방법 논문

내재 대비를 이용한 DNA 분광학적 초해상도 영상

DOI:

10.3791/69917

⸱

2026년 3월 6일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 2Center for Physical Genomics and Engineering, Northwestern University, 3Department of Gastroenterology and Hepatology, Northwestern Memorial Hospital

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 DNA 고유 형광 스펙트럼의 샘플 준비, 데이터 수집 및 분석에 대한 상세한 작업을 제공합니다.

초록

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초해상도 영상은 나노 스케일에서 구조적 세부사항을 밝혀내며 생물학 연구에 혁신을 가져왔습니다. 대부분의 광학 초해상도 방법은 생체분자의 형광 표지에 의존하는데, 이는 분자 종의 특정 태깅을 가능하게 하지만 세포 기능을 교란시키고, 링커 분자의 부정확성을 유발하며, 개별 DNA 분자 규모에서 크로마틴 이미징에 필요한 일관된 높은 표지 밀도를 제공하지 못할 수 있습니다. 나노미터 해상도로 레이블 없는 현장 유전체 영상을 가능하게 하는 기술은 생물학에 깊은 영향을 미칠 것입니다. 여기서는 DNA의 고유한 형광을 활용하여 분광 단일 분자 위치 현미경(sSMLM)을 수행하는 프로토콜을 제시합니다. 프로토콜은 샘플 준비, 데이터 수집, 스펙트럼 분석을 상세히 설명합니다. 간단히 말해, 폴리뉴클레오타이드 용액을 유리 위에 증착하고 몇 시간 동안 건조시켜 얇은 DNA 젤을 만듭니다. 겔 형성 후, 샘플은 이미징 버퍼가 있는 상태에서 sSMLM 사용으로 이미징됩니다. 기록된 데이터셋은 공간적 위치 정보를 제공하는 0차 이미지와 각 위치 정의의 방출 스펙트럼을 인코딩하는 1차 이미지로 구성되어 있습니다. 공간 재구성은 0차 데이터로부터 생성되며, 이후 1차 신호에서 해당 스펙트럼을 추출합니다. 마지막으로, 다양한 길이, 서열, 조성을 가진 여러 여기 파장과 DNA 분자를 사용하여 이 접근법의 실현 가능성을 입증합니다.

서론

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구조화 조명 현미경(SIM), 유도 방출 소모현미경(STED), 광활성화 위치 현미경(PALM), 확률적 광학 재구성 현미경(STORM) 등 단일 분자 위치 현미경(SMLM) 접근법을 포함한 초해상도 형광 현미경 기법은 광학 현미경의 해상도를 회절 한계 1,2,3,4를 훨씬 넘어섰습니다.5,6,7은 염색질의 나노 규모 배열에 전례 없는 접근을 가능하게 했습니다. 8,9,10,11,12. 그러나 현재 염색 방법은 DNA 자체보다는 DNA 관련 단백질을 표지하거나, 소분자 염료를 사용하여 천연 염색질 구성을 교란하고 세포 생존력을 저해하는 경우가 많습니다13,14. 이러한 한계 때문에, 네이티브하고 섭동 없는 조건에서 라벨이 없는 광학 초해상도 이미징 기법의 개발이 매우 바람직합니다. 여기서 제시된 프로토콜은 고유 형광이 신뢰성 있게 검출될 수 있는 합성 정제된 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 뉴클레오타이드를 대상으로 합니다; 고정세포나 생세포에서 핵 DNA 분자 이미징에 최적화되어 있지 않습니다.

핵산은 매우 낮은 양자 수율(자외선 여기 시 약 10⁻⁻ 정도)과 상온에서 초고속 형광 붕괴로 인해 오랫동안 비형광성으로 간주되어 왔기 때문에, 펨토초 분광법이 개발되기 전까지 DNA의 내재 형광(주로 형광 수명)에 대한 연구는 드물었습니다. 뉴클레오타이드는 자외선 조명 아래에서 형광을 약하게 발하는 반면, 가시광선 영역에서의 흡수는 훨씬 약하다는 점이 잘 알려져 있습니다. 그럼에도 불구하고, 최근 생리학적으로 중요한 농도에서 변형되지 않은 핵산의 가시광선 여기 형광이 존재한다는 것이 관찰되었다. 이 현상은 대부분의 뉴클레오타이드 광화학 연구가 희석된 용액(10-100 μM)에서 수행되었기 때문에 간과되었을 가능성이 크다. 반면 핵과 염색체에서는 DNA 농도가 0.1-1 M 21,22,23에 이를 수 있다. 더 중요한 것은, 가시광선 조명 하에서 확률적 형광 전환이 관찰되어16번, 변질되지 않은 핵산을 위치 기반 초해상도 현미경의 내인성 조영제로 사용할 수 있는 기반을 마련했다는 점입니다.

가시광선 여기 하에서 생리학적 농도에서 단순 서열을 가진 뉴클레오타이드 단량체 및 단일 가닥 DNA 분자의 광화학적 특성이 탐구되었습니다24. 또한 이러한 DNA 분자들이 확률적 형광 전환 특성을 가진다는 점이 입증되었으며, 이는 다양한 고갈 조건에서 뉴클레오타이드의 형광 회수를 조사함으로써 바닥 상태 고갈(GSD)6,7 이론과 잘 부합합니다. 더불어, 뉴클레오타이드는 상대적으로 높은 양자 수율과 낮은 계간 교차 확률을 보이기 때문에, 단일 분자 방출 이벤트의 광자 수와 깜빡임 지속 시간은 STORM의 인기 있는 외유성 염료(예: Alexa Fluor 647)와 비슷하며, 뚜렷한 스펙트럼을 보이며 DNA는 고해상도 영상에 이상적인 내재 조영제가 됩니다. 또한, 앞서 설명한 스펙트럼 회귀 알고리즘을 구현하면 폴리뉴클레오타이드와 선형 단가릿줄 DNA 섬유의 10나노미터 이하 초해상도 이미징이 가능하다27.

DNA 내재 형광의 전체 스펙트럼을 포착하기 위해, 우리는 스펙트럼 검출을 위해 듀얼 웨지 프리즘(DWP)을 사용하여 최소한의 투과 손실과 파면 오차 28,29,30을 동반한 고처리량 단일 분자 분광 분석 및 이미징을 가능하게 했으며, 자동 데이터 처리를 위한 오픈 소스 분광 SMLM 분석 소프트웨어(RainbowSTORM)를 사용했습니다31,32. 이 역량을 바탕으로 분광 검출과 전용 스펙트럼 분석 파이프라인을 통합한 다중 레이저 SMLM 플랫폼을 개발했습니다. 여기서 제시하는 프로토콜은 샘플 준비, 데이터 수집 및 분석을 포함하며, 단일 분자 위치 현미경에서 DNA 고유 형광을 활용할 수 있는 재현 가능한 워크플로우를 제공합니다. 내재 대조를 가진 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 및 이중 가닥 DNA 분자 이징에 대한 개념 증명 연구를 가능하게 한 것 외에도, 이 접근법은 DNA 내재 형광과 계산 방법을 결합한 염기열 예측과 같은 천연 라벨 없는 조건에서 DNA 이미징에 대한 광범위한 응용의 기반을 마련했습니다.

프로토콜

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1. DNA 겔 샘플 준비 (그림 1A)

  1. DNA 샘플(올리고뉴클레오타이드 또는 이중 가닥 DNA 중 하나)을 뉴클레아제가 없는 탈이온수에 최종 농도인 100 mM까지 용해한 후 -4 °C에서 저장합니다.
  2. 반복되는 동결-해동 사이클을 최소화하기 위해 5 μL 알리코트를 준비하세요. 냉동 알리코트를 사용할 경우, 부피에 따라 실온에서 5-15분 동안 해동하세요.
  3. 유리 슬라이드를 실험실 닦기로 부드럽게 닦아주세요. 100 mM DNA 분자 용액 5 μL을 피펫 세척한 유리 슬라이드에 담아 1-3시간 증발시키며 DNA 겔을 형성합니다.
  4. 안전을 위해 이 단계를 연기함 후드에서 조작하세요. 재료표에 따라 영상 버퍼를 준비하세요. β-머캅토에탄올 버퍼와 DABCO 버퍼 모두 DNA 분자의 확률적 광 스위칭을 지원하도록 검증되었습니다.
  5. 안전을 위해 이 단계를 연기함 후드에서 조작하세요. 영상 겔에 5μL의 영상 완충제를 추가하고, 영상 촬영 직전에 커버슬립을 위에 올려놓습니다. 덮개가 있는 샘플 안에 기포가 있을 수 있습니다. 핀셋을 사용해 덮개를 덮은 샘플 안의 기포를 제거하세요,

2. sSMLM 시스템 보정 및 데이터 수집 (그림 1B)

  1. 다음 분광 SMLM 시스템33의 보정을 위해 구멍 직경 100 nm, 간격 4 μm, 8행 x 5열 배열로 구성된 제작된 나노홀 배열을 준비합니다.
    참고: 또는 미국 공군(USAF)의 1951년 해상도 차트(R3L1S4N)를 스펙트럼 보정33에도 사용할 수 있습니다.
    1. 순차적인 금속 스퍼터링과 집계 이온 빔(FIB) 밀링을 통해 나노홀 배열을 생성합니다. 먼저, 20 표준 세제곱센티미터/분(SCCM) 아르곤 흐름과 3 mTorr 속도의 DC 스퍼터링을 이용해 22 x 22 mm 붕규산 유리 커버슬립 위에 두께 150nm 알루미늄 필름을 증착합니다.
    2. 30 kV 가속 전압으로 작동하는 FIB 밀링을 사용해 알루미늄 층에 5 x 8 나노홀 배열을 패턴화합니다.
  2. 분광 SMLM 시스템(그림 2)을 켜고, 카메라 바로 앞에 좁은 대역폭 필터(532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm, 750 nm)를 삽입한 뒤, 백색광원(예: 현미경 램프)을 사용해 보정 시료를 밝히세요.
  3. 각 필터마다 10프레임씩 모으세요. 램프의 낮은 강도와 카메라 근적외선 영역의 효율 때문에 532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm 노출 시간을 200 ms, 750 nm 2000 ms로 설정하세요(그림 3).
  4. DNA 겔 샘플을 현미경에 넣고, 커버슬립 면이 대물렌즈를 향하도록 한 뒤 카메라 소프트웨어를 열어 데이터 수집을 시작하세요.
  5. 자동 초점 추적 시스템의 도움을 받아 적절한 z 위치를 식별하여 명확한 확률적 깜빡임이 보이도록 하세요. 이 단계는 매우 중요하며, DNA 겔 샘플은 세포 구조와 같은 명확한 형태학적 단서가 없어 적절한 신호를 찾기 어렵기 때문에 인내심이 필요합니다.
  6. 대물렌즈가 커버슬립 가장자리에 닿지 않도록 주의하세요. 이로 인해 버퍼가 침지 오일로 누출되어 트래킹에 방해가 될 수 있습니다.
  7. 10,000-30,000장의 프레임을 5 kW/cm²의 일반적인 조명 출력과 30 ms 노출 시간을 확보하세요. 필요에 따라 프레임 수, 조명 출력, 노출 시간을 조정하세요. 인수 후에는 소프트웨어가 기본적으로 데이터를 nd2 형식으로 저장합니다.
  8. 실험을 마친 후, 유리 슬라이드는 승인된 샤프 폐기물 용기(예: 깨진 유리나 샤프스 폐기통)에 폐기하고, 남은 모든 완충제는 기관 안전 지침에 따라 지정된 화학 액체 폐기물 용기에 버립니다.

3. 보정 및 분광 데이터 분석(그림 1C)

  1. Bio-Formats 플러그인을 사용하여 획득한 DNA 샘플의 원시 이미지 스택을 FIJI(Windows 64비트)에 불러옵니다.
  2. 스택에서 최소 투영을 빼면 배경 차감 데이터셋을 얻고 스펙트럼 분석을 위해 저장합니다. 로드된 원본 이미지 스택을 위해 Z 프로젝트> Image > Stacks 를 선택하고 Projection 유형에서 Min intensity 를 선택하세요. 그 다음 Process > Image 계산 기를 선택해 원본 이미지 스택에서 최소 투영량을 빼고 TIFF로 저장하세요.
  3. ThunderSTORM 플러그인(버전 1.3)을 사용하여 0차 원본 이미지 스택에서 로컬라이제이션 식별을 수행합니다. 적절한 매개변수(예: 임계값 = 1.2 x std(파동-F1), 시그마 = 1.5, 적합 반경 = 3)를 사용하여 0차 이미지를 재구성하고 방출 이벤트 좌표(단위: nm)를 추출합니다. 크롭된 제로차 원본 이미지 스택을 위해 ThunderSTORM > Plugin을 선택> 실행 분석.
  4. FIJI와 오픈소스 소프트웨어 RainbowSTORM(GitHub 링크32, MATLAB 버전은 2020b 이후 버전)을 사용하여 수평 및 수직 이동과파장 31,32 간의 관계를 얻기 위해 보정 데이터를 처리하세요.
    1. ThunderSTORM 플러그인을 사용하여 5개 파장의 보정 이미지에 대해 위치 식별을 수행합니다. 적절한 매개변수(예: 임계값 = 5 x 표준 (Wave.F1), 시그마 = 1.5, 핏 반경 = 3)를 사용하여 0차 나노홀의 위치와 1차 스펙트럼 위치를 재구성합니다.
    2. 임계값을 조정하세요(예: 5-10 x std 범위(Wave.F1)) 각 보정 이미지마다 80개의 로컬라이제이션이 나올 때까지 조정합니다.
    3. RainbowSTORM을 실행하고 스 펙트럼 보정 > 탐색 후 이전 단계에서 보정된 각 파장(532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm, 750 nm)의 CSV 파일을 불러오세요. 보 정 파일 저장을 클릭하세요.
  5. 나노미터 기반 좌표를 픽셀 좌표로 변환하고, 보정(그림 4)에서 0차수로의 수평 및 수직 이동을 바탕으로 해당 스펙트럼 창에 매핑하여 DNA 고유 형광의 전체 스펙트럼을 측정합니다.
    1. 다음 단계로 맞춤형 Python 스크립트34 (버전 3.11.7)를 사용하여 전체 스펙트럼 데이터를 추출하세요.
    2. 3.2단계에서 배경을 뺀 이미지 스택(.tiff), 3.3단계에서 생성된 로컬라이제이션 CSV 파일(.csv), 3.4단계에서 보정 파일(.mat)을 올바르게 설정하세요.
    3. 3D DWP로 획득한 488 nm 데이터의 수평 이동으로 900-950 픽셀을 사용하며, 이는 500-550 nm 필터 범위보다 약간 넓은 스펙트럼 창 484-588 nm에 해당합니다.
    4. 3D DWP로 획득한 532 nm 데이터의 수평 이동으로 925-984 픽셀을 사용하며, 이는 525-750 nm 스펙트럼 창에 해당하며, 역시 590-650 nm 필터 범위보다 넓게 선택되었습니다.
    5. 3D DWP에서 488 nm와 532 nm 데이터 모두에 대해 23 픽셀을 수직 이동으로 사용하세요.
      위 값들은 RainbowSTORM을 사용해 얻은 스펙트럼 보정 곡선에서 도출되었습니다. 전체 스펙트럼 측정을 위한 Python 스크립트는34에 있습니다.
  6. 3차 다항식 적합을 사용하여 비선형 스펙트럼을 선형화하여 후속 분석(비교, 분류 등)합니다(그림 3).

결과

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DNA 젤 형성에 1시간이 걸린다고 가정할 때, 샘플 준비부터 데이터 수집 및 분석까지 전체 과정은 약 120분이 소요됩니다(그림 1). 해동, 겔 형성, 스펙트럼 보정에 걸리는 합산 시간은 실험 내 이미지나 샘플 수와 관계없이 약 90분으로 고정되어 있습니다. 효율성을 극대화하기 위해 단일 세션에서 여러 샘플에 걸쳐 여러 이미지 스택을 수집하는 것을 권장합니다.

DWP 이후 얻은 대표적인 실시간 이미지는 그림 1B 와 그림 3A에 나타나며, 형광 신호는 0차(왼쪽, 공간 정보 포함)와 1차 1차(오른쪽, 스펙트럼 정보 포함)로 나뉩니다. 그림 1B에서는 0차 이미지와 1차 이미지 간 간격이 비교적 작은 2D DWP 구성을 사용하여 이미지가 획득되었습니다. 반면, 그림 3A 는 3D DWP를 사용해 수집된 데이터를 보여주는데, 복엽 3D 이미징에 필요한 설계된 광학 경로 차이로 인해 두 회절 차수가 더 넓게 분리되어 있습니다. 그림 1C, 그림 3, 그림 4 에 제시된 모든 데이터는 3D DWP 구성을 통해 수집되었습니다. 2D 영상과 3D 영상 중 선택은 실험 목적에 따라 달라집니다: 합성된 DNA 샘플의 내재 형광 스펙트럼 측정에는 2D DWP가 일반적으로 선호되는데, 이는 관련 3차원 구조적 특징이 부족하기 때문입니다. 다만 축 방향 정보가 필요할 때는 3D DWP 구성도 사용할 수 있습니다.

이 대표적인 결과들은 DWP 기반 영상 플랫폼이 개별 DNA 분자의 공간 위치 및 방출 스펙트럼을 실시간으로 동시에 해석할 수 있는 핵심 능력을 보여줍니다. 적절한 시스템 성능은 0차 공간 이미지와 1차 스펙트럼 분산 이미지 간의 명확하고 안정적인 분리로 표시되며, 0차 내 각 단일 분자 위치는 1차 내 뚜렷한 스펙트럼 추적에 해당합니다. 정량적 스펙트럼 분석은 0차 이미지 내에서 고립된 단일 분자 사건을 식별하고, 관련 1차 신호의 상대 픽셀 이동을 측정한 뒤, 보정된 매핑 함수를 사용해 이 이동을 파장으로 변환하는 방식으로 수행됩니다. 픽셀 변위와 방출 파장 간의 관계가 비선형이기 때문에, 원시 데이터로부터 선형 방출 스펙트럼을 정확히 재구성하기 위해 3차 다항식 적합이 적용됩니다. 생성된 단일 분자 스펙트럼은 머신러닝 또는 딥러닝 모델을 포함한 계산 분석 파이프라인에 추가로 통합되어, 다양한 조명 조건과 광물리 상태에서 내재적 형광 신호를 기반으로 DNA 서열 또는 분자 구조의 스펙트럼 분류와 추론을 가능하게 합니다.

이 프로토콜에서 제시된 모든 데이터는 β-머캅토에탄올 기반 영상 버퍼35를 사용하여 수집되었습니다. 원칙적으로, 형광체 광 전환 동작을 강화하는 모든 영상 버퍼는 이 접근법과 호환되어야 하며, 예: DABCO 기반 영상 버퍼36. 테스트된 DNA 분자에는 20염기의 단일가닥 A, G, C, T; 40베이스 단일 가닥 AC 체인(A1C1,A 5C5, A10C10, A20C20); 단가닥 5, 8, 12, 16기저 과닌; 20염기쌍 이중 가닥 GC 및 AT(자세한 내용은 재료표 참조). 20염기와 40염기의 DNA 구성체를 선정하는 것은 40염기로 된 DNA 사슬이 40 x 3.4 = 13.6 nm 미만의 유효 크기를 가진 컴팩트 구조를 채택하여 재구성된 SMLM 이미지의 해상도 한계 이하임을 관찰한 데 근거합니다. 여기 파장(488 nm과 532 nm)은 특정 서열에 대해 독점적으로 최적화된 것이 아니라, 고유한 DNA 형광이 서로 다른 염기 조성과 구조 상태에서 어느 파장이든 견고하게 검출될 수 있음을 입증하기 위해 선택되었습니다. 보충 그림 1 에 표시된 영상 버퍼를 테스트했으나 거의 확률적 깜빡임 신호가 감지되지 않아 버퍼 성분과 유리 표면 처리는 배제되었습니다. DNA 겔 + 영상 버퍼만이 상당한 수의 깜빡임을 보였습니다. 유리 슬라이드와 커버슬립은 깨끗하고 신중하게 다뤄졌으며, 샘플 젤은 밀폐된 환경에서 형성되었습니다. 따라서 검출된 신호는 불순물이나 기질 자가형광에서 나올 가능성이 낮습니다. 또한 건조 젤과 DNA 용액 신호도 측정했으나 유의미한 차이가 없어 건조 중 광화학 인공물이 신호의 주된 원인이 아닙니다. 광분해 생성물은 보통 넓은 스펙트럼을 보이며 깜빡임 특성이 없는데, 이는 우리 연구에서 관찰된 바 없습니다. 정량적 검출 한계는 국소화의 최소 광자 수로 반영되어 30 - 50 [광자 수]이다. 이 값은 고정 세포에서 AF647 표지된 H3K9me3와 같은 DNA 샘플과 표지 시스템에서도 동일하게 유지됩니다. DNA 고유 형광의 평균 위치 정밀도는 약 15 - 25 nm인 반면, AF647은 약 10 - 15 nm입니다.

2D 시나리오에서 재구성된 SMLM 이미지의 픽셀 크기는 22nm입니다. 확률 방출의 국소화 정밀도는 평균 ~20 nm로, 단일 분자가 국소화되는 신뢰 구간을 설명합니다. 그러나 내재 형광을 검사하는 샘플은 생물학적 구조를 갖지 않아 구조의 해상도를 해석할 수 없습니다. 코히어런트 라만 산란 현미경의 해상도는 250 - 300 nm37로 보고되며, 자외선 2광자 해상도는 300 nm38입니다. 일관된 라만 산란 영상의 신호 대 잡음비는 10 - 10039 크기인 반면, UV 2광자 현미경40,41에서는 2 - 20(보통 신호 대 양 표준편차, SSDR로 표현)입니다. sSMLM 사용으로 DNA 내재 형광의 SNR은 광자 수가 적고 카메라 검출 노이즈에 의한 한계로 약 5입니다.

figure-results-1
그림 1: 예상 소요 시간이 포함된 워크플로우. (A) 샘플 준비는 스톡을 해동하고, DNA 겔을 준비하며, 영상 버퍼를 추가하는 과정을 포함합니다. 총 소요 시간은 샘플과 환경에 따라 1시간에서 3시간 사이로 달라집니다. (B) 각 획득은 특별히 설계된 나노홀 배열 샘플을 이용한 보정 과정을 필요로 합니다. 총 보정 시간은 약 20분이며, 한 이미지 스택의 데이터 수집 시간은 샘플 탐색을 포함해 약 10분(10,000프레임, 노출 시간 50ms)입니다. (C) 분석 파이프라인은 파이썬에서 FIJI 전처리와 스펙트럼 분석을 포함합니다. 피지의 전처리는 약 10분 정도 소요되며, 확립된 코드로 스펙트럼 분석은 빠릅니다. 제시된 스펙트럼은 16염기 구아닌에서 수집되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 2: 광학 회로도. 네 개의 레이저 라인(405 nm, 488 nm, 532 nm, 647 nm)은 레이저 정렬을 통해 역현미경으로 전달되어 시스템이 안정적이고 조작이 용이합니다. DWP는 sCMOS 카메라 바로 앞에 위치하여 분광 단일 분자 검출을 가능하게 합니다. DWP 보정 시 카메라와 DWP 사이에 필터 휠이 삽입됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 3: 스펙트럼 보정. 사용되는 보정 파장은 532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm, 750 nm입니다. DWP 이후, 카메라 앞에 이 중심 파장을 가진 좁은 대역폭 필터를 순차적으로 배치함으로써, 서로 다른 파장의 수평 및 수직 이동을 측정하여 픽셀 위치와 파장 간의 보정 곡선을 매핑할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 4: 각각 532nm와 488nm 여기 하에 있는 선택된 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA 분자의 스펙트럼. (A - B) GC_alter의 비선형 및 선형 스펙트럼으로, 두 가닥 모두 20-염기 5'-GCGCGCGCGGCGGCGC-3'로 분류됩니다. 강조된 녹색 스펙트럼은 평균 곡선을 나타냅니다. (C - D) A10C10의 비선형 및 선형 스펙트럼은 40염기 길이와 반복되는 10 아데닌과 10 시토신(5'- AAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCAAAAAAAAACCCCCCCCC-3')을 가진 단일 가닥 DNA 분자의 일종을 의미합니다. 강조된 파란색 스펙트럼은 평균 곡선을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 1: 내재 DNA 형광에 대한 대조 실험. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서는 샘플 준비부터 데이터 수집 및 계산 분석까지 워크플로우를 포함해, 단일 가닥과 이중 가닥 DNA 분자 모두에서 DNA 내재 형광의 전체 스펙트럼을 포착하는 프로토콜을 처음으로 제시합니다. 이 프로토콜은 외부 프로브 대신 내재 형광을 활용하여 DNA 분자의 라벨 없는 초해상도 이미징을 가능하게 합니다. 원칙적으로 이 접근법은 화학 표지와 항체 기반 증폭을 피하기 때문에 고정 세포 및 잠재적 생세포 영상 촬영에도 확장될 수 있습니다. 핵 내부의 염색질은 DNA, RNA, 그리고 다양한 단백질을 포함하는데, 이는 DNA 겔보다 훨씬 복잡한 시스템입니다. 현재 DNA 분자의 광자 수가 적어 고정/생체 세포에서 핵 내에서 확률적 방출이 어렵습니다. 하지만 분리된 염색체, 즉 핵에 대해서는 DNA 고유 형광 신호가16, 24, 27로 보고되었습니다. 하지만 현재 형태에서는 합성된 DNA 샘플을 사용하는 시험관 내 환경에만 제한되어 있습니다. 비교하자면, 면역염색을 이용한 핵 DNA 또는 염색질의 표지는 일반적으로 소환, 차단, 1차 및 2차 항체 배양 등 긴 다단계 절차를 거쳐 수시간(표적당 ~5시간)에 걸릴 수 있으며, 이는 실험적 복잡성과 자연 염색질 구조에 잠재적 교란을 초래합니다. 외부 표지를 제거함으로써, 내재적 형광 기반 이미징은 샘플 준비 시간을 크게 단축할 뿐만 아니라, 부피가 큰 형광 탐침과 항체와 관련된 구조적 교란과 연결 오류를 피하여 DNA의 나노스케일 위치 추적을 더욱 충실하게 할 수 있게 합니다.

라벨이 없고 개념적으로 단순함에도 불구하고, 이 프로토콜의 성공적인 구현은 여러 중요한 실험적 세부 사항에 세심한 주의를 기울여야 합니다. 예를 들어, 샘플 준비 과정에서 DNA 겔 형성에 충분한 시간이 부족하면 완전히 형성된 겔에 비해 검출 가능한 단일 분자 위치 수가 줄어듭니다. 보통 젤이 형성되는 데 약 1.5시간이 걸립니다. 용액이 완전히 마르지 않았다면 조금 더 기다리세요. 22 x 22 mm 커버슬립의 경우 5 μL의 영상 버퍼가 충분하지만, 버퍼 부피가 많으면 누출이 발생하여 대물렌즈의 오일-침지 경계가 손상되고 영상 성능에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다. 누출이 발생하면 실험실 물티슈로 조심스럽게 제거할 수 있습니다. 초점을 맞추면서 점차 가장 낮은 z 위치에서 대물렌즈를 올려 보세요. 대물렌즈가 침지 오일에 맞닿은 후, 미세 조정 모드를 사용해 빈번한 확률적 단일 분자 방출 사건이 있는 초점면을 식별합니다. 큰 겔 클러스터가 1차 스펙트럼이 겹치는 집계 신호를 생성한다면, 대체 영상 영역을 선택하세요.

장점에도 불구하고, 이 프로토콜은 적용 가능성과 성능을 평가할 때 고려해야 할 몇 가지 중요한 한계가 있습니다. 첫째, 정확한 스펙트럼 추출은 개별 단일 분자 사건들 간의 충분한 공간적 분리에 의존합니다; 큰 DNA 겔 클러스터나 밀집된 고분자 집합체에서 발생하는 높은 위치 밀도는 1차 스펙트럼 트레이스가 겹치게 되어 신뢰할 수 있는 스펙트럼 재구성을 복잡하게 하거나 배제할 수 있습니다. 둘째, 이 방법은 광학 정렬과 초점 안정성에 민감한데, 이중 쐐기 프리즘의 작은 오차나 최적의 초점면에서의 편차가 파장 보정에 체계적인 오차를 유발하고 신호 대 잡음비를 감소시킬 수 있기 때문입니다. 셋째, 프로토콜은 현재 스펙트럼 혼합을 구현하지 않아 분자 밀도가 높거나 여러 스펙트럼이 겹치는 종을 가진 샘플에서 사용이 제한됩니다. 이러한 요소들은 이 방법의 실용적 작동 체계를 정의하며, 프로토콜을 더 복잡하거나 복잡한 생물학적 시스템으로 확장할 때 신중히 고려해야 합니다.

이 프로토콜에서 RainbowSTORM은 스펙트럼 보정에만 사용되지만, 소프트웨어는 2D/3D 보정, sSMLM 데이터 분석, 이미지 재구성을 위한 강력한 도구도 제공합니다. 이러한 분석 도구는 분광 초해상도 영상에서 공간 위치 정보를 스펙트럼 판독과 연결하는 데 매우 적합하며, 향후 이 프로토콜의 확장 과정에서 더욱 활용될 수 있습니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 RNA, 튜불린 등 다른 생물학적 고분자 유형인43, 44, 45에도 잠재적으로 실현 가능하다. 검출된 스펙트럼은 딥러닝 모델46과 같은 계산 모델에 추가로 입력되어 분류를 수행하며, 다양한 조명 및 광물리학적 특성 하에서 내재 스펙트럼으로부터 서열 또는 분자 구조를 예측할 수 있습니다. 이 연구는 외부 표지나 자연 구조의 변성화를 피하는 라벨 없는 분자 특이적 크로마틴 이미징의 길을 열었습니다.

공개 사항

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저자들은 서로 상충하는 이해관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 국립보건원(NIH)의 R02CA225002, U54CA261694, R01CA289294, U54CA268084와 미국 국립과학재단(NSF)의 CBET-2430743 보조금의 지원을 받았습니다. 분광 SMLM 시스템의 핵심 요소로서 듀얼 쐐기 프리즘 장치를 제공한 노스웨스턴 대학교 하오 F. 장 교수 연구실에 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
영상용 488 nm 방출 필터크로마 테크놀로지 코퍼레이션ET525/50M
보정을 위한 532 nm 밴드패스 필터토를랩FL532-3
영상용 532 nm 방출 필터크로마 테크놀로지 코퍼레이션ET620/60M
보정을 위한 580 nm 밴드패스 필터토를랩FB580-10
보정을 위한 633 nm 밴드패스 필터토를랩FL632.8-3
보정을 위한 680 nm 밴드패스 필터토를랩FB680-10
보정을 위한 750 nm 밴드패스 필터토를랩FB750-10
베타-머캅토에탄올 시그마M6250
BME 영상 버퍼NANA7 & mu; L GLOX, 7 & mu; L 베타-머캅토에탄올과 690 & μ; L 포도당 완충
소 간에서 나온 카탈라제시그마C100
DABCO (1,4-di-azobicyclo-(2.2.2.)-옥테인)시그마D27802
DABCO 영상 버퍼NANA65 mM DABCO+30 mM 아황산나트륨 + 30 mM DTT 1 M  DNAse에서는 RNAse 자유 탈이온수에 포함됩니다. 황산나트륨은 PBS에 10번 이상 용해되어야 합니다; 이미징 버퍼를 만들기 전에 1 M로 변환했습니다.
분광 SMLM 용 DNA 디플렉스IDTNA20염기쌍 이중 가닥 GC_alter, GC_conti, AT_alter, AT_conti.
예: GC_alter 두 가닥 모두 5'로 가집니다 - GCGCCGCGGGGGGGCGCG - 3'; GC_conti 5피트 가닥 한 가닥이 있습니다 - 구그그그 다른 하나는 5피트 길이입니다 - CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC - 3'
모든 샘플은 HPLC 표준으로 사용되었습니다.
DNA 올리고뉴클레오타이드/이중 가닥 DNAIDTNA
분광 SMLM 용 DNA 올리고IDTNA20 베이스 A, G, C, T; 40베이스 단일 가닥 AC 체인(A1C1, A5C5, A10C10, A20C20); 그리고 nbsp; 단일 가닥 5-, 8-, 12-, 16-염기형 구아닌.
예: A10C10은
5'- AAAAAAAAACCCC
CCCCCAAAAAAAAAAA
AACCCCCCCC - 3'
모든 샘플은 HPLC 표준입니다.
DNase/RNase 프리 증류수인비트로젠10977015
DTT (DL-디티오트라이트올)시그마43816
글록스NANA14 mg 포도당 산화효소, 50 및 μ; L 카탈라아제(17 mg/ml) + 200 & mu; L 버퍼 A는 10 mM Tris(pH 8.0), 50 mM NaCl. 
포도당 완충NANA50 mM 트리스(pH 8.0), 50 mM NaCl, 10% 포도당.
포도당 산화효소시그마G7141
포도당, 가루써모피셔15023021
PBS (10X)써모피셔J62036. K3
PBS (1X)깁코10010023
염화나트륨써모피셔424290010
아황산나트륨과 nbsp;시그마S0505
트리스 (1M) pH 8.0인비트로젠AM9856

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