밀집된 핵 환경에서 크로마틴 연구를 위한 다중 표지 단일 분자 위치 현미경 프로토콜

Summary

우리는 유크로마틴, 헤테로크로마틴, RNAP II의 재현 가능한 지도화를 가능하게 하는 3색 염색질 단분자 위치 현미경(SMLM) 염색 및 분석 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 크로마틴 관련 표적을 포함한 고밀도 핵 환경에서 효율적인 다색 라벨링을 가능하게 하여 신뢰할 수 있는 동시 검출을 가능하게 합니다.

Abstract

초해상도 현미경은 회절 한계를 넘어 생물학적 구조를 탐구하는 능력을 획기적으로 발전시켰으며, 크로마틴, 핵 층과 핵 체와 같은 핵체와 같은 밀집된 핵구조를 연구하는 데 필수적입니다. 크로마틴은 나노미터 크기의 뉴클레오솜부터 마이크론 규모의 도메인까지 다중 규모 조직을 보이며, 이는 고해상도와 분자 특이성을 모두 갖춘 영상 접근법이 필요합니다. 단일 분자 위치 현미경(SMLM), 특히 확률적 광학 재구성 현미경(STORM)은 후생유전학적 표식의 정밀한 지도화를 가능하게 하여 염색질 구조와 기능에 대한 중요한 통찰을 제공합니다. 그러나 핵 환경에서 다중 표지 영상은 항체 접근성 감소, 비특이적 결합 증가, 형광체 불안정성 등 독특한 도전 과제를 제시합니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 고밀도 핵 환경에 최적화된 순차적 면역표지 프로토콜을 제시하여, 최소한의 교차 스트래킹과 신호 저하를 최소화한 견고한 3색 SMLM 구현을 가능하게 합니다. 이 방법은 여러 표적에서 재현 가능하고 고충실도를 보장하는 최적화된 버퍼 제형, 형광체 선택, 항체 검증 전략을 포함합니다. 중요한 점은, 이 프로토콜을 하나의 분자 표적에서 발생하는 위치 파악을 공간적 앵커(시드 포인트)로 활용하여 표적 간 거리, 국소 밀도, 다중 라벨 공화도를 정량화하는 계산 분석 파이프라인과 통합했다는 점입니다. 이를 통해 나노스케일에서 크로마틴 성분의 상세한 공간 분석을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 밀집된 아세포 환경에서 다중 구성 요소 영상 및 정량적 분석을 위한 재현 가능한 프레임워크로서, 크로마틴과 같은 복잡한 핵 구조를 연구하는 연구자들에게 강력한 도구를 제공합니다.

Introduction

단일 분자 위치 현미경(SMLM)의 등장으로 나노미터 ^{1,2,3,4,5 나노}미터 규모에서 생물학적 구조를 전례 없이 탐구할 수 있게 되었습니다. 단일 표적 이미징을 넘어, 다색 SMLM 확장은 여러 분자 종의 동시 시각화와 서브-회절 구조 간의 공간적·시간적 관계를 가능하게 하여 분야를 더욱 발전시켰습니다 6,7,8,9,10,11 . 그러나 핵 DNA의 밀도 높은 고분자 특성과^{이 환경 내에서} 항체의 접근성이 제한적이기 때문에 다중화된 SMLM 적용은 여전히 도전^{적입니다.}

크로마틴은 나노미터 규모의 뉴클레오좀 조립체부터 마이크로미터 규모의 핵구조에 이르기까지 수십 배에 달하는 계층적이고 다층적인 조직을 보입니다. 가장 큰 규모에서 염색체는 뚜렷한 염색체 영역을 차지하며, 이 영역 내에서 게놈은 A/B 구획과 위상적으로 연관된 도메인(TAD)으로 다시 분할되어 루프 배출과 같은 메커니즘을 통해 장거리 조절 상호작용을 제한합니다 ^19,20,21,22. 200 nm 미만 규모에서 크로마틴은 이질적인 유크로마틴과 이종색질질 블록 대신 이질적 패킹 도메인(PD)으로 구성된 무질서한 고분자로 조직되어 있으며, 전사 활성 영역은 PD 경계 23,24,25,26,27,28,29에 우선적으로 위치합니다. 가장 작은 규모(5-20 nm)에서 크로마틴은 불규칙한 뉴클레오좀 조립체와 뉴클레오좀 클러치로 구성되어 있어 균일한 고차 접힘 모티프의 부재를 강조하고, 게놈 조직의 출현적이고 스케일에 의존적인 특성을 강조한다 24,26,30. 염색질 면역침전 시퀀싱과 고처리량 염색질 구조 캡처 ^{19,30,31,32,33와} 같은 시퀀싱 기반 접근법의 급속한 발전으로 인해, 염색질 중규모 조직 구조의 다양한 특징이 확인되었습니다^31,32. 그러나 이러한 기법들은 이미징과 달리, 이러한 구조를 해독한 후에야 관찰되는 공간적 기하학을 포착하지 못합니다. 크로마틴 전자현미경(ChromEM²⁴)과 크로마틴 주사 투과전자 현미경(ChromSTEM²⁵)과 같은 전자현미경 기법은 크로마틴이 이질적이며 50-200 nm 길이 규모의 패킹 도메인으로 조직되어 있음을 밝혀냈다^{25, 28, 29}. 이러한 기법들은 크로마틴 패킹 도메인을 식별하는 데 인상적인 해상도를 제공하지만, SMLM이 제공하는 분자 특이적 매핑을 제공하지는 못합니다. 나노스케일 지형학(DNA-PAINT²²)에서의 이미징을 위한 DNA 포인트 축적과 다중화된 형광 현장 하이브리다이제이션(FISH)¹⁹는 높은 다중화를 가능하게 합니다; 그러나 DNA-PAINT는 올리고뉴클레오타이드가 풍부한^{핵 환경에서 무작위} 결합 사건으로 인한 높은 배경 노이즈에 강하게 영향을 ^받으며, 전통적인 열 변성 기반 FISH 방법은 원래의 염색질 접힘이 방해되어야 한다. 이전 연구들은 초해상도 영상 기법을 적용해 이 길이 규모의 크로마틴을 조사했으며, 이전의 상 분리 모델^{12, 23, 34, 35}와 대조되는 하이브리드 패킹 도메인을 확인했습니다. 이 프로토콜은 이러한 발견의 생물학적 중요성을 논의한 이전에 발표된 논문에서 비롯^{되었습니다.} 따라서 높은 해상도와 다중화 능력을 고려할 때, 면역염색 기반 dSTORM은 거의 고유 조건에서 다색 크로마틴 영상을 촬영하는 데 가장 적합한 전략으로 남아 있습니다.

이 프로토콜은 두 개 이상의 핵 표적을 표지하는 첫 사례가 아니며, 이전 연구들은 개별 단백질 복합체나 유전자를 표지한 바 있습니다^12,36. 뉴클레오좀 번역 후 히스톤 변형의 성공적인 표지에도 불구하고, 다색 염색질 SMLM 표지, 영상 및 분석은 상당한 도전 과제를 제시합니다. 첫째, 밀집된 염색질 환경에서 면역염색을 하려면 과도한 배경 없이 충분한 침투와 결합을 보장하기 위해 항체 농도, 배액 서열, 완충 조성을 최적화해야 합니다. 둘째, 유크로마틴, 헤테로크로마틴, RNA 중합효소와 같은 효소 간의 상호작용이 단순한 이진 배제를 넘어설 가능성이 높으므로 다중 표지에 대한 포괄적인 분석이 필요합니다. 지금까지 크로마틴 dSTORM 이미징에서 보여진 최대 색상 수는 두 가지로 유지되며, 18,37,38,39입니다.

여기서는 3색 크로마틴 SMLM 영상 및 분석을 위한 견고한 프로토콜을 제시합니다. 저희 염색 워크플로우는 항체 배양 시간을 최적화하고, 여러 표지에 대한 장시간 영상 촬영을 위해 향상된 영상 버퍼⁴⁰을 사용합니다. 또한 2색 거리 분석과 3색 조인트 밀도 분석을 위한 계산 파이프라인을 설명하여, 헤테로크로마틴, 유크로마틴, 전사 기구 간의 관계를 정량적으로 특성화할 수 있게 합니다. 이전의 2색 염색질 SMLM 연구가 이형염색질과 유크로마틴의 분리를 제안한 것과 달리, 3색 염색질 영상은 유전체가 패킹 도메인으로 조직되어 있으며, 유크로마틴과 활성 전사가 구성 이종색질 코어의 말초에 국한되어 있음을 보여줍니다³⁴.

이 프로토콜은 다색 염색질 SMLM 수행을 위한 재현 가능한 프레임워크를 커뮤니티에 제공하며, 여러 기능적으로 결합된 핵 표적에 적합한 분석 전략을 수립합니다. 방법론적 간극을 메워줌으로써, 염색질 도메인 조직을 초핵체(super-nucleosomal level)에서 체계적으로 탐구할 수 있게 하며, 시퀀싱과 전자현미경 접근법을 보완하면서도 원래의 핵구조를 보존합니다. 이 논문은 출판된^{논문 34}의 확장 프로토콜입니다.

Protocol

참고: 다음 프로토콜 섹션은 아래에 설명된 염색 과정과 획득 과정으로 나뉩니다. 데이터 분석 튜토리얼은 표지 히스톤 변형에 대한 다중 라벨 분석을 상세히 다룬 관련 출판물³⁴를 참고하시기 바랍니다.

1. 염색 과정:

참고: 프로토콜 전반에 걸쳐 35mm 접시 또는 8개의 잘 챔버된 플레이트에 대한 언급이 있습니다. 이 혈관들이 우리 그룹이 세포 배양에 사용하지만, 더 작고 효율적인 방법도 가능합니다. 대체 재료를 사용할 경우 완충 항체의 권장 농도가 유지되는지 확인하세요. 이 프로토콜의 순차적 특성 때문에 항체 선택은 성공적인 표지에 중요합니다. 우리는 표준 추론을 사용하여 표적에 대한 숙주 항체가 다르도록 하여 2차 항체가 서로 다른 숙주 종을 표적으로 삼을 수 있도록 하여 표적 외 효과를 효과적으로 최소화합니다. 표지 순서는 핵 내 표적 위치에 따라 결정됩니다. 우리는 염색질 패킹 도메인^{25, 28, 34, 35}를 표적으로 하고 있으며, 이것이 확산 주도 과정임을 이해하기 때문에, 항상 이종색성 표적을 먼저 표지하고, 그 다음에 유크로마틴, 마지막으로 RNAPII를 표지하여 밀집된 이색질 영역에서의 입체 배제를 최소화합니다. 버퍼의 최적화는 프로토콜 개발 과정에서 경험적으로 이루어졌습니다. 첫 번째 표적 후 염소 혈청을 포함시키는 것이 이후 단계에서 표적 외 효과를 줄이는 데 도움이 된다는 것을 발견했습니다.

1. 완충 준비
   1. 완충 구성 요소:
      참고: 구성 요소, 저장 및 준비 시간에 대한 자세한 내용은 재료표를 참조하시기 바랍니다. 실험 오류를 피하기 위해 프로토콜 시작 전에 모든 해결책을 준비해 두는 것을 권장합니다. 담냉 용액은 마지막에 만들어야 합니다.
   2. 블로킹 버퍼를 만드세요
   3. 실험에 필요한 완충 부피의 최종 농도가 3%가 되도록 소 혈청 알부민(BSA)을 무게를 재고 원심분리관에 추가하세요. 튜브를 45° 각도로 기울여 BSA 결정이 튜브 내에서 퍼지게 한 후, 인산 완충 식염수(PBS)를 첨가합니다. 이는 녹지 않는 결정 덩어리의 형성을 방지하기 위함입니다.
   4. 모든 결정이 녹을 때까지 튜브를 실온에 두세요. 튜브나 소용돌이를 흔들지 마세요 - 이는 기포 형성을 일으켜 단백질이 표면으로 끌어당겨져 BSA가 완전히 녹지 못하게 만듭니다.
   5. 완전히 용해되면 1.3단계에서 선택한 부피에 따라 최종 농도가 0.2%(v/v)가 되도록 트리톤 X-100을 추가합니다. 결정이 완전히 녹지 않았다면, 용액을 천천히 섞기 위해 피펫을 여러 번 위아래로 움직여 기포가 생기지 않도록 하세요.
      참고: 수정 완충제를 만들 때는 이 과정에 10% 염소 혈청을 포함하세요. 다만, 수정된 차단 버퍼는 사용 중에 신선하게 만들어야 하며, 장기간 보관하지 말고 최종 농도는 재료표에 명시된 대로 3% BSA, 0.2% Triton X-100으로 동일하게 유지해야 합니다.
   6. 세척 완충제를 만드세요:
      1.1.2에서 차단 버퍼 단계를 반복하되, 편의를 위해 재료 섹션과 여기 나열된 농도를 사용하세요 (0.2% BSA, 0.1% Triton X-100 in 1X -DPBS, 수정 시 염소 혈청 1% 포함)
   7. 고정액 만들기:
      1. 원심분리기 튜브에 PBS를 추가하세요.
      2. 원심분리관에 적절한 양의 16% 파라포름알데히드를 첨가하여 최종 농도는 4%로 만듭니다.
         참고: 인큐베이터에서 세포를 꺼낼 때는 신선하고 준비된 상태로 준비하세요. 현재 고정액은 일반적으로 글루타알데히드를 사용하지 않지만, 추가할 수 있고 파라포름알데히드에 비해 더 견고한 고정과 더 오래 지속되는 고정 효과 때문에 유용할 수 있습니다. dSTORM 장치는 글루타알데히드(GA)로부터 형광 수명 신호를 얻을 수 있는 기능을 갖추지 못하지만, 능력이 있는 사용자는 이를 통해 형광체 표지 구조와 분리하는 데 유용할 수 있습니다.
   8. 담질 용액을 만드세요:
      1. 종이에 붕소나트륨을 무게를 재세요.
      2. 원심분리관 준비해.
      3. 튜브에 붕소나트륨을 추가하세요.
      4. PBS를 튜브에 추가하세요.
         참고: PBS를 넣은 후 용액에 기포가 생겨야 합니다.
   9. 이미징 버퍼를 만드세요:
      1. 1,4-디아자비사이클로옥탄(DABCO)을 탈이온화된 RNASE, DNASE 자유수에 용해하여 13 mL 농도의 DABCO 용액을 만듭니다.
      2. DABCO가 완전히 용해되어 pH가 8.0이 될 때까지 12M HCl(~240 μL)을 첨가합니다.
      3. 10X PBS에 녹여 1M 황산나트륨을 준비합니다. DTT는 별도의 준비가 필요 없습니다.
      4. 최종 준비를 위해 이전 스톡을 사용해 30 mM 황산나트륨과 30 mM DTT(1 M 스톡)를 탈이온수에서 65 mM DABCO로 만듭니다.
      5. HCl과 NaOH를 이용해 pH를 조절하여 pH를 8.0이 되도록 조절하세요. 4°C에서 2개월을 넘지 않은 온도에서 파라필름으로 덮고 밀봉하여 보관하세요. 사용 중 pH를 모니터링하세요.
2. 첫 번째 라벨 착색 과정 세부 사항:
   1. 집착:
      1. 인큐베이터에서 살아있는 세포를 꺼내고, 배양 배지를 접시에서 꺼내세요. 세포 배양 배지를 생물학적 위험 폐기물 용기에 버리세요.
      2. 세포를 덮을 만큼 충분한 PBS를 추가하세요(35mm 접시는 1mL, 챔버 유리 슬라이드에는 500μL).
      3. 접시를 부드럽게 휘저어 세포를 PBS로 씻은 후, PBS를 제거하세요. PBS는 생물학적 위험 폐기물 용기에 버리세요.
      4. 세포를 덮을 만큼 충분한 고정액을 넣습니다(35mm 접시는 1mL, 챔버 글라스 슬라이드에는 500 μL), 그리고 세포를 10분간 고정시키세요.
      5. 셀을 고정하는 동안, 소금용액의 붕소화나트륨을 저울질하여 원심분리관에 넣으세요.
      6. 고정액을 접시에서 제거하고 적절히 라벨이 붙은 액체 화학 폐기물 용기에 버리세요.
   2. 소결과
      1. 접시에 표면을 덮을 만큼 충분한 PBS를 넣으세요(35mm 접시는 1mL, 챔버 글라스 슬라이드에는 500 μL), 그 후 접시를 셰이커(일반 셰이커 모두 괜찮음)에 올려 세포를 5분간 세척합니다.
      2. 셰이커에서 접시를 떼어 PBS를 제거한 뒤, 적절히 라벨이 붙은 액체 화학 폐기물 용기에 버리세요.
      3. 접시에 표면을 덮을 만큼 충분한 양(250 μL, 8웰 접시) 담금용액을 넣으세요(35mm 접시는 1 mL, 챔버 글라스 슬라이드에는 500 μL), 그 후 접시를 셰이커에 올려 세포 내 자가형광을 완전히 소지합니다.
      4. 셀이 셰이커에 있는 동안, 남은 소환액은 적절한 라벨이 붙은 액체 폐기물 용기에 넣은 원심분리관에 버립니다.
      5. 셰이커에서 접시를 떼어 담금용액을 제거한 뒤, 적절히 라벨이 붙은 액체 폐기물에 버리세요.
      6. 표면을 덮을 만큼 충분한 양(250 μL, 8웰 접시) PBS를 접시에 넣으세요(35mm 접시는 1 mL, 챔버 글라스 슬라이드는 500 μL), 그 후 접시를 셰이커에 올려 세포를 5분간 세척합니다.
      7. 셰이커에서 접시를 떼어 PBS를 제거한 뒤, 적절히 라벨이 붙은 액체 화학 폐기물 용기에 버리세요.
      8. 1.2.2.6과 1.2.2.7 단계를 두 번 더 반복하여 총 3번의 PBS 세척을 완료합니다.
   3. 블로킹
      1. 표면을 덮을 수 있을 만큼 충분한 차단 완충제를 접시에 추가하세요(250 μL, 8웰 접시, 35mm 접시용 1 mL, 챔버 글라스 슬라이드용 500 μL).
      2. 접시를 셰이커 위에 최소 1시간 올려 세포막을 투과시키고 결합 부위를 차단하세요(지정된 부위를 점유하여 목표 부위와 간섭하지 않도록 하세요). (최소 성공적인 차단 지속 시간을 20분으로 여러 차례 테스트했지만, 최소 1시간 이상 차단을 하룻밤까지 강력히 권장합니다. 표적과 세포주를 고려할 때 최적화가 필요할 수 있습니다.)
      3. 세포가 셰이커에 있는 동안 1차 항체 염색액을 준비하세요(공급업체 웹사이트의 권장 농도 참조 또는 재료 섹션의 표를 참고).
      4. 염색액의 총 부피를 결정하려면, 세포를 덮는 부피에 0.5mL를 추가하세요(예: 35mm 접시 한 개라면 1.5mL 용액을 준비하세요).
      5. 1.2.3.1절에서 결정된 부피를 차단 완충 스톡에서 제거하고, 이 부피를 새로운 원심분리관에 넣어 염색 용액을 준비합니다.
      6. 적절한 양의 1차 항체 재고를 차단 버퍼에 추가하여 최종 농도를 정확히 얻습니다. 여러 자주 사용되는 항체의 1차 항체 재고 부수는 재료 섹션에서 확인할 수 있습니다.
      7. 셰이커에서 접시를 떼어 차단 완충제를 제거한 뒤, 적절히 라벨이 붙은 액체 폐기물 용기에 버리세요.
   4. 1차 항체 염색:
      1. 접시에 표면을 덮을 만큼 충분한 1차 항체 염색액(35mm 접시는 1mL, 챔버 글래스 슬라이드는 500 μL)을 첨가한 후, 접시를 셰이커에 올려 세포 표적을 표지하기 위해 최소 1-2시간에서 하룻밤까지 보관합니다.
      2. 셰이커에서 접시를 떼어 1차 항체 염색액을 제거한 뒤, 적절히 라벨이 붙은 액체 화학 폐기물에 버리세요.
      3. 표면을 덮을 만큼 충분한 세척 완충제를 넣으세요(35mm 접시는 1mL, 챔버 글라스 슬라이드에는 500 μL), 그 후 접시를 셰이커에 올려 세포를 5분간 세척합니다.
      4. 셰이커에서 접시를 떼고 세척 완충제를 제거한 뒤, 적절히 라벨이 붙은 액체 화학 폐기물 용기에 버리세요.
      5. 1.2.4.3과 1.2.4.4 단계를 두 번 더 반복합니다(총 3번의 세척 버퍼 세척).
      6. 마지막 세척 시 세포가 셰이커에 있을 때, 2차 항체 염색 용액을 준비하세요(공급업체 웹사이트의 권장 농도 참조 또는 이전 실험 참고).
      7. 염색액의 총 부피를 결정하려면, 세포를 덮는 부피에 0.5mL를 추가하세요(예: 35mm 접시 한 개라면 1.5mL 용액을 준비하세요).
      8. 1.2.4.7절에서 결정된 부피를 차단 버퍼에서 제거하고, 이 부피를 새로운 원심분리관에 넣어 염색 용액을 준비합니다.
      9. 적절한 양의 2차 항체 토지를 차단 버퍼에 추가하여 최종 농도를 정확히 얻습니다. 여러 자주 사용되는 항체의 2차 항체 재고량은 재료표에서 확인할 수 있습니다.
      10. 원심분리기를 2차 항체 염색 용액으로 알루미늄 호일로 감싸 접시의 세포에 넣을 준비가 될 때까지 유지하세요.
   5. 2차 항체 염색:
      1. 접시에 표면을 덮을 만큼 충분한 2차 항체 염색액을 첨가합니다(35mm 접시는 1mL, 챔버 글라스 슬라이드는 500 μL), 접시를 셰이커에 최소 40분간 올려 표지된 세포 표적에 형광체를 첨가합니다.
      2. 형광체 표백을 방지하기 위해 접시에 알루미늄 호일로 덮어야 합니다.
      3. 셰이커에서 접시를 떼어 2차 항체 염색액을 제거한 뒤, 적절히 라벨이 붙은 액체 화학 폐기물에 버리세요.
      4. 접시에 표면을 덮을 만큼 충분한 PBS를 첨가하세요(35mm 접시는 1mL, 챔버 글라스 슬라이드는 500 μL), 그 후 접시를 셰이커에 올려 세포를 5분간 세척합니다.
      5. 셰이커에서 접시를 떼어 PBS를 제거한 뒤, 적절히 라벨이 붙은 액체 화학 폐기물 용기에 버리세요.
      6. 1.2.5.4와 1.2.5.5 구간을 한 번 더 반복하여 총 2번의 PBS 세척을 합니다.
      7. 이제 세포는 영상화나 저장이 가능해졌습니다. 즉시 영상 검사를 한다면 획득 섹션의 단계를 따르세요. 나중에 영상을 위해 보관할 경우, 아래 단계를 계속 따르세요.
      8. 보관 전에 표면을 덮을 만큼 충분한 PBS를 첨가하세요(35mm 접시는 1mL, 챔버 글라스 슬라이드에는 500 μL).
      9. 접시를 파라필름으로 감싼 후 알루미늄 호일로 감아 액체 증발과 형광체 표백을 방지하세요.
      10. 랩에 싸인 접시는 촬영 준비가 될 때까지 4°C에 보관하세요.
          참고: 이 프로토콜에 사용되는 라벨의 경우, 접시는 2-3일 동안 보관할 수 있으며, 그 후 화질에 큰 영향을 미칩니다; 그러나 서로 다른 항체는 안정성이 다를 수 있으나, 적절한 보관 시 프로토콜이 완료된 후에도 일정 기간 안정적입니다. 고정액이 장기 안정성을 위해 충분히 농축되지 않아 라벨이 붙은 접시를 일주일 이상 보관하는 것은 권장되지 않습니다.
3. 이후 라벨 착색 과정:
   1. 블로킹:
      1. 1.2.3.1 - 1.2.3.2를 참고하되, 염소 혈청과 블로킹 버퍼를 사용하세요. 블로킹 잠복 시간은 1시간까지 짧을 수 있으나, 이후 표적에서 벗어난 결합을 줄이기 위해 추가 표지에 대해 하룻밤(18-24시간)을 제한하는 더 긴 시간을 권장합니다. 이전 실험들을 참고해 주세요.
      2. 그동안 차단 버퍼 대신 염소 혈청을 사용해 차단 버퍼 안에 1차 항체 용액을 준비하세요.
   2. 1차 항체 염색:
      1. 수정된 차단 완충제와 염소 혈청으로 세척 완충제를 준비하고, 완충제 준비 섹션에 자세히 설명된 대로 염소 혈청으로 세척 완충제를 준비합니다.
      2. 수정된 차단 및 세척 버퍼를 사용하여 1.2.3-1.2.4 단계 섹션(차단 및 1차 항체 염색)을 참조하십시오:
         참고: 1차 항체의 잠복 시간은 1시간에서 하룻밤(8-24시간)까지 짧을 수 있습니다. 특히 다중 라벨의 경우 더 긴 인큐베이션 기간을 통해 최고의 라벨링 성과를 달성했습니다. 이 프로토콜의 데이터는 하룻밤 인큐베이션 단계를 통해 준비되었습니다.
      3. 배양 시간이 완료되기 직전, 수정된 차단 버퍼 1.1.3에 2차 항체 용액을 준비합니다.
   3. 2차 항체 염색:
      1. 1.2.5절(2차 항체 염색)을 참고하되, 염소 혈청이 포함된 차단 버퍼를 사용하세요.
         참고: 부화 시간은 1시간까지 짧을 수 있으나, 2-4시간으로 유사한 성능을 보여준 경험도 있습니다. 다음 라벨은 1.3절을 반복해 주세요.

2. 획득 과정

참고: 데이터 수집을 위해서는 사용한 현미경과 호환되는 니콘 이미징 소프트웨어(NIS) 요소 소프트웨어를 사용하세요. 필터, 빛 경로, 카메라 설정을 제어할 수 있는 소프트웨어는 이 프로토콜에 적합합니다. 다음 영상 프로토콜은 시료의 전반사 형광(TIRF) 조명에 맞게 조정되었습니다; 하지만 이 라벨링 프로토콜은 여러 형태의 영상 촬영과 호환됩니다. 이 라벨링 프로토콜을 통해 STORM에 대해 비-TIRF 이미징이 가능하며, 3D STORM 응용에 필요합니다. 대체 영상 방법론을 위한 표준 프로토콜을 사용해 주시기 바랍니다.

1. 이후 라벨 착색 과정:
   1. 광학 부품을 켜고 적절한 소프트웨어와 연결하세요. 대부분의 경우, NIS와 같이 컴퓨터가 현미경, 카메라, 스테이지 컨트롤과 제대로 통신할 수 없으면 소프트웨어가 완전히 초기화되지 않습니다.
   2. 오픈 NIS 소프트웨어(또는 동등한 소프트웨어)를 사용하세요.
   3. 라이브 뷰 설정: 라이브 뷰를 켜고 >카메라 설정에서 자동 스케일> 유지 하세요.
   4. 획득을 위한 데이터 경로를 설정하세요.
   5. 상단 패널로 이동 하기 획득> 빠른 시간 경과> 경로
   6. 첫 번째 획득에 적합한 파일 이름을 선택하고 프레임 수를 10,000으로 설정하세요.
      참고: 이 조치들은 영상이 시작된 후 샘플이 광원에 노출되는 시간을 제한하기 위해 취해졌습니다.
   7. 획득 전에 TIRF의 임계각과 영각이 미리 설정되어 있는지 반드시 확인하세요. 이를 구현하는 방법에 대한 온라인 자료를 참고해 주세요. 앞서 언급했듯이, TIRF 조명을 사용하지 않는다면 이 단계를 건너뛸 수 있습니다.
   8. 카메라에 적합한 광 경로를 선택하고 Lamps(NIS 또는 동급 소프트웨어)에서 에 피 조명 옵션을 토글하여 비레이저 표준 광원으로부터 광시야로 조명되도록 미러가 설정되어 있는지 확인하세요.
2. 샘플 준비:
   1. 샘플을 채취하여 영상 버퍼(1.1절 버퍼 준비에 설명된 제형)를 샘플에 추가합니다. (사용되는 영상 버퍼에 따라 다양한 주의사항이 필요할 수 있습니다. 샘플을 빛으로부터 보호하세요.)
   2. 대물렌즈에 오일을 넣은 후, 적절한 홀더와 함께 샘플을 무대 위에 놓고 퍼펙트 포커 스를 켜고 이후 샘플에 집중하세요.
3. 영상 검사 단계:
   1. 레이저 스팟을 찾아서 셀이 없는 접시나 플레이트의 한 지점으로 이동하세요.
   2. TIRF 조명을 켜세요.
   3. 적색(또는 이 특정 샘플의 데이터를 획득하는 데 사용된 레이저) 빛을 통과시키기 위해 적절한 필터에 필터를 변경하세요.
      참고: 재료표에 설명된 다중 노치 필터를 사용하세요. 멀티 노치 필터는 필요하지 않으며, 사용자는 염색에 사용되는 형광체에 맞게 설계된 구분 없는 필터 큐브를 촬영할 수도 있습니다.
   4. 레이저를 가장 낮은 레이저 출력 ~ 1 mW(조명원에 따라 다르지만 실수로 표백되는 것을 방지하기 위해 하는 설정)에서 켜고, 거울 각도를 임계 각도로 설정하세요.
   5. 근처에 셀이 없다면, 레이저 스폿이 라이브 뷰에서 명확히 보일 때까지 레이저 출력을 높입니다.
   6. 관심 영역(ROI) 도구를 사용해 레이저 스팟이 위치한 위치를 그리고, 설정한 후 저장하세요.
      참고: 다중 라벨 샘플의 경우, 샘플에 필요한 모든 광원의 레이저 스팟이 정렬되어 있는지 반드시 확인하세요. 이 프로토콜에서는 세 개의 레이저를 사용해 모든 지점이 정렬되도록 합니다. 이는 공간 데이터의 공동 등록을 위해 레이저 정렬이 필요하기 때문에 필수적입니다.
   7. 에피 조명과 밝은 필드 필터로 돌아가세요.
   8. ROI 정의 도구를 사용해 적절한 건강한 세포를 찾으세요(예: 적절한 HCT116 세포는 부착형, 다각형 또는 타원형이며 명확한 세포 경계를 가져야 합니다).
   9. ROI를 핵에 맞추고 확인 버튼을 눌러 ROI 위치로 확대하세요 (밝은 필드 조명을 사용해 수행하세요. 핵의 광시야 형광 이미지만으로는 세포의 건강 상태를 직접 판단할 수 없습니다.
   10. 2.3.2에서 사용된 동일한 방법을 사용하여 TIRF 조명으로 돌아갑니다.
   11. 가장 긴 파장의 라벨링 타겟(대부분 매우 빨간색인 알렉사 플루오 647 라벨링 타겟)에 적합한 필터를 선택하세요. 보통 가장 긴 파장을 먼저 선택하여, 표지된 표적이 스펙트럼과 겹치는 보조 파장이 있을 경우 짧은 파장의 광표백을 피합니다.
   12. 낮은 레이저 출력에서 필요한 각 레이저(다중 라벨 경우 3개의 레이저)마다 레이저를 켜고 핵을 조명하여 샘플이 제대로 정렬되었는지 확인하세요.
   13. TIRF 제어를 사용하여 시료가 TIRF로 조명되도록 하세요.
   14. 필요에 따라 적절한 Z-위치를 선택하세요. 하지만 이 점은 획득 직전에 조정할 수 있습니다.
   15. Set exposure time based on needs of the fluorophores (use anywhere between 10‬-30 ms).
   16. 빠른 타임랩스> 획득 버튼을 클릭하세요.
   17. 프레임을 ≥10,000으로 설정하고 Apply 를 눌러 지정된 디렉터리에 파일을 생성하세요.
   18. 레이저 출력을 50%로 켜고 광표백제 샘플을 사용하세요.
   19. 핵은 처음에 표백되지만, 곧이어(몇 초 후) 깜빡이기 시작합니다.
   20. 저장된 위치를 토글하거나 수동으로 미러 각도와 Z 위치를 제어하여 원하는 임계 각도와 Z 위치로 돌아가면 빠른 타임랩스를 얻을 수 있습니다.
   21. 무대에 드리프트가 없는지 확인하며, 그렇지 않으면 다중 채널 이미지의 공동 등록이 제대로 이루어지지 않을 수 있습니다. 수신자 표시(형광 마이크로비즈)를 사용하거나 획득 시작 시 Z-위치를 저장하여 장치 내 다중 지점 획득을 위한 위치 저장 방식을 사용해 드리프트 보정에 사용할 수 있습니다.
   22. 필터를 교체하거나(필요한 플루로포어를 위해 통과 밴드가 있는 멀티 노치를 사용할 경우 필터를 그대로 두세요) 그리고 2.3.17-2.3.20 절을 반복하세요 (이후 라벨은 항상 낮은 레이저 출력에서 시작해 파라미터를 조정한 후 획득하세요).
4. 데이터 처리:
   1. Bio-Formats 플러그인을 사용해 원본 이미지 스택을 FIJI에 불러와보세요. 최소 강도 투영을 생성하려면 Image> Stacks> Z Project를 선택하고 최소 강도를 투영 유형으로 선택하세요. Process > Image Calculator를 사용해 이 최소 투영을 원시 이미지 스택에서 빼세요. 결과 이미지에 대해 배경 뺄셈(Process > Distract Background)을 굴리는 공 반경 5픽셀로 수행합니다.
   2. 개별 셀에 대해 관심 영역(ROI)을 수동으로 또는 Nuclei Outline 플러그인(Plugins > GDSC > Cells > Nuclei Outline)을 사용해 정의하세요.
   3. ThunderSTORM 플러그인(Plugins > ThunderSTORM > Run analysis)을 사용하여 정의된 ROI 내에서 사전 처리된 이미지 스택에 대해 현지화 분석을 수행하세요. 강건한 위치 지정을 위해 적절한 매개변수를 사용하세요(예: 이미지 필터: B-스플라인, 차수 = 3, 스케일 = 2; 최대 강도 임계값 = 1.5× 표준 (Wave.F1); 서브픽셀 위치화 방법: 가우시안, 시그마 = 2; 적합 반경 = 4; 적합 방법: 최대우도). 결과된 좌표는 초해상도 이미지를 재구성하는 데 사용할 수 있습니다.
   4. 다중 채널 실험의 경우, 채널을 병합하여 합성 크로마틴 재구성 dSTORM 이미지를 생성합니다(색상 > 채널 병합 이미지>).

Results

대표적인 3색 크로마틴 dSTORM 이미지

제안된 순차적 염색 프로토콜은 BJ 섬유아세포, HCT116, AC16, HeLa, MCF10A 등 다양한 세포주에서 유효하게 검증되었습니다. 그림 1 은 BJ 섬유아세포, HeLa, MCF10A 세포의 대표적인 이미지를 보여줍니다.

시뮬레이션 데이터셋을 이용한 분석 파이프라인 검증

3색 면역 형광 프로토콜 개발은 다중 표적 핵 SMLM 데이터의 복잡성을 처리할 수 있는 특수한 계산 접근법의 개발을 필요로 했습니다(그림 2A, 2B). 여러 표적이 근접하게 공존하는 밀집된 크로마틴 환경을 고려하여, 우리는 재구성된 이미지가 아닌 위치 좌표를 직접 처리하는 포인트-클라우드 분석 프레임워크를 구현했습니다. 이 접근법은 포인트 클라우드 데이터^{40, 41, 42}에 대한 광범위한 클러스터링 분석 도구를 활용합니다. 우리는 통제된 시뮬레이션 데이터셋을 사용하여 생물학적으로 의미 있는 공간 패턴을 구별하는 분석 파이프라인의 능력을 체계적으로 평가했습니다. 서로 다른 염색질 조직 시나리오를 나타내기 위해 네 가지 분포 유형이 생성되었습니다: 밀접하게 군집화된 변형에 대한 정규 분포, 분산 패턴에 대한 균일 분포, 배제 구역을 모델링하는 토로이드 분포, 그리고 조직적 통제군으로서의 무작위 분포(그림 2C). 이 시뮬레이션 패턴들은 실험적 H3K9me3 데이터를 기반으로 한 실제 이색질 군집 위치에 고정되어 현실적인 핵 공간 제약을 유지했습니다. 이 분석 프레임워크는 DBSCAN 클러스터링(epsilon = 50 nm, 최소 점 = 3)을 활용하여 SMLM 데이터^{40, 41, 42}에서 군집 분석에 사용되는 여러 방법 중 하나입니다. 적절한 클러스터링 매개변수를 보장하기 위해, 우리는 이전에 크로마틴 패킹 도메인 검출에 맞춘 최적화 방법을 설명한 바 있습니다^. 분석을 초기 단계로 사용할 때는 사용자가 표적의 구조, 환경 및 기능을 통해 선택에 영향을 미치는 매개변수를 최적화해야 한다는 점을 유의하세요. 여기서 클러스터 경계는 볼록 껍질 계산을 통해 결정되어 도메인 기하학에 대한 가정을 제거한다. 우리의 검증은 독특한 거리 히스토그램 프로파일을 통해 모든 시뮬레이션된 분포 패턴 간에 명확한 구별이 있음을 입증했습니다(그림 2D). 각 공간 조직 유형은 이색채질 중심체에 대한 위치 분석을 통해 특징적인 신호를 생성했다. 공동 점유 분석은 제어된 공간 관계를 가진 이중 마커 시뮬레이션을 사용하여 테스트되었습니다(그림 2E). 공간적으로 분리된 마커(정규-토로이드 구성)는 예상대로 최소한의 접합 밀도를 제공하여 평탄한 분포 프로파일을 만들었다(그림 2E). 겹치는 마커 패턴(정규-무작위 구성)은 기준점과의 거리가 커질수록 조인트 밀도가 감소하여 이론적 예측과 일치했습니다. 이러한 검증 결과는 복잡한 다중 대상 데이터셋에서 공간적 결합 관계를 탐지하고 정량화하는 우리의 프레임워크 역량을 보여줍니다. 이 시뮬레이션 데이터셋이 어떻게 생성되었는지에 대한 자세한 내용은 전체 출판물³⁴를 참조하십시오.

염색질 조직 분석의 대표성 결과

생물학적 샘플에서 검증된 분석 접근법을 구현함으로써 이 프로토콜을 통해 달성할 수 있는 특징적인 공간 조직 패턴이 드러났습니다. H3K9me3, H3K27ac, RNA 중합효소 II에 대해 3색 염색 절차로 처리한 HeLa 세포를 사용하여 이 방법론이 가능하게 하는 분석 능력을 입증했습니다. H3K9me3 이종색질은 이전 초해상도 연구(23,28,35)에서 200 nm 스케일에서 동심원 염색질 조직에 대한 확립된 증거를 고려할 때 이상적인 기준 시스템 역할을 합니다. 분석은 DBSCAN 기반 이종염색질 도메인 식별에서 시작되며, 이후 유효 반경에 따라 작은 도메인(25-40 nm), 중간 도메인(40-80 nm), 큰 도메인(80-253 nm)으로 분류됩니다. 이 크기 층화는 DNA 패킹 도메인 차원의 이질성을 설명하며, 평균 도메인은 반지^{름 25}에서 약 80 nm입니다. 거리 측정은 1.5배 클러스터 반경 탐색 창(그림 2B 상단)을 사용하여 근접 유크로마틴 및 중합효소 신호를 포착합니다(그림 3A,B).

대표적인 결과는 H3K27ac와 RNA 중합효소 II가 모든 도메인 범주에서 이색질 경계 근처를 일관되게 위치시키며, 이는 이전 연구^28,44와 일치하며, 전사 위치 상대 모델(23,35,45,46)과 일치합니다. 정량적 거리 분석은 도메인 주변부에 매우 가까운 평균 위치임을 보여줍니다: 큰 도메인은 경계에서 -1.0 nm 거리에서 H3K27ac, 8.4 nm 거리에 RNA 중합효소 II를 나타내며, 작은 도메인은 미세한 위치 차이와 유사한 주변 연관성을 보입니다. 이 측정들은 활성 크로마틴 원소가 억제 도메인과 허용 도메인의 경계면에 집중되어 있음을 시사하며, 완전히 배제된 것이 아님을 나타냅니다. 조인트 밀도 분석은 프로토콜이 공동 표지된 표적 간 공간적 결합을 드러내는 능력을 입증합니다(그림 3C-F). 이종색질질 도메인에 대한 분석에서는 도메인 경계 바로 바깥쪽에서 접합 밀도가 최고조에 나타나는 것으로 나타났습니다(r/r₀> 1). 이는 말초 영역에서 H3K27ac-RNA 중합효소 II가 우선적으로 공동 위치됨을 나타냅니다(그림 3G-I). 이 결과들은 이 염색 및 분석 파이프라인이 밀집된 환경에서 복잡한 공간 관계를 조사하는 데 어떻게 도움이 될 수 있는지를 보여줍니다.

그림 1: 사용된 세포의 세 가지 컬러 이미지. (A) BJ 섬유아세포, (B) HeLa, (C) MCF10A의 3색 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 헤테로크로마틴 클러스터에 대한 표적 공간 조직을 위한 정량적 분석 프레임워크. (A) 본 연구에서 사용된 다중 채널 SMLM 데이터를 위한 분석 파이프라인. (B) 확인된 헤테로크로마틴 클러스터에 대한 주변 거리 계산 개식과 공동 친화력 계수 방법. 두 방법 모두 헤테로크로마틴 클러스터 구조에 대한 두 표적 배열을 정량적으로 결정하는 데 사용됩니다. (C) 특정 이색질 클러스터 주변의 산란 분포 예시: 표적 구조의 뚜렷한 생물학적 조직(도메인 내에 군집됨, 도메인 주위에 군집됨, 연관되지 않음, 무작위 분포) 결정에 사용된³⁴. (D) 중심 군집, 무작위 분포, 토로이드 분포의 주변 히스토그램까지의 거리 및 (E) 시뮬레이션 사례의 결합 친화도 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 히스톤 도메인 주변 전사 마커의 정량적 공간적 관계. (A) 다중 표지된 HeLa 세포의 대표적 생물학적 데이터를 위한 말초 히스토그램 결과와의 거리. RNAPII와 (B) H3K27ac는 H3K9me3 클러스터에 비해 작은(<40 nm), 중간(40-80 nm), 대(>120 nm) 도메인에 대해 사용됩니다. (C-E) HeLa 셀의 3개 라벨 dSTORM 이미지 예시(H3K9me3, H3k27ac, RNAPII2-S2p, 단일 도메인에 대한 삽입 및 확대 이미지 포함). (F) E에 표시된 영역의 볼록 껍질(빨간색) 피팅, 해석 영역은 회색으로 표시됨. (G) 분석 내 중간 크기 데이터 내 모든 도메인에 대한 ROI를 분석에서 R3K27ac 및 R3K27ac (H)와 RNAPII에 대한 친화도 플롯. (I) 모든 중간 크기 도메인에서 RNAPII와 H3K27ac의 결합 밀도 분석 ROI. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

Discussion

이 3색 SMLM 프로토콜은 밀집된 핵 환경에서 크로마틴 조직을 연구하는 데 있어 중요한 진전을 의미합니다. 순차적 면역형광 표지 접근법과 위치 추정치를 점으로 사용하는 점군 공간 분석과 결합되어, 기존 현미경 기법으로는 검출할 수 없었던 다양한 염색질 변형과 활성 전사 기구 간의 나노스케일 관계를 연구하는 강력한 도구를 연구자들에게 제공합니다.

프로토콜의 순차적 염색 전략은 다중 표적 핵 영상에 내재된 근본적인 문제를 해결합니다. 세포질 또는 막 관련 구조가 비교적 희박한 것과 달리, 핵 염색질 표적은 매우 높은 밀도로 존재하며 겹치는 공간 영역을 가지고 있습니다. 각 표지 라운드 후 2차 항체 숙주 종의 혈청을 포함하는 수정된 차단 접근법은 항체 쌍 간 교차 반응성을 효과적으로 방지하면서도 표적 특이성을 유지합니다. 4°C에서의 하룻밤 인큐베이션은 항체가 핵 부피 전체에 걸쳐 완전히 침투하도록 보장하며, 이는 정량적 SMLM 분석에 필요한 균일한 표지 밀도를 달성하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜은 여러 세포주에 걸쳐 15-20 nm 해상도의 이미지를 신뢰성 있게 생성하여 염색질 조직 연구에 널리 적용할 수 있습니다.

다음은 영상 촬영을 위한 문제 해결 팁입니다. 핵이 표백되지 않는다면, 가장 흔한 원인은 시료에서 레이저 강도가 부족하다는 점이며, 이는 낮은 출력 설정이나 잘못된 TIRF 각도에서 비롯될 수 있습니다; 이 경우 레이저 정렬을 점검하고, 레이저 출력을 높이며, TIRF 각도를 신중하게 조정하여 문제 해결을 해야 합니다. 핵 내 깜빡임이 매우 적지만 항상 밝게 유지된다면, 이는 핵이 충분히 표백되지 않았음을 의미합니다. 눈 깜빡임이 매우 드물고 핵이 전혀 보이지 않는다면, 가장 유력한 원인은 염색에 실패한 것이며, 프로토콜을 반복하기 전에 시약과 항체를 반드시 확인해야 합니다. 반대로, 핵 깜빡임 횟수가 매우 많으면(바람직한 결과), 개별 잘 분리된 단일 분자 깜빡임을 시각적으로 구분할 수 있을 때까지 더 긴 표백 시간이 필요합니다. 기존의 SMLM 실험에서는 미세소관과 같은 명확한 기준 구조를 사용하여 적절한 표지 밀도를 추정할 수 있습니다; 그러나 염색질은 매우 이질적인 조직을 보이고 명확한 진실-진실 구조가 없어 이러한 추정이 더 어렵습니다. 경험적 최적화와 이전 경험을 바탕으로, 우리는 효과적인 표지 밀도가 μm²당 약 100개의 국소화에 도달하도록 하여 크로마틴 패킹 도메인의 견고한 재구성을 가능하게 합니다. 우리 프로토콜에서는 어떤 수탁자 표시도 사용하지 않았지만, 사용자가 가지고 있다면 권장했습니다. 우리 실험에서는 측면 이동이 0.2 픽셀(~5nm 미만) 이내로 유지되며, 이를 무시할 수 있습니다. 따라서 우리는 수탁자 표식을 사용하지 않았습니다.

H3K9me3, H3K27ac, RNA 중합효소 II의 선택은 나노스케일 수준에서 크로마틴 조직에 대한 상호 보완적인 정보를 제공합니다. H3K9me3는 구성 이종색질을 나타내는 이산적이고 잘 정의된 클러스터를 형성하여 자동 클러스터링 알고리즘을 통해 신뢰성 있게 식별할 수 있어 이상적인 공간 기준 역할을 합니다. H3K27ac는 유전자 조절에 적극적으로 참여하는 증강체 관련 염색질을 표시하며, RNA 중합효소 II는 활성 전사 부위를 직접 나타냅니다. 이 세 가지 표적을 함께 사용하면 전사 기구와 조절 염색질 변형이 핵 구조 내에서 이종색질 영역에 대해 어떻게 조직되는지를 조사할 수 있습니다.

포인트 클라우드 분석 프레임워크는 밀집된 핵 환경에서 포괄적인 공간 분석을 가능하게 하여 이전 염색질 조직 연구의 중요한 한계를 해결합니다. 전통적인 쌍별 비교 방법은 동일한 핵 영역 내에서 여러 염색질 변형이 공존할 때 발생하는 복잡한 공간적 관계를 포착할 수 없습니다. 저희 접근법은 결합 밀도 분석을 활용하여 H3K27ac와 RNA 중합효소 II가 H3K9me3 클러스터 내에서 어디에 동일 위치하는지 밝혀내며, 별도의 2색 실험에서는 얻을 수 없는 정량적 정보를 제공합니다.

대표성 결과는 엄격한 염색질 구획화가 아닌 응집력 있는 조직 모델을 일관되게 보여줍니다. H3K27ac와 RNA 중합효소 II는 서로 다른 도메인 크기의 헤테로크로마틴 클러스터 주변부에 우선적으로 위치하며, 정량적 측정 결과 클러스터 경계에서 10nm 이내의 위치가 나타나 유사한 전사 방법과 모델을 가진 다른 그룹들의 발견을 뒷받침합니다 23,28,35,45,46. 조인트 밀도 분석 결과, 활성 전사 기구와 증강체 관련 염색질이 이색성 군집 주변 영역에서 가장 자주 결합함을 보여줍니다. 이 발견들은 단순한 상 분리 모델에 도전하며, 서로 다른 염색질 변형이 뚜렷한 구획을 형성하지 않고 밀접한 공간적 근접성을 유지하는 통합 조직 원칙을 지지합니다.

프로토콜의 모듈식 설계는 동일한 분석 틀을 유지하면서도 표적 치환을 통해 다양한 염색질 생물학 질문을 조사할 수 있게 합니다. 복제 시기 연구는 증식 세포 핵항원(PCNA)과 미니 염색체 유지(MCM)와 같은 세포주기 단백질을 대체할 수 있으며, DNA 손상 반응 연구는 γH2AX와 수리 인자를 표적으로 할 수 있습니다. 세포주기 연구는 분열 과정에서 변화하는 히스톤 변형을 조사할 수 있고, 분화 연구는 계통 헌신과 관련된 후생유전학적 표식에 초점을 맞출 수 있습니다. 순차적 표지 접근법은 신뢰할 수 있는 항체가 존재하는 핵단백질 또는 염색질 변형의 모든 조합을 수용하며, 주로 스펙트럼 적합성과 교차 반응성 고려사항에 의해 제한됩니다. 이러한 유연성 덕분에 연구자들은 다양한 세포 과정 중 크로마틴 역학에 관한 근본적인 질문을 해결하면서도 정량적 공간 분석 능력을 유지할 수 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Andor iXon Ultra 888 전자 증폭 CCD	안도르	DU-888U3-CSO-#BV	NA
소 혈청 알부민	시그마 올드리치	A7030	블로킹 및 워싱 버퍼에 사용됩니다. BSA 기반 차단 버퍼를 4°에 1개월 이상 저장하지 마세요; C
창춘 신산업광전자기술공사, 모델: MGL-FN-532 (532nm) 및 nbsp;	PSU-H-LED	https://www.cnilaser.com/MGL-FN-532.htm	NA
코히어런트 OBIS 레이저 박스 (405 nm, 488 nm, 532 nm, 552 nm, 637 nm) & nbsp;	일관성	1228877	레이저는 3&ndash와 콜리미네이션을 했습니다; 10 kW/cm³ 샘플 평균 출력, 파장 채널당 최소 10,000프레임 수집; 10– 30  MS  획득 시간.
DABCO (1,4-디아자비사이클로-(2.2.2)-옥탄)	시그마	D27802	NA
DBPS (1X)	써모피셔	14190-136	NA
증류수	NA	NA	증류수는 괜찮아요;
DTT(디티오트레이톨), 1M	시그마	43816	NA
8개의 잘 챔버된 커버 유리	셀비스	C8-1.5 H-N	어떤 유리 바닥판이든 가능하지만, 용기에 따라 부피를 조절해야 합니다.
염소 안티 마우스 AF568	써모피셔	A11004	재고 농도: 2 mg/mL 표기 후 안정성: 2– 3일
염소 안티 래빗 AF647	써모피셔	A21245	재고 농도: 2 mg/mL 라벨링 후 안정성: 4– 5일
염소 반쥐 A488	써모피셔	A11006	재고 농도: 2 mg/mL 표기 후 안정성: 2– 3일
H3K27ac 1차 항체	써모피셔	MA5-23516	재고 농도: 1.0 mg/mL & nbsp;
H3K9me3 1차 항체	앱캠	AB1769156	재고 농도: 1.287 mg/mL & nbsp;
고투명도, 폴리프로필렌 원뿔관 15 mL   그리고 nbsp;	코닝	352096	고정액 및 소금 용액에 사용됨;
고투명도 폴리프로필렌 원뿔관 50 mL	코닝	352070	40mL 작업 중인 블로킹 및 세척 완충제에 사용
염산(HCl), 12M	시그마	258148	NA
완벽한 초점 시스템을 갖춘 니콘 이클립스 Ti-E	니콘	TI-DH 611392	역현미경
니콘 SR APO TIRF, 100배 배율, 1.49 NA	니콘	https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/cfi-apochromat-tirf-series	NA
일반 염소 혈청	앱캠	AB7481-1002	첫 번째 라벨이 붙은 후에 사용하세요. 블로킹 및 워싱 버퍼에 있어야 합니다
파라포름알데히드 16%	전자현미경 과학	15710	고정액에 사용되며, 제작 후 2주 이내에 다 써야 합니다. 빛으로부터 보호하세요 4도 이하; C
인산염 완충 식염수(PBS) 10X	암비온	AM9625	NA
피펫 팁 1000 uL	슈어원	02-707-404	어떤 피펫 팁이든 괜찮아요, 단' s는 볼륨에 적합하다
RNAPII-PS2	앱캠	AB252855	스톡 농도: 0.98 mg/mL
붕소나트륨	써모피셔	S678-10	매번 신선한 완충 완충제를 사용하세요.
수산화나트륨(NaOH)	Thermo Fisher	A16037.36	NA
황산나트륨	시그마	S0505	NA
트라이튼 X-100 10%	Thermo Fisher	28314	NA