Method Article

췌장암을 위한 효소 반응성 스쿠알렌-치다마이드 나노입자의 개발 및 효능

DOI:

10.3791/69875

⸱

March 13th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 2Huzhou Institute for Food and Drug Control, 3Academy of Chinese Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 4Institute for Innovation in Modern Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Zhejiang Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 엽산 변형 스쿠알렌-키토산 나노입자의 합성 및 특성 분석, 효소 반응성 약물 방출 및 시험관 내 세포 흡수를 평가하고, 표적 전달을 통한 췌장암 치료 향상에 적용합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서는 췌장관 선암(PDAC)의 밀집된 세포외기질(ECM)으로 인해 소분자 약물의 종양 내 침투 능력이 제한적으로 발생하는 문제를 해결하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 프로드럭은 약물 침투력과 종양 제거 효능을 향상시켜 이 문제를 극복할 큰 잠재력을 제공합니다. 스쿠알렌(SQ)은 뛰어난 생체 안전성과 생체 적합성을 가진 콜레스테롤 생합성의 자연 전구체로, 친수성 약물의 막 호환성을 개선하고 화학요법제나 생리활성 소분자와 결합할 때 세포 흡수를 향상시킬 수 있습니다. 본 연구에서 우리는 새로운 지온 친색성 SQ 기반 프로드럭 시스템을 개발했습니다: 친수성 항암제인 치다마이드(CHI)가 췌크레아틴과 카텝신 B(PDAC 미세환경에서 과발현된 주요 효소)에 반응하는 아마이드 결합을 통해 SQ와 접합되었습니다. 이 결합은 양친병성 SQ-CHI 프로드럭을 생성했으며, 이는 추가로 자기조립되어 엽산(FA) 변형 나노입자(FA-SQ-CHI NPs)로 전환되었습니다. 최적화된 NP들은 173.3 ± 1.5 nm의 균일한 유체역학적 직경, 0.181 ± 0.18의 다분산 지수(PDI), 59.0% ± 0.77%의 높은 약물 적재 용량, 그리고 안정적인 제타 전위인 -13.10 ± 0.86 mV를 보였습니다. 시험관 내 방출 연구에서는 0.25% 췌장체가 있는 상태에서 NP가 72시간 이내에 누적 약물 방출 비율을 80.2% ± 4.22%에 도달한 반면, 효소 없이 pH 조정 완충제(pH 4.5 또는 7.4)에서는 33%-38%의 방출이 관찰되었습니다. 세포 흡수 검사 결과, FA 변형이 세포 내 전달 효율을 유의하게 높였음이 확인되었으며, PDAC 세포(PSN-1 및 CFPAC-1)에서 12-24시간 동안 비표적 NP에 비해 형광 강도가 1.8-2.3배 더 높았습니다. 현재 프로토콜은 프로드라약 합성 및 특성 분석, 효 소 반응성 방출 반응 평가, 치료 효능 및 조직 침투 비교 분석을 위한 포괄적인 방법론을 제공하며, 표적 전달, 높은 약물 부하, 효소 유발 조절 방출이라는 나노캐리어의 핵심 장점을 강조합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

췌장관 선암(PDAC)은 소화관에서 매우 악성인 종양으로, 발생률이 사망률과 거의 같고 5년 생존율은 8%-9%에 불과합니다. 복잡한 종양 미세환경(TME)은 PDAC2의 특징입니다. 주로 비정상적인 세포외기질(ECM), 활성화된 암 관련 섬유아세포(CAFs), 그리고 심각하게 면역억제 작용을 하는 세포 환경으로 구성되어 있습니다. PDAC ECM은 1형 콜라겐이 풍부합니다. 변화된 내용과 비정상적인 구조 모두 종양 진행을 촉진하며 예후가 좋지 않음과 연관되어 있습니다. CAF는 가장 풍부한 기질 세포로, 기질 생성형 myCAFs와 염증성 iCAFs와 같이 기능적으로 구별되는 하위 유형으로 구성되어 있으며, 이들은 표현형 가소성을 보인다.

면역학적으로 PDAC TME는 종양 전성 골수세포가 우세합니다. 항종양 림프구는 드물거나 기능 장애가 있습니다. 성숙한 B 림프구도 면역억제에 기여합니다 3,4. 이 요소들은 함께 여러 치료적 장벽을 형성합니다. 높은 간질액 압력이 특징인 밀밀한 기질은 심부 종양 부위에 치료제가 전달되는 것을 심각하게 방해하는 중요한 관통 장벽을 형성하여 화학요법 약물의 임상 효능을 크게 제한합니다. 따라서 이 기질 장벽을 극복하고 췌장 종양 조직 깊숙이 침투할 수 있는 약물 전달 시스템을 개발하는 것이 매우 중요합니다.

최근 몇 년간 콜레스테롤 생합성의 자연 전구체인 스콸렌(SQ)은 뛰어난 생물안전성과 생체 적합성 덕분에 상당한 주목을 받고 있습니다. SQ는 매우 소수성이기 때문에, 친수성 약물과 결합하여 양친성 프로드럭을 형성할 수 있어, 친수성 소분자 약물의 세포막과의 생체 적합성을 높이고 세포 흡수 효율을 높인다7. 이전 연구들은 SQ가 시스플라틴, 파클리탁셀, 젬시타빈 등 다양한 화학요법제와 공유 결합하여 높은 약물 적재 능력을 가진 원약물 나노입자를 형성하여 고형종양에 대한 약물 전달을 개선할 수 있음을 입증했습니다 8,9. 이러한 특성들은 약물 전달 시스템 개발에서 SQ의 광범위한 응용 가능성을 강조합니다.

종양 표적 조절을 강화하기 위해 본 연구는 엽산(FA)을 표적 리간드로 사용합니다. FA는 수용성 비타민으로, 1탄소 대사, 생합성10, 산화환원 항상성11, 메틸화 반응12에 필수적이다. FA가 카복실기를 통해 나노캐리어에 결합하면 엽산 수용체(FR)에 특이적으로 인식 및 결합이 가능하며, 이후 수용체 매개 엔도사이토시스13이 진행됩니다. 종양 세포의 향상된 투과성과 보존 효과를 활용하여 Zheng 등은 췌장암, 정상 췌장, 인접 조직, 만성 췌장염에서 엽산 수용체 α(FRα) 발현을 웨스턴 블롯팅과 면역조직화학을 이용해 평가하고, 임상 병리학적 특징과의 상관관계를 분석하였습니다. FRα는 췌장암 사례의 94.7%(72/76)에서 발현되어 전이와 연관되었으나, 정상 췌장 조직에서는 나타나지 않았습니다. FA에 변형된 나노입자는 FR 양성 조직에 선택적으로 축적되어 분자 표적 치료가 가능해집니다.

치다마이드(CHI)는 새로운 히스톤 탈아세틸화 억제제입니다. 전임상 연구에서는 췌장암, 유방암과 같은 고형종양에 대해 강력한 항종양 활성을 보이며, 종양 세포의 약물 내성을 역전시킬 수 있음이 입증되었습니다15,16. 그러나 강한 친수성은 종양 미세환경 침투 효율이 낮고 고형 종양 조직 내 분포가 낮아췌장암에 대한 임상 치료 잠재력을 심각하게 제한합니다. 이 연구는 치다마이드(CHI)를 모델 약물로 사용하여 CHI와 SQ의 접합을 통해 자기조립 나노입자를 제조하고 이후 FA로 변형하는 방법을 제안합니다. 이 전략은 CHI가 종양 미세환경 침투 부족과 고형 종양 조직 내 비최적의 분포를 극복하여 췌장암에 대한 항종양 효능을 향상시키는 것을 목표로 합니다. 더 나아가, 췌장암 세포주에서 CHI의 시험관 내 효능을 평가함으로써, 이 접근법은 친수성 소분자 약물인 CHI의 췌장 종양 미세환경 내 침투 및 세포독성 효과를 크게 개선하여 췌장암에서 CHI 기반 치료를 위한 실험적 기반을 제공할 것으로 기대됩니다.

본 연구는 췌장암 치료를 위한 CHI-SQ-PEG-FA 자기조립 프로드럭 나노입자를 제조하는 실험적 절차를 상세히 설명합니다. 구체적으로, CHI-SQ-PEG-FA 나노입자의 준비 공정 최적화 및 특성화, 그리고 시험관 내 약물 방출 연구를 설명합니다. 이 과정은 다음을 포함합니다: 첫째, 단일 요인 실험 접근법을 이용해 제형을 최적화하고 최적의 입자 크기와 약물 적재를 결정하는 것; 둘째, UPLC 및 MTS 분석법을 이용한 나노입자의 특성 규명; 마지막으로, 시험관 내 공동 배양 종양 구형 모델을 확립하였습니다. 표적 나노입자에서 형광 프로브로 쿠마린-6(C6)를 사용하여 3차원 종양 구체 내 나노입자의 침투 및 분포를 추가로 검증하고 관련 데이터를 얻었습니다.

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Protocol

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1. SQ-CHI와 SQ-PEG-FA의 합성

  1. SQ-CHI 합성: 1,1',2-tris-norsqualenoic acid 120.4 mg(0.3 mmol)을 무게로 측정하여 N 1 mL, N-디메틸포름아마이드(DMF)에 용해합니다. NHS(46 mg, 0.4 mmol)와 EDCI(72 mg, 0.38 mmol)를 순차적으로 첨가하고 질소 보호 하에 90분간 반응을 진행시킵니다.
  2. 치다마이드(58.56 mg, 0.15 mmol)를 1 mL의 DMF에 녹이고 반응 혼합물에 점차 첨가합니다. 반응을 질소 대기 아래 실온에서 72시간 저어줍니다.
  3. 완성 후에는 5-15 kPa의 감압 하에서 용매를 증발시켜 원유 제품을 얻습니다. DCM/MeOH의 구배 용출(99:1, 99:5, 85:5)을 이용한 플래시 컬럼 크로마토그래피로 원유 제품을 정제합니다.
  4. SQ-CHI의 구조 검증: 합성된 SQ-CHI 제품을 유리 바이알에 넣고 건조기 진공 상태에서 24시간 건조합니다. 제품을 약 1mL의 중수소화 클로로포름(CDCl3)에 용해하여 NMR 샘플 튜브로 옮깁니다. 제품의 화학 구조를 확인하기 위해 1HNMR 분석을 수행한다.17.
  5. SQ-PEG-FA 합성: 1,1',2-tris-norsqualenoic 산 41.12 mg을 35 μL DMF에 용해합니다. 이 용액에 N-하이드록시숙신니마이드(NHS, 15.71mg)와 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EDCI, 24.59 mg)를 순차적으로 첨가합니다.
  6. 질소 대기 중 90분간 반응을 진행시키세요. 20 mg의 FA-PEG-NH2 를 35 μL DMF에 녹인 후 반응 혼합물에 점차 첨가합니다.
  7. 결과 혼합물을 질소 아래에서 실온에서 72시간 동안 저어줍니다. 원유 제품을 3 kDa MWCO 초여과 원심분리관으로 5,200 x g 에서 30분간 정제하여 반응하지 않은 자유산을 제거합니다. 정제된 SQ-PEG-FA 복합 수용액을 유리 바이알에 넣고 -50 °C에서 미리 냉동합니다. 미리 냉동된 용액을 냉동건조기에서 라이오필라이즈하여 동성 분말 형태의 SQ-PEG-FA 복합체를 얻습니다.

2. SQ-PEG-FA의 구조 검증

  1. 동염 건조된 SQ-PEG-FA 복합체를 2mL 원심분리관에 넣고, 건조기 진공 상태에서 24시간 건조합니다. 이 제품을 약 1mL의 중수소화 디메틸 설폭화물(DMSO-d6)에 용해시키고 NMR 샘플 튜브로 옮깁니다. 복합물의 화학 구조를 확인하기 위해 1HNMR 분석을 수행하세요.
  2. SQ-CHI-PEG-FA NP의 준비 및 특성화 최적화
  3. SQ-CHI 6.64 mg을 무게로 측정하고 절대 에탄올 2mL에 녹여 3.32 mg/mL(4.3 μM) 정액을 만듭니다.
  4. SQ-CHI 에탄올 스톡 용액(1, 0.2, 0.1, 또는 0.05 mL)을 저어진 후 1 mL의 탈이온수에 떨어뜨리듯 첨가합니다. 5분간 저은 후 저압 증발로 에탄올을 제거합니다. 생성된 혼합물을 30분간 초음파 처리하여 CHI-SQ 나노입자 현탁액을 얻습니다. 제타라이저로 나노입자의 유체역학적 직경과 다분산 지수(PDI)를 측정하여 최적의 제형을 도출합니다18.
  5. 0.1mL의 SQ-CHI 에탄올 스톡 용액을 0분, 5분, 10분, 20분 정도 다른 저어 후 1mL의 탈이온수에 떨어뜨립니다. 교반 후에는 압력 감소 증발로 에탄올을 제거하고, 30분간 초음파 처리를 통해 CHI-SQ 나노입자 현탁액을 얻습니다. 유체역학적 직경과 PDI를 측정하여 최적의 교반 시간을 결정합니다.
  6. SQ-CHI 에탄올 스톡 용액 0.1mL를 5분간 저어주며 1mL의 탈이온수에 점차 떨어뜨립니다. 저어준 후에는 압력 저하 증발로 에탄올을 제거합니다. 생성된 혼합물을 0분, 5분, 20분, 30분 동안 초음파 처리하여 CHI-SQ 나노입자 현탁액을 얻습니다. 유체역학적 직경과 PDI를 측정하여 최적의 초음파 측정 시간을 결정합니다.
  7. 위 결과를 바탕으로 최적의 조건을 확인하세요. 여기서 얻은 물과 정액의 부피 비율 = 10:1, 교반 시간 = 5분, 초음파 처리 시간 = 30분입니다. 신뢰성을 위해 모든 실험을 독립적으로 3회 반복하세요.
  8. 다른 매개변수는 일정하게 유지하면서 단일 요인 방식을 사용하세요. 다음 요인들을 순차적으로 변화시켜 나노입자의 입자 크기 분포와 제타 퍼텐셜에 미치는 영향을 평가합니다: 구성 요소의 질량비(SQ-CHI: SQ-PEG-FA = 1:0, 1:0.05, 1:0.5, 1:0.7), 상부피비(수상: 유기상 = 1:1, 1:5, 1:10, 1:20), 초음파 시간(5, 15, 30, 45분).
  9. 최적화된 프로토콜에 따라 SQ-CHI와 SQ-PEG-FA 기본 용액을 정해진 비율로 혼합합니다. 이 혼합물을 이온수 위에 계속 저어주면서 드롭 방향으로 넣습니다. 충분히 섞이기 위해 5분간 저어주세요. 압력 감소 증발로 에탄올을 제거한 후 30분간 프로브 소닉 검사를 통해 최종 CHI-SQ-PEG-FA 나노입자 현탁을 얻습니다.
  10. 레이저 입자 크기 분석기를 이용해 동적 광산란을 이용해 나노입자의 유체역학적 직경, 크기 분포(PDI), 제타 퍼텐셜을 측정합니다. 투과 전자현미경(TEM, 150,000배 배율)과 주사전자현미경(SEM, 80,000배 배율)으로 나노입자의 형태를 관찰하세요.
  11. 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC)를 통한 약물 부하 함량 측정
  12. 크로마토그래피 조건은 다음과 같이 설정하라: C18 컬럼 (2.1 mm x 50 mm, 1.7 μm); 이동상: 0.1% 개미산 수용액 - 아세토니트릴 (75:25, v/v); 검출 파장: 258 nm; 유량: 0.2 mL/min; 기둥 온도: 23 °C; 주입 부피: 5 μL; 상영 시간: 10분.
  13. CHI-SQ-PEG-FA NP 현탁을 재구성하고 7,500 X G 에서 30분간 원심분리합니다. 상정액을 수집하여 0.22 μm 미세다공성 막을 통해 여과합니다. 결과 여과액을 시험용액으로 사용하세요. 지정된 크로마토그래피 조건에서 테스트 용액을 주입하고 분석합니다. 여과물 내 측정된 CHI 농도를 바탕으로 나노입자의 약물 적재 함량을 계산합니다.

3. 시험관 내 약물 방출 연구

  1. 신선하게 준비된 CHI 정액 또는 CHI-SQ-PEG-FA 나노입자 현탁액을 2mL 알리코트를 분자량 3 kDa의 투석량 차단 백에 정확히 피펫 흡입합니다.
  2. 투석 백을 다양한 농도의 췌장(0%, 0.05%, 0.1%, 0.25%)이 포함된 방출액에 담그세요. 정해진 시간 간격(0.1, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72h)에 방출 배지에서 1mL 샘플을 즉시 교체하여 싱크대 상태를 유지합니다.
  3. UPLC 방법(섹션 3에 명시된 크로마토그래피 조건)을 사용하여 모든 샘플의 CHI 농도를 측정하고, 누적 약물 방출량을 계산합니다.
  4. 방출 매체로 pH 4.5의 암모늄 아세테이트 버퍼를 사용하세요. 나노입자 현탁액 2mL를 정확히 투석 백(3 kDa)에 피펫 흡입하세요. 투석 백에 직접 다양한 활성 단위(0, 0.7, 1.4, 2.8 U)의 카텝신 B를 추가하세요. 봉지를 40mL 방출액에 담근 후 37± 0.5 °C, 75rpm의 일정 온도 셰이커에서 배양합니다. 미리 정해진 시점(0.1, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72h)에 1mL 샘플을 추출한 후 즉시 같은 pH의 신선하고 예열된 배지로 교체하여 시스템 평형을 유지합니다.
  5. 채취한 샘플을 0.22 μm 미세다공성 막을 통해 여과합니다. UPLC로 여과액을 분석하여 약물 농도를 결정합니다. CHI의 누적 방출 비율을 계산하고 약물 방출 프로필을 도표로 작성하세요.
  6. CHI 스톡 용액 또는 CHI-SQ-PEG-FA NP 현탁액을 2ML 분량으로 정확히 투석 백(3 kDa MWCO)에 피펫팅하세요. 투석 백을 다양한 농도의 췌장(0%, 0.05%, 0.1%, 0.25%)이 포함된 방출액에 담그세요. 정해진 시점(0.1, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72h)에 1mL 샘플을 추출하여 즉시 신선하고 예열된 방출 배지를 같은 양으로 교체하여 싱크대 상태를 유지합니다.
  7. 샘플 내 약물 농도를 UPLC로 정량화하세요. 누적 약물 방출량을 계산하고 방출 곡선을 생성하세요.
  8. PBS에서의 나노입자 안정성 평가
  9. CHI-SQ-PEG-FA NPs와 PBS(pH 7.4)를 1:20(v/v) 비율로 혼합합니다. 혼합물을 37± 0.5 °C, 100 rpm의 일정 온도 셰이커에서 배양합니다. 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 72, 96시간에서 샘플을 채취하여 유체역학적 직경과 제타 전위를 측정합니다.
  10. MTS 방법에 의한 세포 증식 분석법
  11. PSN-1 췌장암 세포는 완전한 RPMI-1640 배양지에서 배양되었습니다. 로그 성장 단계의 세포는 37°C에서 0.25% 트립신과 함께 분해하여 4-6 x 104 cells/mL 밀도로 완전 배지에 재현탁했습니다. 현탁액은 웰당 100 μL의 96 웰 플레이트에 시딩되고, 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 2시간 동안 사전 배양하여 완전한 세포 접착을 가능하게 했습니다.
  12. 원래의 배양지를 흡인하세요. 대조군(빈 배양지)과 여러 치다마이드 그룹의 농도 구배(0.2, 2, 8, 10, 20, 80 pM)를 설정하고, 그룹당 3개의 복제 웰을 설치합니다. 각 웰에 100 μL 블랭크 또는 약물 함유 배지를 추가한 후, 세포판을 인큐베이터로 옮겨 계속 배양합니다. 실험군에는 다양한 농도(0.2, 2, 8, 10, 20, 80 pM)의 SQ-PEG, 자유 CHI, CHI-SQ-PEG-PEG 또는 CHI-SQ-PEG-FA NP가 포함된 신선 배지 100 μL을 투여하고, 대조군은 동일한 부피의 빈 배지를 투여합니다. 추가 96시간 배양 후, 각 웰에서 약물 함유 배지를 제거합니다.
  13. 각 웰에 20 μL MTS 작업 용액을 추가한 후 4시간 배양합니다. 96웰 플레이트를 15초간 흔들어 균질성을 확인하고, 즉시 마이크로플레이트 리더기를 사용해 490 nm 파장에서 각 웰의 흡광도(A 값)를 측정합니다. 빈 배지군의 OD 값에서 공백 그룹의 OD 값을 빼고, 그 결과 빈 배지 그룹의 OD 값과 빈 그룹 OD 값의 차이로 나누어 100을 곱하여 세포 증식률을 계산합니다.
  14. 시험관 내 공동 배양 종양 구형 모델 구축
  15. 로그 성장기의 PSN-1 세포와 HPSC 세포를 2:7 비율로 혼합하고, 웰당 5,000 셀 밀도의 초저부착 96웰 플레이트에 시딩합니다. 종양 구형 형성 후에는 다양한 나노 제형(쿠마린 6표지 CHI-SQ-PEG/C6 NPs, CHI-SQ-PEG-FA/C6 NPs) 또는 DMSO를 대조군으로 처리하고, 48, 96, 144시간 동안 공동 배양하여 약물 효능을 평가합니다.
  16. 인큐베이션 후에는 각 웰에 같은 양의 세포 생존성 분석 시약을 추가합니다. 플레이트를 궤도 셰이커에 올려 15분간 흔들어 완전히 용해되도록 한 후, 실온에서 어두운 환경에서 30분간 배양합니다.
  17. 세포 용해액을 검은색 96웰 플레이트에 옮깁니다. 다기능 마이크로플레이트 리더기를 사용해 562 nm 파장의 화학발광 신호를 측정하여 세포의 생존력을 정량화합니다.
  18. 나노입자의 세포 흡수 조사
  19. 쿠마린-6(C6)를 형광 프로브로 포함하는 표적 나노입자(CHI-SQ-PEG-FA/C6 NPs)와 비표적 나노입자(CHI-SQ-PEG/C6 NPs)를 준비합니다. PSN-1 세포를 로그 성장 단계에서 24시간 동안 일상적으로 배양하여 단층을 형성합니다. 쿠마린 6을 에탄올에 용해시켜 200 μg/mL 스톡 용액을 만듭니다. 용액 10 μL을 SQ-CHI 및 SQ-PEG-FA(또는 SQ-PEG)와 1:0.7 비율로 혼합한 후, 저어주는 가운데 이온수에 드롭 방향으로 주입합니다. 5분간 저어주고, 증발로 에탄올을 제거한 후 30분간 초음파 처리합니다. 마지막으로 초여과(3 kDa, 12,000 rpm, 20분)를 통해 정제하여 물질을 얻습니다.
  20. 세포를 다음과 같이 처리합니다: 실험군은 유혈청 없는 배지를 받으며, 자유 C6, CHI-SQ-PEG/C6 NPs, 또는 CHI-SQ-PEG-FA/C6 NPs(최종 CHI 농도는 5 μmol/L, C6 농도는 2.6 μmol/L), 대조군은 동일한 부피의 블랭크 배지를 받습니다.
  21. 4시간, 12시간, 24시간 인큐베이팅 후 약물 함유 배지를 흡인합니다. 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)19를 이용한 염색 세포 핵.
  22. 형광 현미경(40배, 여기 파장 Ex=360 nm, 방출 파장 Em=477 nm)으로 관측을 수행하세요. 쿠마린-6의 형광 강도를 측정하여 나노입자의 세포 흡수를 평가합니다.

4. 통계 분석

  1. 이 연구에 제시된 데이터를 얻기 위해 최소 3번의 복제 실험을 수행하십시오. GraphPad 프리즘 소프트웨어를 사용해 통계를 분석하세요. 실험 데이터를 평균 ± 표준오차(SD)로 제시하고, 적절한 경우 학생 t 검정, 일방향 ANOVA, 또는 Wilcoxon 검정을 사용하여 그룹 간 비교를 합니다. 통계적 유의의 임계값을 P < 0.05로 설정하세요.

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Results

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이 연구는 새로운 표적 나노약물 전달 시스템인 Chidamide Squalenylation 프로드럭 기반 자기조립 나노입자(CHI-SQ-PEG-FA NPs)를 성공적으로 설계하고 체계적으로 평가하였습니다. 그림 1). 우리는 CHI-SQ-PEG-FA NPs(그림 2)를 합성하고, 오일-물 상비(그림 3A), 교반 시간(그림 3B), 초음파 조건(그림 3C) 등 다양한 매개변수가 입자 크기와 다분산 지수(PDI)에 미치는 영향을 체계적으로 평가했습니다. 더 나아가, CHI-SQ-PEG NP와 CHI-SQ-PEG-FA NP의 형태학적 특성이 현미경으로 관찰되었습니다(그림 ...

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Discussion

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이 연구는 나노입자 자기 조립을 기반으로 한 저허리 시스템을 구현하는 실질적인 단계별 가이드를 제공합니다. 본 연구에서 얻은 자기조립 나노입자는 규칙적인 구형 형태, 우수한 분산, 균일한 입자 크기, 높은 약물 적재 및 캡슐화 효율을 보였으며, 만족스러운 안정성을 보였다21. 3D 종양 구형 공동 배양 모델(PSN-1/HPSC)을 사용해 나노입자 침투를 평가하였으며, 엽산 변형 CHI-SQ-PEG-FA NPs가 종양 구체의 핵심부에 더 효과적으로 침투할 수 있음을 밝혀냈습니다. 더불어, 종양 구체 내 보존 기간이 유의미하게 길어졌습니다. 이러한 보존 증가는 CHI가 스콸레노일화되어 나노입자로 변한 후 지질친화성이 현저히 증가한 데 기인합니다. 이 나노입자들은 종양 세포 엔도사이토시스와 세포 간 수송을 통해 세포 흡수를 촉진합니다. 따라서 이들은 종양 미세환경의 깊은 침투를 달성합니다22

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 이해 상충이 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 저장성 자연과학재단(LZ23H290001, LY19H280001) 보조금의 지원을 받았습니다; 중국국가자연과학기금(82474338 및 82274364) 보조금; 저장성 3농촌 및 9개 당국 농업과학기술 협력자 프로그램(2025SNJF075); 또한 후저우 과학기술대공의 공공복지 연구 프로젝트(2021GZ261); 또한 저장성 교육부 일반 과학 연구 프로젝트(Y202456442, 2025YKJ10)에도 참여했습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% 트립신-EDTA깁코 (미국)25200072
1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 염산염(EDCI)시그마-올드리치 (미국)E6383
2 mL 냉동 바이알코닝 (미국)430488
96웰 세포 배양 플레이트코닝 (미국)3598
절대 에탄올중국국가제약그룹주식회사(시노팜)100092680
아세톤중국국가제약그룹주식회사(시노팜)32201-2.5L
아세토니트릴테디아 (미국)A998-4HPLC 등급
아세테이트 암모늄중국국가제약그룹주식회사(시노팜)10002861
무수 황산나트륨시그마-올드리치 (미국)31481
생물학적 안전 캐비닛서모 피셔 사이언티픽, 미국1380, 1332, 1356
세포 배양 플라스크코닝 (미국)CLS430372
세포 배양 인큐베이터서모 피셔 사이언티픽, 미국HERA51901126
치다미데(CHI)선전 마이크로코어 바이오테크 유한회사(중국)순도 >95%
Cytation 5 멀티모드 마이크로플레이트 리더바이오텍, 미국CYT5MV
DF-101S 열정 자기 가열 교반기정저우 커추앙 기기 유한회사, 중국
디클로로메탄중국국가제약그룹주식회사(시노팜)80047318
디메틸 설폭사이드(DMSO)시그마-올드리치 (미국)D2650
다이옥산알라딘 (중국)D116156-5ml
DMEM 매체깁코 (미국)12100046
둘벡코의 인산 완충 식염수 (DPBS)깁코 (미국)14040141
에틸 아세테이트중국국가제약그룹주식회사(시노팜)10009460
에틸 에테르중국국가제약그룹주식회사(시노팜)
FA2004B 전자 저울상하이 톈메이 밸런스 인스트루먼트 유한회사, 중국FA2004B
태아 소 혈청(FBS)깁코 (미국)10099141C
엽산-폴리(에틸렌글리콜)-아민 (FA-PEG-NH2)상하이 펑슈 생물공학기술유한회사(중국)PS2-NFA-2000
개미산알라딘 (중국)F112034HPLC 등급
동결 건조기서모 피셔 사이언티픽, 미국
인간 카텝신 B시그마-올드리치 (미국)SRP0289
인간 췌장암 세포주 (PSN-1, CFPAC-1)미국 유형 문화 컬렉션(ATCC)CRL-3211, CRL-1918
인간 췌장 별형 세포 (HPaStec, HPSC)미국 유형 문화 컬렉션(ATCC)
인간 트립신시그마-올드리치 (미국)
염산중국국가제약그룹주식회사(시노팜)CFSR-10011008
역현미경올림푸스, 일본IX83
이스코브의 변형 둘벡코 미디엄 (IMDM)깁코 (미국)12440053
IX 1000 소용돌이 믹서  항저우 루이청 기기 유한회사, 중국1000년 9
메탄올중국국가제약그룹주식회사(시노팜)M433287-10L
메탄올 테디아 (미국)MS1922-001HPLC 등급
마이크로 원심분리기 튜브 (1.5/2.0 mL)액시겐 (미국)MCT-150-C
마이크로피펫(20, 100, 1000 & mu; L)서모 피셔 사이언티픽, 미국4642050, 4642070, 4642090
Mill-Q 정수 시스템  밀리포어, 미국ZR0Q00800
그리고 nbsp; MTS 분석 키트 (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카복시메토시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨)프로메가 (미국)G3582
N,N-디메틸포름아마이드 (DMF)알라딘 (중국)
N-브로모숙신니마이드 (NBS)시그마-올드리치 (미국)B81255
N-하이드록시숙신니마이드 (NHS)시그마-올드리치 (미국)56480
옵티마 맥스 초원심분리기 벡맨, 미국393490
페니실린/스트렙토마이신 용액깁코 (미국)15140-122
주기산시그마-올드리치 (미국)P7875
석유 에테르중국국가제약그룹주식회사(시노팜)
페나진 메토황산(PMS)시그마-올드리치 (미국)3180806
인산염 완충 식염수(PBS)깁코 (미국)70011069
폴리(에틸렌 글리콜)-아민 (PEG-NH<서브>2)상하이 펑슈 생물공학기술유한회사(중국)PG2-AM-20k
RPMI-1640 미디엄깁코 (미국)31800022
실리카겔 파우더시그마-올드리치 (미국)53698300 메시
중탄산나트륨시그마-올드리치 (미국)401676
염화나트륨중국국가제약그룹주식회사(시노팜)10019318
이크롬산나트륨 이수화물시그마-올드리치 (미국)1.93689
스콸렌시그마-올드리치 (미국)Y0002131
멸균 원심분리기 튜브 (15 및 50 mL)코닝 (미국)430791, 430828
황산중국국가제약그룹주식회사(시노팜)10021618
테트라하이드로푸란중국국가제약그룹주식회사(시노팜)34865-4X4L분석 등급
초여과 원심관 (분자량 한계: 3.5 kDa)벡맨, 미국344088

References

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