Eupatorium lindleyanum DC 내 세스키터펜 락톤의 항염증 효과. 설치류 모델에서

요약

이 연구는 Eupatorium lindleyanum DC에서 추출한 세스퀴테르펜 락톤을 입증합니다. (SLEL)는 자일렌 유발 마우스 귀부종 및 카라기난 유도 쥐발 부종 모델에서 조직병리학적 손상 완화, 사이토카인 방출 감소, NF-κB 신호 활성화 억제를 통해 유의미한 항염증 효과를 발휘합니다.

초록

급성 염증은 많은 면역 관련 질환에 관여하는 근본적인 병리 과정입니다. 유파토리움 린들레야눔 전통 약초인 DC.는 약리학적 활성을 보이는 것으로 보고된 세스퀴테르펜 락톤(SLEL)이 풍부합니다; 그러나 이들의 항염증 효과와 관련된 분자 변화는 아직 완전히 규명되지 않았습니다. 본 연구에서는 자일렌 유도 쥐 귀부종 모델과 카라기난 유도 쥐발 부종 모델에서 급성 염증 반응을 유도하였다. 조직 손상과 염증 침윤은 헤마톡실린과 에오신 염색으로 평가하였다. 혈청 내 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6, IL-1β)의 수치는 ELISA로 정량화되었고, 염증 조직에서의 전사 발현은 정량적 PCR(qPCR)으로 분석되었습니다. 인산화된 IκBα와 p65를 포함한 NF-κB 경로 관련 단백질의 변화는 웨스턴 블로팅으로 평가하였습니다. SLEL 치료는 귀와 발 부종을 감소시키고 조직 부종, 염증성 세포 침윤, 혈관 울혈 등 급성 염증의 조직병리학적 특징을 완화했습니다. 동시에 SLEL 투여는 혈청 수치 감소와 Tnf-α, Il-6, Il-1β의 조직 mRNA 발현 감소와 관련이 있었습니다. 웨스턴 블롯 분석은 SLEL 치료 후 염증 조직에서 IκBα와 p65의 인산화가 감소하여 NF-κB 관련 신호 전달 사건의 조절을 시사하였다. 이 결과들은 급성 염증 모델에서 SLEL의 항염증 활성을 평가하는 실험적 작업 흐름을 제시하며, 그 효과가 염증성 사이토카인 발현 감소와 NF-κB 경로 관련 신호 전달 변화와 연관됨을 시사합니다.

서론

염증은 병원성 침습이나 조직 손상에 의해 촉발되는 복잡한 방어 반응으로, 감염을 제한하고 유해 자극을 제거하며 조직 수리를 촉진하는 데 중요한 역할을 합니다^. 조절된 염증 반응은 조직 항상성 유지에 필수적이지만, 과도하거나 지속적인 염증은 조직 손상, 장기 기능 장애, 만성 질환의 진행으로 이어질 수 있습니다. 임상적으로 염증은 발적, 부기, 열, 통증으로 특징지어지며, 심한 경우 전신 병리학적 반응을 초래할 수 있습니다. 점점 더 많은 증거가 염증 조절 장애와 암, 심혈관 질환, 자가면역 질환 발병과 연관되어 있음을 밝혀냈습니다²˒³.

비스테로이드성 항염증제(NSAIDs)는 현재 염증 관리에 가장 널리 사용되는 약물입니다. 증상 완화에 효과가 있음에도 불구하고, 장기 NSAID 사용은 위장 자극, 과민반응, 간독성⁴ 등 부작용과 자주 연관되어 임상적 적용 가능성을 제한합니다. 그 결과, 안전성이 향상된 대체 항염증제를 찾는 데 대한 관심이 커지고 있습니다. 전통 한약을 포함한 천연 제품들이 면역조절 특성을 가진 생리활성 화합물의 잠재적 공급원으로 탐구되어 왔습니다. 그러나 저독성 또는 전신 조절 기능에 관한 일반화된 주장은 신중하게 해석되어야 하며, 정의된^{질병 모델에서} 실험적 검증이 필요합니다. 5.

유파토리움 린들레야눔 DC.는 전통적인 약용 식물로, 특징적으로 세스퀴테르펜 락톤(주로 구아이아올라이드 및 유데스마놀라이드 계열 화합물)과 게르마크라놀라이드, 잔타노라이드⁶이 포함됩니다. Eupatorium lindleyanum DC 추출물. 다양한 실험 환경에서 지질 저하, 항죽상동맥경화, 항종양 및 항염증 활성을 보이는 것으로 보고되었습니다⁶. 특히, Eupatorium lindleyanum DC의 에탄올 추출물이 있습니다. 지다당류(LPS) 유발 급성 폐^{손상 모델에서} 보호 효과를 보인 7. 그러나 SLEL의 항염증 활성과 고전적 급성 염증 모델에서의 효과는 아직 충분히 규명되지 않았습니다.

이 격차를 해소하기 위해 우리는 두 가지 상호 보완적인 급성 염증 모델을 사용했습니다: 빠른 신경성 및 혈관 염증 반응을 포착하는 쥐의 자일렌 유발 귀부종과, 사이토카인 생성과 세포 침윤을 포함하는 시간 의존적 급성 염증을 반영하는 잘 확립된 모델인 쥐의 카라기난 유발 발 부종입니다. LPS 유도 전신 염증과 같은 대안 모델은 국소적 조직 부종보다는 전신 면역 활성화에 중점을 두고, 조직 수준 조직학 및 분자 분석의 쌍 분석 적합성이 제한적이기 때문에 선택되지 않았습니다⁸.

이 통합 모델 전략을 사용하여 염증 반응은 정량적 부종 측정, 헤마톡실린 및 이오신(H&E) 염색에 의한 조직병리학적 평가, 혈청 사이토카인 프로파일링, 조직 수준 전사 분석, 그리고 NF-κB 관련 단백질 변화를 통해 평가되었습니다. 이 프로토콜은 부종 형성, 사이토카인 발현, 경로 관련 분자 소독이 관심 있는 급성 염증에서 항염증 활성 선별에 특히 적합합니다. 그럼에도 불구하고, 급성 모델의 한계를 인식해야 하며, 조직 수준 신호 전달 변화에서 인과관계를 추론할 때 만성 염증 상태로의 외삽과 해석적 경계가 제한된다는 점이 포함됩니다.

전체적으로 본 연구는 보완적인 급성 염증 모델과 조직학적 및 분자 분석을 결합한 프로토콜 중심 접근법을 강조하여, 한방 유래 화합물의 항염증 잠재력을 재현 가능한 평가 틀을 제공합니다.

프로토콜

동물 연구 프로토콜은 충칭의과대학 기관동물 관리 및 이용 위원회(IACUC-CQMU-2025-10073)의 승인을 받았습니다.

세스퀴터펜 락톤 농축 분획(SLEL) 제제

Eupatorium lindleyanum DC의 건조 약용 재료. 70%(v/v) 에탄올로 2회 역류 추출을 저압 상태로 분쇄 처리했습니다. 각 추출은 2시간 동안 용매 대 물질 비율 10:1(v/w)로 수행되었습니다. 혼합된 추출물은 여과되어 ≤60 °C의 저압 농축 후 진공 동결 건조되어 원시 에탄올 추출물 분말을 얻었습니다.

건조된 추출물을 증류수(최종 농도: 100 mg/mL)에 완전히 녹인 후, 순차적으로 폴리아마이드 수지 크로마토그래피에 노출시킨 후, D101 다공성 흡착 수지 크로마토그래피를 통해 세스퀴테르펜 락톤을 농축하하였습니다. 흡착 평형에 도달한 후, D101 수지는 증류수로 세척하여 극성 불순물을 제거한 후 무수 에탄올로 용출되었습니다. 에탄올 용출 후, 수집된 분획은 저압 하에서 농축된 후 동결 건조하여 SLEL 분획을 생성했으며, 이 분획은 −20 °C에서 저장되어 사용되었습니다.

분리는 아세토니트릴과 0.1% (v/v) 포름산의 물에 포함된 이진 이동상 시스템을 사용하는 UPLC 플랫폼에서 이루어졌습니다. 구배 프로그램은 초기 25분간 저유기 함량 등성 유지, 70% 아세토니트릴까지의 짧은 선형 경사, 90% 아세토니트릴에서 고유기 단계 단계, 그리고 시작 상태로 복귀하는 최종 평형 단계로 구성되었습니다. 시스템은 0.25 mL·min⁻¹ 에서 컬럼 온도는 35°C, 주입 부피는 0.1 μL로 운영되었습니다(보충 그림 S1).

동물

총 36마리의 수컷 스프래그-도울리 쥐(200 ± 20g)와 36마리의 수컷 BALB/C 쥐(20 ± 2g)가 이 연구에서 사용되었습니다. 동물들은 표준화된 조건(22± 2°C, 55% ± 습도, 12시간의 밝고 어둠 주기 하에 사육되었으며, 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있었습니다. 실험 전 7일간 동물을 적응시키고 전반적인 건강 상태를 매일 모니터링했습니다. 모든 시술은 동물의 고통을 최소화하기 위해 시행되었으며, 혈액 채취와 조직 채취 전에 마취가 적용되었습니다.

쥐에서 자일렌 유발 귀 부종

쥐 귀 부종 모델은^{앞서 설명}한 대로 확립되었습니다. 적응 후, 쥐들은 무작위로 6개 그룹(n=6명)으로 배정되었습니다: 대조군(CG), 모델군(MG), 덱사메타손(DEX, 10 mg/kg), SLEL 저용량(75 mg/kg), 중용량(150 mg/kg), 고용량(300 mg/kg) 그룹. 모든 치료는 7일 연속 하루 한 번씩 경구 개비지로 투여되었으며(최종 투여량: 10 mL/kg). 최종 투여 후 1.5시간경, 대조군을 제외한 오른쪽 귀 양쪽 면에 30 μL 자일렌을 고르게 발라하여 염증을 유도하였다. 30분 후, 쥐들에게 마취를 시키고 혈액 샘플을 채취했으며, 양쪽 귀의 동일한 해부학적 위치에서 8mm 원형 귀 펀치를 얻었다.

쥐에서 카라기난 유발 발 부종

쥐 발 부종 모델은 앞서 설명한 카라기난을 사용해 확립되었습니다.¹⁰. 쥐들은 무작위로 6개 그룹(n=6명)으로 배정되었습니다: CG, MG, DEX(5 mg/kg), 그리고 SLEL 저용량(50 mg/kg), 중용량(100 mg/kg), 고용량(200 mg/kg) 그룹. 치료는 하루 1회 7일간 경구 투여(10 mL/kg)로 투여되었습니다. 최종 투여 전에 기준 발바닥 부피를 측정했습니다. 마지막 투여 30분 후, 1% 카라기난(w/v) 용액 0.1mL를 오른쪽 뒷발 족저면에 피하 주입하에 투여했습니다. 주사 후 1, 2, 3, 4시간에 플레티스모미터를 사용해 발 부피를 측정하였습니다. 발 부종은 다음과 같이 계산되었습니다:

발 부종 (%) = (Vt − V0) / V0 × 100%

조직학적 검사

기능 평가 직후 귀와 발 조직을 채취하였다. 조직은 10% 중성 완축 포르말린에 72시간 동안 상온에서 고정한 후 파라핀에 박힌 후 5 μm 절단 후 표준 프로토콜¹¹에 따라 H&E로 염색하였습니다.

효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)

혈청 샘플은 3,000 × g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리하여 채취했습니다. TNF-α, IL-6, IL-1β의 수치는 표준 프로토콜에 따라 상업적으로 구할 수 있는 ELISA 키트를 사용하여 정량화되었습니다.

서부 블롯 분석

총 단백질 추출물은 RIPA 용해 완충제와 프로테아제 및 인산효소 억제제를 보충하여 귀와 발 조직에서 추출하였습니다. 단백질 농도는 BCA 분석법을 사용해 정량화되었고, 동일한 양의 단백질(샘플당 30 μg)을 SDS-PAGE로 분리하여 PVDF 막에 전달하였습니다. 막은 5% 무지방 우유로 1시간 동안 실온에서 차단한 후, 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 배양하고, HRP 결합 2차 항체를 1시간 실온에서 배양하였습니다. 면역반응 밴드는 향상된 화학발광을 이용해 검출되었고, ImageJ 소프트웨어로 정량화하였습니다.

정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)

총 RNA는 재료표에 나열된 RNA 추출 시약을 사용하여 귀와 발 조직에서 분리하였습니다. 제조사 지침에 따라 상업용 역전사 키트를 사용해 총 RNA 1마이크로그램을 역전사하여 cDNA로 전환했습니다. 정량적 PCR은 유전자 특이 프라이머(표 1)를 사용한 SYBR Green 화학을 사용하여 10 μL 반응 부피에서 2단계 증폭 프로토콜 하에 수행되었습니다. 상세한 역전사 조건과 PCR 사이클링 매개변수는 프로토콜 섹션에서 제공되어 있습니다. 상대적 전사체 수준은 2^⁻ΔΔCT 방법으로 계산되었으며, Gapdh 를 내부 참조 유전자로 사용했습니다.

데이터 및 통계 분석

데이터는 평균 ± SD로 표현됩니다. 두 그룹 간의 통계적 비교는 쌍이 없는 학생 t-검정을 사용했으며, 두 그룹 이상이 포함된 분석에는 일원 ANOVA를 적용했습니다. 통계적 유의성은 p < 0.05로 정의되었습니다. 유의성은 # p < 0.05, ## p < 0.01과 대조군(CG)과 대비, * p < 0.05와 ** p < 0.01과 모델 그룹(MG)으로 나타난다.

결과

UPLC-Q/TOF/MSn까지의 SLEL 화학 조성

SLEL의 화학적 프로필은 양 및 음 이온 모드에서 UPLC-Q/TOF-MSn을 사용하여 조사되었습니다. 9종의 세스퀴터펜 락톤이 주요 성분으로 확인되었습니다(보충 그림 S1). 분자 조항식 할당은 양의 모드에서 [M+H]⁺와 [M+Na]⁺, 음의 모드에서는 [M−H]⁻와 [M+HCOO]⁻를 포함한 가합 이온에서 도출되었습니다(보충 표 S1).

자일렌 유도 귀부종 검사에서 SLEL의 영향

국소 자일렌 도포 후(유도 후 30분 후, 프로토콜에 명시됨), 모델 그룹의 쥐들은 대조군에 비해 귀 펀치 무게가 유의미하게 증가한 모습을 보였습니다(보충 그림 S2<...

토론

이 연구에서는 Eupatorium lindleyanum DC에서 유래한 세스퀴테르펜 락톤을 다룹니다. (SLEL)은 두 가지 확립된 급성 염증 모델, 즉 쥐의 자일렌 유발 귀부종과 쥐의 카라기난 유발 발부종을 사용하여 평가되었습니다. 조직병리학적 점수, 혈청 사이토카인 측정, 조직 수준 mRNA 정량, 단백질 수준 신호 전달 판독을 통합함으로써, 이 프로토콜은 단일 실험 워크플로우 내에서 국소 및 전신 염증 반응을 다층적으로 특성화합니다.

지정된 말기 시점(자일렌 투여 후 30분, 카라기난 투여 후 4시간)에서 조직학적 평가는 SLEL 치료 동물에서 모델 대조군에 비해 부종, 염증 세포 침윤 및 조직 파격이 감소하는 것으로 나타났습니다. 반정량적 점수 매기는 이러한 결과를 더욱 뒷받침하여, 정성적 검사만을 넘어서는 재현성을 가능하게 했습니다. 일관되게, 혈청 촉진염증 사이토카인과 조직 사이토카인 mRNA...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
반 GAPDH	면역	YN5585
반 Iκ Bα	세포 신호 전달 기술	4812
안티 P65	압마트	TA5006
안티p-I&카파; Bα	세포 신호 전달 기술	2859
안티 P-P65	압마트	TP70621
BCA	비요타임 바이오테크놀로지 주식회사	P10010
IL-1&베타; 장비	샤먼 후이자 바이오테크놀로지 유한회사	EHJ-20537r
IL-6 키트	샤먼 후이자 바이오테크놀로지 유한회사	EHJ-20746r
마이크로피펫	에펜도르프
마이크로플레이트 리더	진 주식회사	오디세이 FC
PVDF	밀리포어	IPVH00010
역전사 키트	메드켐익스프레스	HY-K051A
RIPA 버퍼	비요타임 바이오테크놀로지 주식회사	P0013B
SYBR 그린 마스터믹스	메드켐익스프레스	HY-K0522
TNF-&α; 장비	샤먼 후이자 바이오테크놀로지 유한회사	EHJ-20039r
트리졸	써모피셔 사이언티브	15596018CN
초저온 냉동고	산요