시각화 분석을 수행하였습니다. 이후 분석은 핵심 유전자 DBNL에 집중하여 세포 경로를 따라 발현 역학을 특성화하여, 심부전 진행 중 대식세포의 전사 재프로그래밍 기전을 밝혀냈다16.

유전자 집합 풍부화 분석 (GSEA)
본 연구에서는 심부전과 관련된 주요 유전자와 관련된 조절 기전을 밝히기 위해 GSEA 접근법을 사용하였습니다. 이전에 확인된 주요 유전자를 활용하여 샘플을 중앙값 발현값을 기준으로 고발현 코호트와 저발현 코호트로 층화했습니다. limma 패키지를 사용하여 차별 발현 분석이 수행되었으며, 로그 폴드 변화(logFC)에 따라 유전자 순위가 매겨진 목록을 생성하였습니다. 이후 KEGG 경로 풍부 분석은 clusterProfiler 도구를 사용하여 수행되었으며, MsigDB 데이터베이스에서 수집한 유전자 세트를 참고 배경으로 사용했습니다. 이후 GSEA 알고리즘을 적용하여 두 발현군 간 유의미하게 풍부화된 신호 경로를 식별하고, 0.05 미만의 조정된 p-값 임계값을 사용하여 통계적 유의성을 결정하였습니다. 핵심 유전자의 핵심 경로 내 규제 기능을 설명하기 위해 다중 경로 GSEA 플롯과 원형 네트워크 다이어그램 등 다양한 시각화 기법이 사용되었습니다.

유전자 집합 변이 분석 (GSVA)
GSVA는 전사체 데이터 내 유전자 집합 풍부도를 평가하는 데 사용되는 비매개변수적이고 지도되지 않은 접근법입니다. 이 방법은 특정 유전자 집합에 대한 종합 점수를 계산하여 유전자 수준의 변이를 경로 수준 변이로 변환하여 다양한 샘플에서 생물학적 기능 변화를 평가하는 데 도움을 줍니다. 본 연구에서는 유전자 집합이 분자 서명 데이터베이스에서 수집되었습니다. GSVA 알고리즘은 각 유전자 집합에 대한 종합 점수를 계산하는 데 사용되었으며, 이를 통해 서로 다른 샘플에서 잠재적인 생물학적 기능 변화를 평가할 수 있었습니다. GSVA 농축 분석 결과는 보조 자료(보충 표 1)에 제공되어 있습니다.

CTD 약물 예측
목표 유전자(DBNL)는 비교독성유전체학 데이터베이스(CTD)의 검색 필드에 입력되었고, 질병 범주인 "심혈관 질환"이 선택되었으며, "심부전" 상태와 관련된 약물 예측 데이터를 검색하기 위해 쿼리가 실행되었습니다. 얻어진 예측 결과는 이후 Cytoscape 소프트웨어로 통합되어 데이터 시각화를 용이하게 하고 유전자-화학 상호작용 네트워크 지도 구축을 가능하게 했습니다.

분자 도킹 방법
인간 DBNL 단백질(UniProt ID: Q9UJU6)의 3차원 결정 구조가 미해결된 상황에 따라, 본 연구는 AlphaFold317을 기반으로 DBNL의 3차원 구조를 예측하였습니다. 피리닉식산(WY-14643)은 PubChem 데이터베이스(PubChem CID: 5694)에서 다운로드할 수 있습니다. 그 후 MGLTools의 소프트웨어(버전 1.5.7)18을 사용하여 단백질 구조를 전처리했으며, 여기에는 수소 원자 첨가와 같은 단계가 포함되었습니다. 동시에 단백질과 소분자들은 도킹에 필요한 PDBQT 형식으로 변환되었습니다. AutoDock Vina 소프트웨어(버전 1.1.2)19 는 전역 분자 도킹(외생성성=16, num_modes=30)을 위해 잠재적 결합 모드를 탐색하는 데 사용되었습니다. 도킹 계산이 완료되면, 결합 자유 에너지가 가장 낮은 친화도를 가진 복합체 구조를 이후 분자 동역학 시뮬레이션의 초기 구조로 선택해야 합니다.

분자 동역학 시뮬레이션 방법
후보 화합물과 단백질 간의 결합 안정성과 상호작용 메커니즘을 체계적으로 조사하기 위해, GROMACS 소프트웨어 패키지(버전 2024.03)를 이용한 기존의 분자 동역학(MD) 시뮬레이션이 수행되었습니다. 단백질 매개변수는 Amber14SB 힘장21을 사용해 생성되었고, 물 분자 모델은 TIP3P 모델22를 사용했으며, 리간드 위상 매개변수는 일반 앰버 힘장(GAFF)을 기반으로 한 Antechamber Python Parser 인터페이스(ACPYPE) 도구를 사용해 생성되었습니다. 리간드-단백질 복합체계는 이후 TIP3P 물 분자로 채워진 주기적인 경계 팔면체 상자 내에 위치하게 되었습니다. 나트륨(Na⁺)과 염화물(Cl⁻) 이온이 도입되어 0.15 mol/L의 농도를 달성하고 시스템의 전체 전하를 중화했습니다. 시스템 건설이 완료된 후 초기 단계는 50,000단계 동안 가장 가파른 하강 방식을 사용하여 에너지를 최소화하는 것이었으며, 이는 구조 내 잠재적으로 불합리한 구조를 제거하는 것이었습니다. 이후 시스템 평형 상태의 두 단계가 수행되었습니다: 100 ps NVT(일정한 입자 수, 부피, 온도) 시뮬레이션과 100 ps NPT(일정한 입자 수, 압력, 온도) 시뮬레이션입니다. 이 시뮬레이션 과정에서 단백질 골격의 무거운 원자에 위치 제약이 적용되어 단백질의 구조적 무결성을 유지하였습니다. 온도는 V-리스케일 온도계를 사용해 300 K로 유지되었고, 압력은 Parrinello-Rahman 압력계를 이용해 압력 결합을 위해 1바에서 조절되었습니다. 평형 단계가 완료되면 100나노초 동안 모든 위치 제약을 제거하는 생산 단계 시뮬레이션이 수행되었습니다. 궤적은 2펨토초 시간 스텝을 사용하여 적분되었으며, 입자-메쉬 에발트(PME) 방법을 사용하여 장거리 정전기 상호작용을 정밀하게 관리하였습니다. 탄도는 10ps마다 저장되었고, 이후 분석을 위해 총 10,000프레임이 출력되었습니다. 또한 시뮬레이션에서 90-100 ns 구간의 안정적인 궤적을 추출했으며, gmx MMPBSA 도구23을 사용하여 리간드 단백질 복합체의 결합 자유 에너지를 계산하였습니다.

통계 분석
이 멘델 무작위화(MR) 분석의 타당성은 세 가지 기본 가정에 의존합니다. (1) 관련성: 기기 변수(IV)가 노출과 강한 연관성을 보여야 합니다. (2) 독립성: IV는 노출과 결과 모두에 영향을 미치는 교란 요인으로부터 독립적이어야 합니다. (3) 배제 제한: IV는 노출에 미치는 영향만을 통해서만 결과에 영향을 미쳐야 합니다. 이 가정을 깨는 경우, 즉 IV가 노출과 관련 없는 경로를 통해 결과에 영향을 미치는 경우, 이를 수평 다면형성(horizontal pleiotropy)이라고 합니다. 모든 통계 분석은 R 버전 4.3.0을 사용하여 양측 검정을 사용했으며, p 값이 0.05 미만일 경우 일반적으로 통계적 유의성을 나타내는 것으로 간주되었습니다.

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결과

멘델 무작위화 및 공동위치 분석을 통한 심부전 위험과 관련된 DBNL 유전자 확인
심부전 관련 샘플의 결과 식별자인 GCST90162626는 요약 통계 데이터셋에서 획득하였습니다. 1,247쌍의 발현 정량적 형질 유위(eQTL)와 결과 간의 인과관계가 extract_instruments 및 extract_outcome_data 함수(보충표 2). 이후 멘델 무작위화 분석에서 567개의 유전자 쌍이 eQTL 양성 결과와 연관되어 있음을 확인했습니다(그림 1A). 연구 결과, MRPL11, CAMK2G, HSP90AB1, ATP2B1을 포함한 280개의 유전자가 심부전 위험 감소와 연관되어 있음을 밝혔습니다(오즈비 [OR] < 1). Conversely, 287 genes, such as ZNF394, DIPK1B, FCRL1, and COPDA1, were linked to an increased risk ...

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토론

염증은 심부전(HF) 병태생리의 근본적인 측면을 이루지만, 이전 연구들은 주로 일반화된 염증 매개체와 세포 표면 표지자에 집중되어 왔습니다17, 18, 24. 이러한 초점은 관련된 특정 세포 메커니즘의 규명을 제한했습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 우리는 다중체학 멘델 무작위화(MR)와 단세포 전사체 분석을 결합한 통합 접근법을 사용하여 HF 환자의 잠재적 치료 표적으로 세포골격 단백질 DBNL을 확인하였습니다.

멘델 무작위화(MR), 공동위치 분석, 단세포 RNA 시퀀싱을 통해 DBNL 유전자가 심부전(HF) 위험과 유의한 관련이 있음을 확인했습니다. 우리의 결과는 DBNL이 주로 심장 대식세포에서 발현되며 면역대사 신호전달 경로에 관여함을 보여줍니...

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공개 사항

저자들은 서로 상충하는 이해관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

이 연구 프로그램은 중국 저장성 자연과학기금(LTGY24H020001), 저장성 전통 중의학 과학기술 프로젝트(2023ZR131, 2023ZL158), 닝보 공공복지핵심프로젝트(2024S030), 닝보 핵심기술연구개발 프로그램(2022Z149), 저장성 동맥경화성 질환 정밀 의학 핵심 연구소(2022E10026)의 지원을 받았습니다. 저장성 의학회 임상의학연구특별기금 프로젝트(2021ZYC-A11)를 포함하고 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
셀마커 데이터베이스하얼빈 의과대학 (CellMarker 2.0)http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/CellMarker/셀마커 데이터베이스; 단일 세포 주석 중 조직/세포 유형 마커 유전자 조회를 위해
비교 독성유전체학 데이터베이스(CTD)CTD (듀크 대학교 외)http://ctdbase.org/CTD 데이터베이스; 약물 예측에 사용되는 화학물질, 유전자, 표현형 및 질병 간 상호작용을 검색하기 위해
deCODE 혈장 pQTL 데이터셋 (2021년, 4,907 aptamer, 35,559 유럽 샘플)deCODE 유전학https://www.decode.com/summarydata/2021년 pQTL 데이터 발표; MR 분석을 위한 pQTL 노출 데이터로 사용됨
eQTLGen 전혈 eQTL 데이터eQTLGen 컨소시엄https://www.eqtlgen.org/eQTLGen 1/2단계 (사용에 따라 구체적인 버전); MR 및 공동위치 분석을 위한 eQTL 노출 데이터로 사용됨
GEO 단세포 RNA-seq 데이터셋 GSE161470 (인간 심장 조직: 대조군 4개 + 병리학적 샘플 1개)NCBI 유전자 발현 옴니버스 (GEO)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE161470GSE161470; 후속 분석을 위해 인간 심장 조직의 단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터를 얻기 위해
GWAS 카탈로그NHGRI와 ndash; EBIhttps://www.ebi.ac.uk/gwas/GWAS 카탈로그; HF 관련 GWAS 정보, 주석 및 보조 분석을 검색하기 위해
심부전 GWAS 요약 통계 (GCST90162626)NHGRI와 ndash; EBI GWAS 카탈로그https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90162626학문 등록: GCST90162626; MR 및 공동위치 분석을 위한 결과 데이터로 사용됨
분자 서명 데이터베이스 (MSigDB) v7.0브로드 연구소https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdbMSigDB v7.0; GSEA / GSVA 배경 유전자 세트 및 경로 주석 사용
피리닉식산 (WY-14643) 구조 데이터 (PubChem)NCBI 퍼블켐https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5694PubChem CID: 5694; 분자 도킹 및 동역학 시뮬레이션을 위한 리간드 3D 구조 획득에 사용됨
UniProt 단백질 데이터베이스 (DBNL, UniProt ID: Q9UJU6)유니프로트 컨소시엄https://www.uniprot.org/uniprot/Q9UJU6유니프로트: Q9UJU6; 구조 예측 및 도킹을 위해 DBNL의 아미노산 서열을 얻는 데 사용됨
전혈 mQTL 메타분석 (참고문헌 11, 3,701개의 유럽 샘플, 426,636개의 mQTL 형질)저자 / 컨소시엄 (참고 11명에 따르면)원본 데이터베이스 URL / DOI 추가 대기 중인 저자참조: DOI 또는 데이터셋 ID; MR 분석을 위한 mQTL 노출 데이터로 사용됨

참고문헌

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