폴리디메틸실록산(PDMS) 칩 장치의 막을 위한 방수 실리콘 기반 밀봉을 위한 새로운 밀봉 프로토콜. 실험실, 칩 모델 설정 및 소규모 칩 플랫폼 개발을 위한 것입니다. 우리는 플라스틱 및 천연 조직 막을 사용하여 프로토콜을 시연합니다. 이 절차는 PDMS, 톨루엔, 몰드, 멤브레인, 진공 챔버만 필요합니다.
이 논문에서
요약
초록
Organ-on-Chip 플랫폼은 생의학 연구에서 빠르게 성장하는 분야입니다. 이 분야의 확장은 다양한 재료와 제작 및 적용 방법론을 만들어냈습니다. 상업적으로 제공되거나 학계에서 개발된 다양한 기기의 수가 계속 증가하고 있지만, Organ-on-Chip 분야에 진입하는 신규 연구자들에게는 여전히 큰 진전이 남아 있습니다. 새로운 칩 기술과 현재 진행 중인 칩 기술에서 핵심 문제 중 하나는 칩 장치의 안전하고 누수 없는 밀봉을 만드는 것입니다. 이 글에서는 실리콘 칩과 서로 다른 재료의 세 가지 배양막 사이에 신뢰할 수 있는 방수 연결을 제공하는 칩 밀봉 워크플로우를 제시함으로써 칩 개발의 새로운 길을 제시합니다. 제시된 절차는 제한된 입력 재료로 신규 칩 개발에 접근하기 쉽고, 공기-액체 인터페이스(ALI) 오르간-온-칩을 제공합니다. 이 칩들은 다공성 막을 통해 세포 배양을 통해 끝부분이 공기에 노출되도록 설계되었으며, 예를 들어 장, 피부, 또는 여기서 제시된 것처럼 Airway-on-Chip 같은 경우에 사용됩니다. 우리는 두 가지 서로 다른 칩 몰드 3D 설계를 제공하며, 시중에 시행되는 플라스틱 막과 돼지 세포외기질(ECM) 스캐폴드에 결합하는 모습을 보여줍니다. 이 Airway-on-Chip은 자체 제작이 가능하며; 여기서 마주칠 수 있는 다양한 장애물과 Airway-on-Chip으로서의 이전 사용 사례를 소개합니다. 이 새로운 밀봉 절차는 톨루엔으로 희석된 폴리디메틸실록산(PDMS) 모르타르를 진공하여 톨루엔을 제거하고, 이는 다공성 플라스틱 또는 천연 ECM 막 표면에 얇고 강한 실리콘 코팅을 만드는 것입니다. 이 절차의 두 번째 신기술은 PDMS 모르타르를 실온에서 경화하여 밀봉하는 재료 간의 열팽창 차이로 인한 막의 파손을 방지하는 것입니다. 이로 인해 시험 물질을 결합하는 광범위한 기술이 탄생하여 내부화된 배양막을 가진 다중 챔버 PDMS 칩을 생산합니다.
서론
장기 온 칩 장치는전 세계 연구소에서 다양한 상업적 및 오픈 액세스 모델이 개발되면서 생의학 연구의 초석이 되고 있습니다. 이 모델들이 연구의 핵심 부분이 되어 전통적인 정적플라스틱 및 동물 모델을 대체함에 따라, 전 세계 다양한 배경의 연구자들이 이 모델들을 쉽게 접근하고 이용할 수 있게 하는 것이 점점 더 중요해지고 있습니다. 이 과정의 핵심은 투입 및 제조 비용과 독립적으로 맞춤형 소량 개발을 달성할 수 있는 접근성입니다.4, 특히 비상업적이거나 학술적인 모델에서1.
온칩 기술에서 가장 큰 도전 중 하나는 유동 중 누수 없이 칩을 안전하게 밀봉하는 것입니다. 칩 소자의 누설 시험에 관한 최근 검토에서는 챔버 간 또는 환경으로의 누출이 산업 및 학계 모두에서 모델 및 실험적 실패의 최고 모드로 확인되었습니다 5,6. 성공적인 밀봉 실패에는 여러 가지 이유가 있습니다: 장치의 작은 크기, 가해지는 유량과 압력, 그리고 주로 이 장치들이 서로 다른 재료로 층층으로 밀봉되어 서로 다른 공정으로 연결되어 있다는 점6. 칩 플랫폼에서 배양막으로 사용되는 다양한 재료의 범위는 그 응용 범위만큼 다양하며, 여기에는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리카보네이트(PC), PDMS, ECM 멤브레인 등이 포함됩니다. 이로 인해 이러한 다양한 재료를 최종 장치에 연결하는 다양한 절차와 치료법이 존재합니다. 이 절차에는 접착제/PDMS를 이용한 압축, 플라즈마 매개 실란 화학, 구조의 화학적 기능화, 전기회전, 기화 용매 결합 등이 포함되며, 모델7에 사용되는 재료에 따라 다릅니다. 이러한 과정들이 서로 다른 기술 세트와 실험실 환경을 요구한다는 사실은 온칩 연구의 학술적 접근성에 일부 제한을 가합니다. 상업용 시스템 참여의 비용과 한계가 학술적 접근을 제한하지만, 칩 제작과 필요한 장비의 길고 다단계적인 과정은 독립적인 학술 개발을 제한한다는 점이 확인되었습니다 1,8,9. 이 연구의 최전선에는 모델의 재현성 표준화 및 검증이 있습니다10,11. 하지만 칩 개발을 시작하려는 많은 연구실들이 특정 연구 질문에 답하고, 동물 연구를 대체하며, 생물학적으로 더적합한 모델을 개발하기 위해 이 지점에 도달하는 데 여전히 공백이 남아 있습니다.
이 글에서는 대부분의 연구 환경에서 제공되는 기술과 장비만으로 필요한 칩 밀봉 작업 흐름을 소개합니다. 이 절차는 세 가지 서로 다른 멤브레인 재료에 대해 방수 PDMS 칩-멤브레인 인터페이스를 생성합니다. 이 공정은 제한된 작업 시간만 필요로 하며, 비칩 실험실 환경에서도 가능하고, 소규모 생산부터 중간 배치 칩 생산까지 확장할 수 있습니다.
제시된 밀봉 절차는 다공성 플라스틱 또는 ECM 멤브레인을 사용하여 수행할 수 있습니다; 제공된 예시 칩들은 공기 노출이 있는 기도 온 칩 장치로 적용하기 위해 이 절차를 통해 제작되었습니다. 이 절차는 막에 필수적인 기공이 포함되어 있다면 다른 유사 장치에도 사용할 수 있습니다. 제공된 칩의 주요 용도는 ALI 배양 및 기도 상피세포에 적용되지만, 다른 용도 및 중간엽 세포 또는 장 세포와의 공동 배양 모델(예: 8,13)에도 사용할 수 있습니다. 첫 번째 칩은 표준 기도 온 칩으로, 대규모 배양 부위(92 mm2)를 갖추고 두 개의 배양실이 있으며, 여기에는 공기 노출을 위한 꼭두리 챔버가 있으며, 기저 챔버와 기저 챔버는 다공성 막으로 분리되어 있습니다. 기저 챔버에는 배지와 선택적으로 다른 잠복된 배양 세포 유형(예: 섬유아세포, 내피 세포)이 포함되어 있습니다. ALI 적용을 위해서는 끝부분에 시딩된 세포가 상부 채널로 배지가 누출되는 것을 막기 위해 단단한 장벽을 유지할 수 있어야 합니다. 두 번째 칩은 첫 번째 것과 동일한 설계로, 양쪽에 두 개의 추가 챔버가 있는데, 여기서는 돼지 ECM을 사용해 배양막을 음압으로 늘리기 위해 자연 기도 확장을 모방합니다.
우리의 밀봉 공정은 PDMS 칩 개발 분야의 여러 요소를 결합하면서도 두 가지 새로운 조건을 더합니다. 첫째, 톨루엔으로 희석된 PDMS 모르타르에 진공을 빠르게 적용하면 톨루엔이 막에 화학적 공격을 가해지는 것을 막하고, 실리콘이 막의 기공이나 표면 특징에 침투하도록 촉진하며, 얇고 변위에 강한 표면을 만듭니다. 톨루엔은 고체 PDMS 표면에 팽창과 변형을 일으키지만, 고농도에서는 용매 역할을 하므로 이 절차에서 액체 PDMS를 희석하는 데 사용됩니다. 여기서 사용되는 PC와 PET 멤브레인과 같은 플라스틱의 경우, 톨루엔은 빠르게 제거하지 않으면 변형과 응력 균열을 일으킬 수 있습니다. 모르타르를 수동으로 적용할 때는 미리 제작된 칩 하프 벽 위에만 적용되도록 주의해야 하며, 배양 영역 내에 칩이 들어가지 않도록 주의해야 합니다. 이는 배양막의 기공을 막고 PDMS가 형성되어 세포 배양 능력에 교란과 변동을 일으킬 수 있기 때문입니다. 둘째, PDMS 모르타르를 상온(RT)에서 72시간 경화하면 열팽창 후 재료가 다양한 정도로 수축하면서 멤브레인이 칩 반부와 모르타르에서 밀려나는 것을 방지합니다.
저희는 3D 프린터나 마이크로밀로 만들 수 있는 두 가지 칩 몰드 설계( 보조 파일 1, 보충 파일 2에 설명됨)와 PDMS와 톨루엔14로 얇은 모르타르를 만드는 방법을 제공합니다. 이 방법을 사용하면 장치 내에서 상업용 플라스틱 멤브레인(PET, PC)의 밀봉이 가능합니다. 또한, 우리는 돼지 고유 ECM 막을 가진 동일한 칩을 만들어 주기적 신장 능력을 가진 생물학적 칩을 만들어 이 공정의 적용 범위를 시험했습니다. Organ-on-Chips는 생체 내 환경의 생리학적 특성을 재현하도록 설계되었기 때문에, 호흡 중 신체에서 느껴지는 기계적 힘, 예를 들어 흐르는 공기의 전단 응력과 좁아지는 기도의 기계적 지형을 생성할 수 있는 Airway-on-Chips는 생물학적으로 매우 중요합니다16. 사용되는 막은 기저막, 고유층 층과 콜라겐, 라미닌 및 기타 주변 기질 단백질로 구성됩니다. 우리가 아는 한, 이것은 최초의 네이티브 베이스먼트 멤브레인 기반 칩이며, 신축 가능성을 가진 최초의 칩으로, 예를 들어 비실리콘 ECM 멤브레인에서 호흡 시 기계적 응력을 모방할 수있습니다. 이 새로운 적용은 플라스틱과 ECM을 이용한 밀봉 절차의 기능을 강조합니다. 마지막으로, 이 칩 및 멤브레인 밀봉 절차를 ALI 세포배양 8에 사용할 수 있는 기도 온 칩(Airway-on-Chip)으로 적용하는 방법을 소개합니다.
프로토콜
이 연구는 동물 실험법에 따라 윤리 위원회 승인에서 면제되었으며, 재료가 사후 사후 조달되었고 과학적 목적으로 동물을 희생하지 않았기 때문입니다(Wet op de dieerproeven). 인간 기도 상피세포의 일차 기도 세포 분리 프로토콜은 흐로닝언 대학교 의료센터의 연구 코드(2025년 1월 14일 https://umcgresearch.org/w/research-code-umcg 접속)와 인체 소재 사용에 관한 국가 및 윤리 전문 지침(2025년 1월 14일 https://www.coreon.org/wp-content/uploads/2020/04/coreon-code-of-conduct-english.pdf 접근)에 따른 것이었습니다. 이 연구는 기관기관지 조직이 이식 후 남은 것이었고, 네덜란드 민법과 기증자 법(Wet op de orgaandonatie)에 따라 완전히 익명화되어 윤리위원회의 승인 요건에서 면제되었습니다.
1. 칩 하프 및 멤브레인 준비
- 칩 생산
- 다운로드. 이 논문의 보충 파일 1 과 보충 파일 2 에 있는 칩의 상하부 STL 설계 파일입니다. 상단 몰드는 깊이 5mm의 칩 하프를, 하단 몰드는 3mm 깊이의 칩 하프를 만듭니다; 두 칩 반쪽 모두 1mm 깊이의 배양 챔버를 가지고 있습니다. 또는 적절한 CAD 소프트웨어를 사용해 칩 설계를 작성할 수도 있습니다.
- 3D 프린팅용 슬라이스 파일이나 칩 몰드를 마이크로밀링할 수 있는 밀 패스를 준비하세요. 마이크로 밀드 몰드가 사용 준비가 완료되며; 수지 인쇄 몰드는 PDMS 몰드로 사용하기 위해 UV 가교 전에 24시간 동안 99.9% 에탄올 세척을 두 번 해야 합니다.
- PDMS 칩 하프 생산 (그림 1)
- 액체 PDMS 염기와 경화제를 10:1 비율로 충분히 혼합한 후, 진공 챔버에서 모든 기포가 제거될 때까지 탈기합니다.
- 넓은 노즐 주사기로 몰드를 채우고, 진공 챔버에서 기포가 모두 제거될 때까지 약 10분 정도 탈기를 하세요. 몰드를 65°C에서 2시간 동안 건조 오븐에 넣어 경화시킵니다.
- 메스로 몰드에서 단단한 칩 반쪽을 제거하고 가장자리에서 플래싱을 잘라내세요. 챔버 양 끝의 상단 절반에 네 개의 흡입구를 추가하고, 생검 펀치로 아래쪽 챔버의 흡입구 위치를 나타내는 인접한 두 개의 링을 추가합니다.
참고: 제시된 결과에는 2mm 생검 펀치가 사용되었고, 배양 중 배양 및 공기 흐름을 위해 2mm 실리콘 튜브가 삽입되었습니다. 1 mm 및 2 mm 인렛은 각각 200 μm 및 1000 μm 팁 크기에 해당하는 피펫으로 세포 시딩을 용이하게 합니다. 다른 펀치 크기는 다양한 튜빙이나 펌프 시스템에 사용할 수 있습니다.
- 막 준비 (그림 2)
- 다운로드. 본 논문의 보충 파일 3 에 나오는 멤브레인 스텐실용 STL 설계 파일. 스텐실은 3D 프린팅 또는 유사한 제작 방법으로 준비하여 일관된 멤브레인 형태를 확보하세요.
- 스텐실을 PET 또는 PC 멤브레인 위에 올려놓고, 멤브레인을 메스로 모양을 잡을 때 단단히 잡으세요.
참고: 이 시점에서는 막을 페트리 접시에서 세포 배양을 위해 기질 단백질로 코팅할 수 있으며, 막 결합을 방해하지 않습니다. 이렇게 하면 세포 성장을 위해 기능적으로 기능하는 세포막만 유지되고,앞서 설명한 것처럼 PDMS 벽은 세포가 없는 상태로 남게 됩니다.
2. 막 결합
- PDMS 박격포 준비
- 액체 PDMS(단계 1.2.1)와 톨루엔을 7:5 비율로 혼합한 후, 앞서 설명한 대로 와이드 노즐 주사기로 위아래로 주사기를 주사기로 주사기로 충분히 섞습니다14. 각 칩마다 8개의 드롭만 필요합니다; 모르타르 배치당 1.4 mL PDMS와 1 mL 톨루엔이 권장되며, 이 척도의 칩 8개에 충분합니다. 일관된 모르타르 혼합은 신뢰할 수 있는 막 결합에 중요합니다.
주의: 톨루엔은 휘발성이 크고 매우 가연성이 높습니다. 노출은 신경계와 호흡기계에 손상을 줄 수 있습니다. 독점적으로 연기호에서만 사용하고, 점화원과 떨어진 곳에서 유출을 관리하며, 흡수성 소재와 환기를 활용해 관리하세요. 취급 중에는 튀김을 방지하기 위해 보호용 고글과 불투수성(니트릴) 장갑을 착용하세요. 모든 실험실 재료(피펫 팁, 용기 등)는 훈기 후드에 24시간 동안 보관하고, 이후 톨루엔은 증발하여 전문 폐기물 서비스를 통해 승인되고 라벨이 붙은 용기에 폐기됩니다. 톨루엔은 싱크대에 절대 버리지 마세요. 추가 정보는 안전 데이터 시트(SDS)를 참조하십시오.
참고: 모르타르는 조기 톨루엔 증발과 플라스틱 오염을 방지하기 위해 사용 시점에 유리가 아닌 용기(가능하면 일회용)에 준비하고, 사용 직후 바로 버리세요. PDMS는 유리 표면을 경화시키며 부분적으로 제거가 불가능하며; 톨루엔은 실험실에서 흔히 사용되는 대부분의 플라스틱을 녹이고 손상시킵니다.
- 액체 PDMS(단계 1.2.1)와 톨루엔을 7:5 비율로 혼합한 후, 앞서 설명한 대로 와이드 노즐 주사기로 위아래로 주사기를 주사기로 주사기로 충분히 섞습니다14. 각 칩마다 8개의 드롭만 필요합니다; 모르타르 배치당 1.4 mL PDMS와 1 mL 톨루엔이 권장되며, 이 척도의 칩 8개에 충분합니다. 일관된 모르타르 혼합은 신뢰할 수 있는 막 결합에 중요합니다.
- PET/PC 멤브레인 부착 (그림 2)
- 모르타르를 PDMS 칩 하프 표면에 빠르게 바르고, 막을 피펫 팁으로 배치합니다.
참고: 막 아래 전체 구역은 모르타르로 젖어 있어야 합니다. 가장 얇은 층을 만들기 위해 팁으로 단단히 고정해야 합니다. 현미경 검사에서는 층이 3에서 5 μm 사이임을 알 수 있습니다. - 준비된 멤브레인(1.3단계)을 깨끗한 겸자로 한쪽 끝에 잡고, 팁을 젖은 모르타르에 칩에 맞는 위치에 올려놓은 후 멤브레인이 제자리에 놓이도록 합니다.
참고: 이 지점 이후로는 막이 이동하지 않도록 하세요; 젖은 PDMS가 챔버에 들어가면 막에 불규칙하고 사용할 수 없는 벽이 생깁니다. 이동이 발생하면 실리콘이 배양 부위를 덮어 세포막 양쪽에서 세포 배양 가능성을 방해하고 막을 버리고 이전 단계를 반복합니다. - 겸자로 막을 부드럽게 고정한 뒤, PDMS 모르타르를 막 위에 다시 발라주며, 매번 치면서 방에서 살짝 멀어지면서 기포를 제거하고 막을 원래 위치에서 움직이지 않고 고정하세요.
참고: PDMS를 막의 내부 배양 부위에 적용하지 않도록 주의하세요; 이는 실리콘이 세포 접착을 방해하고 배양막의 자연 표면을 파괴하기 때문에 필수적입니다. - 습식 모르타르를 부착한 직후 막이 있는 칩 반쪽을 진공 챔버에 넣고, 25 mBar 진공에서 실온에서 72시간 경화시킵니다.
참고: 멤브레인이 부착된 칩 반쪽은 상온에서 경화되어야 합니다. PET/PC와 PDMS는 서로 다른 정도의 열팽창을 경험하며, 열경화는 실리콘이 팽창하고 냉각하면서 수축하여 팽창한 막을 만듭니다(그림 3).
- 모르타르를 PDMS 칩 하프 표면에 빠르게 바르고, 막을 피펫 팁으로 배치합니다.
- 완전한 칩 구성
- 이제 막으로 결합된 칩 반쪽을 칩의 두 번째 절반에 부착할 수 있습니다. 가장 일관된 결과를 위해 양쪽 반쪽을 O2 혈장 처리(320 mBar, 30초)에 노출시키고, 가벼운 압력으로 손으로 빠르게 눌러 붙이세요.
주의: 산소 플라즈마 오븐은 산소 포화 환경, 오존과 같은 위험한 산화물, 그리고 강한 자외선을 생성합니다. 오븐은 환기가 잘 되는 곳이나 배기구 후드에 설치해야 합니다. 오븐 창문은 모든 자외선을 차단해야 하지만, 고글 착용이 권장됩니다. 가연성 물질과 금속은 가속 연소나 독성 연기 누출을 방지하기 위해 산소 플라즈마 구역에 들어가지 않도록 해야 합니다. 산소 플라즈마 SDS 문서를 참조하는 것은 이 프로토콜에 언급된 물질 이외의 모든 물질과 함께 사용할 때 필수적입니다.
참고: 플라즈마 오븐이 없는 경우, 플라즈마 완드나 PDMS 모르타르를 두 번째 절반에 도포하고 상온에서 가벼운 압축 하에 72시간13분 동안 양쪽을 함께 경화시켜 유사한 접착을 할 수 있습니다. 풀 O2 플라즈마 오븐에 비해 효과는 떨어지지만, 오븐이 없을 때 이 옵션들을 사용할 수 있습니다.
- 이제 막으로 결합된 칩 반쪽을 칩의 두 번째 절반에 부착할 수 있습니다. 가장 일관된 결과를 위해 양쪽 반쪽을 O2 혈장 처리(320 mBar, 30초)에 노출시키고, 가벼운 압력으로 손으로 빠르게 눌러 붙이세요.
결과
멤브레인 씰 무결성 테스트
밀봉된 칩의 완전성을 테스트하기 위해 상단 배양실에는 청색 염료가 포함된 데미워터가, 하단에는 순수 데미워터가 채워집니다. 칩은 막 주변의 상단 챔버에서 하단 챔버로 블루 염료가 누출될 가능성을 평가하기 위해 하룻밤 동안 그대로 둡니다.
우리 방법으로 준비된 완전 제작된 실리콘 칩은 멤브레인 무결성을 손상시키지 않고 35° 방향으로 변형할 수 있으며, 양쪽에 유연한 PDMS 모르타르로 상단 절반을 감싸고 결합합니다. PDMS 칩의 변형은 일반적인 사용 중 일부로, 예를 들어 반쪽이나 칩이 페트리 접시에 달라붙을 때 사용됩니다.
칩들은 양방향 주사기 펌프 시스템에 연결되어 유량 유도 압력에서의 성능을 시험했습니다. PET와 PC 멤브레인이 장착된 칩은 챔버 간 누설이나 칩 파열 없이 최대 30 kPa(펌프가 제공하는 최대 압력)까지 작동할 수 있습니다. 이전 연구에서는 칩이 표준적으로 150 μL/h로 작동하며, 이는 각 장치8의 챔버에 0.7 Pa의 압력을 가합니다.
막 결합의 시각화
RT 진공 밀봉 결과로 현미경 아래 0.4 μm 두께의 막 구멍으로 액체 PDMS 모르타르가 침투하는 것을 시각화하기 위해 PDMS 모르타르는 나일 레드로 염색되었습니다. 나일 레드는 소수성 염료로 액체 형태의 PDMS와 잘 섞일 수 있어 선택되었습니다. 이 염색은 1% 나일 레드를 액체 PDMS에 완전히 혼합하여 광학 현미경에서 붉은 색을 만들어냈습니다. 위에서 설명한 RT 경화 절차가 반복되었습니다. 염색된 모르타르가 부착된 막을 파라핀에 박고 미세토임으로 절면을 절단했습니다. 막 슬라이드는 유리 슬라이드에 장착되어 광학 현미경으로 촬영되었습니다(그림 4). PDMS를 모르타르에 톨루엔으로 희석하고 PDMS가 막 구멍에 침투하도록 진공을 가하는 필요성을 검증하기 위해, 이러한 방법을 사용한 멤브레인과 없는 멤브레인 비교는 보충 그림 3에서 확인할 수 있습니다.
세포 생존 가능성 검사
이전 연구에서는 장치 제작에 톨루엔을 사용한 잠재적 화학 독성이 시험되었습니다. 칩은 PDMS 모르타르에서 톨루엔 유무 모두를 혼합하여 제조했으며, 인간 폐 선암 상피 Calu-3 세포를 2일간 융합할 때까지 배양하고,앞서 설명한 대로 칩에서 1일간 배양했습니다. 세포 사멸은 트리판 블루 염색으로 평가되었으며, 장치에서 모든 세포를 제거하고, 죽은 세포(파란색)를 염색되지 않은 생존 세포와 비교하여 측정했습니다. 증식은 칩 매체 내 시약을 인큐베이팅한 후 AlamarBlue 분석법을 수행하고, 플레이트 리더를 통해 형광 흡수도를 측정하여 증식을 반영하여 평가했습니다(그림 5)8.
ECM 베이스먼트 멤브레인 부착
이 절차가 다양한 막과 강력하고 유연한 결합을 생성하는 데 일반적으로 적용할 수 있음을 보여주기 위해, 이 프로토콜은 완전 세포외기질(ECM) 기반의 막으로 반복되었습니다(그림 6). 17 이전에 기술된 돼지 배뇨 방광에서 기저막 ECM 스캐폴드를 준비하였다. 간단히 말해, 4개월에서 8개월 사이의 암컷 동물의 돼지 배변을 네덜란드 흐로닝언의 지역 도살장(Kroon Vlees b.v.)에서 채취하여 수집 후 3시간 이내에 처리했습니다. 방광에서 결합 조직과 지방을 제거하고, 방광을 뒤집어 뒤집은 상피층을 둔하게 해부했으며, 조직은 상온에서 PBS에 보관되었습니다. 막 부착 절차를 위해 ECM 스캐폴드는 탈수되었다17. 준비된 스캐폴드는 위 프로토콜에 설명된 대로 잘라 PDMS 칩 반쪽에 결합되었습니다. 진공 실리콘 결합이 수평 기계적 변형도 견딜 수 있음을 보여주기 위해 장치 내에 멤브레인 신장을 위한 추가 챔버가 있는 새로운 몰드가 제작되었습니다(보완 파일 2).
ECM 막 무결성 테스트
멤브레인 씰 무결성 테스트는 위와 같이 수행되었습니다. 다음으로 스트레치 칩을 주사기 펌프에 부착하여 장치의 측면 챔버에 진공을 끌어당겨 ECM 막에 하룻밤 동안 1mm 수평 신장을 발생시켰습니다(그림 7).
표준 PET 막을 사용하는 기도 온 칩에서 상피세포의 분화 및 섬유아세포 공동 배양
제공된 칩이 ALI 세포의 기도 온 칩으로서의 성능을 검증하기 위해,이전 연구에서 인간 폐선암 상피 Calu-3 세포(ATCC, 버지니아주 매너서스)를 결합하여 기기 내에서 공기 노출시키도록 배양했습니다. 10일간 꼭대기 공기 노출 후 Calu-3 상피세포가 점액 생성 세포로 분화하는 것을 볼 수 있으며, 이는 Alcian Blue 염색으로 측정된 점액 생성으로 입증됩니다(그림 8)8.
장기간 누출 없는 흐름과 공동 배양을 위한 절차를 검증하기 위해 이전 논문에서 한 예시를 확인할 수 있습니다; 전체 세포 배양 방법론에 대해서는이 8조를 참조하세요. 인간 기도 상피 세포는 칩의 꼭대기 배양실에서 21일간 일정한 공기 흐름 하에 배양되었으며, 일차 기도 섬유아세포는 막 반대편에서 거꾸로 배양했습니다. 요약하자면, 1차 기도 상피 세포는 프로테아제 처리(HBSS에서 0.2 mg/mL, 2시간, 37 °C), 세포 긁기, 그리고 3명의 건강한 폐 기증자로부터 남은 기관기관지 조직에서 제거된 세포의 냉동 보존을 통해 분리되었습니다. 인간 기도 섬유아세포(AF)는 단일 기증자로부터 이식된 COPD 폐 조직의 기관지 조직에서 동일한 방식으로 분리되었습니다.
그림 9에서는 칩의 그래픽과 위에서 언급한 셀들이 장치 챔버를 통과하거나 따라 어떻게 나타나는지 볼 수 있습니다.
ECM 막의 섬유아세포와 공동 배양하는 상피세포 배양
기저막을 포함하는 비계는 상피 및 중엽 세포 배양을 촉진합니다. 불멸화된 인간 각화세포(HaCaT 세포)는 60 x 103 cells/cm 2 밀도로 막의 상피(내측) 쪽에 시딩되었으며, 24시간 후 생존율은 95%였으며, 플라스틱 세포 배양 플라스크에서는 91%였습니다(그림 10A). 다음으로, 정상 인간 폐 MRC-5 섬유아세포를 60 x 103 cells/cm² 밀도로 기질(바깥쪽) 쪽에 시딩하고, HaCat 세포와 함께 공동 배양하여 14일간 공동 배양하여 천연 ECM 막에서의 상피-간엽 공동 배양 장기 생존 가능성을 평가하였다(그림 10D). 상피세포는 막 내측에 합류 단일층을 형성했으며, 섬유아세포는 ECM 막 외면에 덜 밀집되어 분포했으나 특유의 방추체 형태를 유지했다(그림 10C). 3D 재구성 영상은 보충 파일 417에서 볼 수 있습니다.
본 연구는 강력한 PDMS-멤브레인 연결을 생성하는 개선된 멤브레인 밀봉 절차를 제시했으며, 이는 칩의 수동 조작으로 인한 손상을 견디고, 최대 0.7 Pa의 압력을 이용한 장기 유동 배양을 가능하게 합니다. 우리는 이 막들이 실리콘으로 결합되어 있는데, 실리콘이 배양막의 기공을 통해 침투하여 두 칩 반쪽과 진공 PDMS 모르타르 사이에 공유 공유 실란 결합을 촉진한다는 것을 보여주었습니다. 또한, 모르타르가 올바르게 적용된다면 제시된 절차는 세포독성을 유발하지 않습니다. 더욱이, 생산된 칩은 장기적인 상피 단피 및 상피-중간엽 공동 배양을 촉진했습니다. 이 절차는 다공성 막에만 적용되지만, 신뢰할 수 있고 세포 배양 준비가 가능한 ALI 칩을 생산하는 데 있어 투입이 적은 절차로 남아 있습니다.
그림 1. PDMS 칩 반 생산 및 멤브레인 준비의 그래픽. PDMS 칩 하프 생산(단계 1.2)에서는 칩 몰드에 액체 PDMS를 넓은 노즐 주사기로 채웁니다. 상단 몰드에는 4.4 mL, 하단 몰드에는 2.4 mL가 있습니다. PDMS 반쪽은 65°C에서 2시간 경화한 후, 상단 칩 반쪽의 4개 흡입구가 챔버 끝과 몰드에 표시된 지점에 구멍을 뚫습니다. 멤브레인 준비(1.3단계)를 위해 인쇄된 멤브레인 스텐실은 멤브레인 표면에 단단히 고정됩니다. 새 칼날을 사용해 스텐실 주위를 자르고 칩 멤브레인을 주변 재료에서 제거합니다. 막은 세포 배양을 위해 코팅되거나 2단계에서 직접 사용할 수 있습니다. BioRender로 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 2. 막 결합 절차. PDMS 모르타르는 위에서 설명한 대로 사용 직전에 혼합됩니다. 모르타르는 배양실 네 모서리에 떨어뜨리고, 피펫의 각도 있는 끝으로 막 결합 부위에 부드럽게 뿌립니다. 막의 한쪽 끝을 모르타르 위에 올려놓고, 배양실과 정렬된 후 부드럽게 제자리에 맞게 놓습니다. 모르타르는 점적 방식으로 다시 바르고, 세포 가장자리에 칠하되, 실리콘이 배양 영역 내 막 표면에 닿지 않도록 매우 주의 깊게 작업합니다. 칩 반 결합된 막은 즉시 진공 챔버에 넣어 미세기포를 제거하고, 실리콘이 표면과 기공에 침투하도록 하며, 톨루엔을 제거하여 막에 대한 화학 공격을 최소화합니다. BioRender로 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 3. 막 배치 예시. (A) 막 삽입 성공, RT 경화. (B) 오븐(RT가 아닌 65 °C)에서 막 결합 경화, 실리콘이 가열 후 수축하면서 막이 챔버 안으로 팽창한 것을 볼 수 있습니다. (C) PET 및 PC 멤브레인 올바른 위치가 있는 완전한 칩. (D) 멤브레인 배치가 잘못되면 멤브레인 움직임에 따라 칩 각 면의 부피가 변하여 유량이 변하고, 칩 내 세포와 칩에 부착된 펌프에 스트레스가 가해집니다. BioRender로 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 4. 슬라이스 및 장착된 PET 및 PC 멤브레인의 광학 현미경 이미지. 진공 RT 경화 절차의 결과로 막 구멍으로의 실리콘 침투를 보여줍니다. (A) PDMS를 적용하지 않은 동일한 막의 이미지, 투명한 기공과 편광 이미지에서 깨끗한 표면이 관찰됨. (B) PDMS 모르타르는 나일 레드로 염색되었고, 실리콘은 마젠타색으로 진공 상태에서 성공적으로 침입하여 표면을 얇게 코팅한 것으로 볼 수 있습니다. 흰색/마젠타 형태로 강조되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 5. 칩 소자의 세포 생존성은 PDMS 모르타르에 톨루엔을 희석제로 사용하든 사용하지 않든 구조에 의해 변화하지 않았습니다. Calu-3 세포는 칩당 6.5 × 104 세포에 시딩되었고, 수합점에 도달하면 하룻밤 동안 배양한 뒤 상청액에 대해 AlamarBlue 분석을, 세포에 대해 TrypanBlue를 시행했습니다. 톨루엔 포함 및 무첨가 그룹 간 차이(n=4)는 비짝 학생 t 검정으로 검사되었으며, p > 0.05 = ns (유의하지 않음)8. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 6. 지하실 멤브레인 칩. (A) PDMS/톨루엔 모르타르가 충분히 빨리 진공 제거되지 않아 멤브레인 무결성이 손상되었습니다; 이로 인해 매트릭스 단백질이 손상되고 칩 밀봉이 방해받았습니다. (B) 멤브레인과 칩 밀봉은 성공했으나, 멤브레인은 느슨한 상태로 밀봉되어 있습니다. (C) 성공적인 멤브레인 및 칩 밀봉, 칩은 유동 및 신장 기능을 수행합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 7. ECM 칩이 늘어난 두 장의 이미지. (A) 칩이 정지 상태. (B) 1.2mm 수평 신장 아래 칩. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 8. 알시안 블루(핵은 마젠타, 점액은 파란색) 인간 폐 칼루-3 상피세포가 공기 노출 후 칩에서 배양된 염색. 칼루-3 세포는 기저 구획에서 150 μL/h의 연속 유량으로 10일간 배양되었으며, 꼭대기에서는 배양 또는 공기 노출 방식으로 배양되었습니다. 유량은 인큐베이터 내 연동 펌프를 사용해 37°C,CO2 5%에서 생산되었습니다. 배양이 끝나면 막을 제거하고 염색했습니다. 10일간 잠수(A) 및 공기 노출(B)에서 배양된 Calu-3 세포의 Alcian Blue 염색 횡방향 모습8. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 9. 장치 내 확장 공동 배양에서 원발성 인간 상피세포와 섬유아세포의 시각화. 기도 섬유 아세포를 장치 안에 시딩하고 하룻밤 동안 부착한 후 장치를 뒤집어 막 반대편에 상피 세포를 시딩했습니다. 세포들은 융합 상태에서 배양되어 공기 노출된 후 21일간 배양되었으며, 인큐베이터 내 연동 펌프로 37°C와 5%CO2로 연속 유량 150 μL로 생산되었습니다. 막은 배양 후 제거되어 고정, 삽입, 슬라이드에 장착한 후 염색을 했습니다. 상피 세포에서는 점액의 구성 요소인 Mucin 5AC(MUC5AC)18과 섬모 생성 신호 전달에 관여하는 전사 인자인 포크헤드 박스 단백질 J1(FOXJ1)19를 염색하였다. 섬유아세포는 밀 생체 응집분체(WGA)로 염색하여 세포 내 인지질 이중층을 시각화하였습니다. 세포는 HBSS에서 5 μg/mL로 15분간 인큐베이팅된 후 영상 촬영 전에 PBS로 세 번 세척되었습니다. 모든 세포핵은 DAPI로 시각화되었습니다. (A) 단면도 뷰: (B) 와 (C)의 이미지를 Z-스택 투영하여 생성됨. (B) 상피성 MUC5AC/FOXJ1/DAPI 칩 막 염색. (C) 기저 방 내 섬유아세포층의 완전한 외부 구조8. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 10. 기저막 비계에서의 세포 생존성과 공동 배양. (A) 상피 쪽에 시딩된 HaCaT 세포의 생존/사망 생존성, 3개의 독립 샘플을 테스트하고 각 샘플에서 3개의 무작위 필드를 포착했습니다 (n = 3). 튜키의 보정을 적용한 일반 일원 ANOVA 검정이 수행되었습니다. 그래프는 표준편차가 있는 평균을 보여줍니다. ( B) 상피 측의 HaCaT 세포와 (C) 기질 측의 MRC-5 폐 섬유아세포를 콜라겐 섬유로 둘러싸고 있는 기질 쪽에 공동 배양, 스케일 바는 50 μm입니다. (D) 상하 등각 시점에서 본 공동 배양 3D 뷰, 스케일 바는 100 μm, 애니메이션 시각화는 보충 그림 4에서 확인할 수 있습니다. (E) 탈세포화 전후 기저막 비계 두께를 측정하여 14개의 점막을 측정하였고, 그 중 6개(삼각형으로 표현됨)가 탈세포화를 위해 채취되었습니다. 각 샘플에서 세 개의 무작위 필드를 스캔했고, 각 필드마다 최소 10점이17번 측정에 해당했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
보조 그림 1. 표준 PET/PC 칩의 상하부 절반을 위한 칩 몰드 설계. (A) . 보충 파일 1의 STL. (B) . 보조 파일 2의 STL. (C) 칩용 멤브레인 절단용 멤브레인 이미지, . 보충 파일 3의 STL. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보조 그림 2. 스트레치 ECM 멤브레인 칩의 상하부 절반을 위한 칩 몰드 디자인. (A) . 보충 파일 4의 STL. (B) . 보충 파일 5의 STL. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보충 그림 3. 밀봉 절차 검증: 몰타르의 점도를 낮추기 위해 톨루엔 없이 PDMS가 공구멍에 침투한 것과 진공 없이 RT에서 경화된 경우의 비교. 모든 조건 은 PET 막(0.4 μm 기공)과 관련되며, PDMS(나일레 레드 1%) 처리 후 막을 파라핀에 내장하여 장착하고 광학 현미경 영상을 사용했습니다. (A) 희석되지 않은 PDMS를 PET 막에 진공청소기로 부착합니다. 막 표면에는 두꺼운 PDMS층이 보이지만, 공구멍 안으로 들어가는 PDMS는 관찰되지 않습니다(흰색 박스로 강조됨). (B) 희석한 PDMS 모르타르를 PET 멤브레인에 진공청소기로 부착함. 막 표면에는 PDMS층이 보이지만, 공구멍 안으로 들어가는 PDMS는 관찰되지 않습니다(흰색 박스로 강조됨). (C) 희석한 PDMS 모르타르를 PET 멤브레인에 진공청소기로 부착합니다. 막 표면에는 얇은 PDMS층이 있으며, 막을 따라 구멍으로 침입된 부분도 볼 수 있습니다(흰색 박스로 강조됨). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보조 그림4. 3D 돼지 ECM 스캐폴드에 있는 공배양 HaCat(상피세포)과 MRC-5(기질) 세포의 시각화. 위아래 등각 투영 뷰에서 본 공화의 애니메이션 3D 모습( 그림 10D에서 볼 수 있음)으로, 스케일 바는 100 μm입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.
보조 파일 1. 3D. 바닥 몰드의 STL 파일 사용. 이 몰드는 3D 프린팅이나 동등 제작 방법으로 표준 칩의 하단 절반을 제작하는 데 사용할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보조 파일 2. 3D. 상단 몰드의 STL 파일 작성. 이 몰드는 3D 프린팅이나 동등한 제작 방법으로 표준 칩의 상부 절반을 제작하는 데 사용할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보조 파일 3. 3D. 멤브레인 스텐실의 STL 파일. 스텐실은 제공된 칩에 맞는 적절한 크기의 멤브레인을 제작하는 데 사용될 수 있으며, 3D 프린팅이나 동등한 제작 방법으로 제작할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보조 파일 4. 3D. 스트레치 칩 하단 몰드의 STL 파일 이 금형은 3D 프린팅이나 동등한 제작 방법으로 스트레치 칩의 하단 절반을 제작하는 데 사용할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보조 파일 5. 3D. 스트레치 칩 상단 몰드의 STL 파일 이 금형은 3D 프린팅이나 동등한 제작 방법으로 스트레치 칩의 상반부를 제작하는 데 사용할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
토론
여기서 제공하는 칩 밀봉 프로토콜은 장기간 유류 배양에 적합하고, 제한된 장비로도 제작 가능하며, 전문 기술이 필요하지 않은 방수 PDMS 막 칩 씰을 생산하는 새로운 방법입니다. 우리는 실리콘 모르타르로 표면에 결합된 막(PET, PC, ECM)을 사용하는 칩 웨이퍼 제조 절차를 보여주며, 진공 신속 적용이 PDMS가 플라스틱 막의 기공과 표면 침투를 촉진한다는 것을 보여준다. 또한 결과 칩이 잘 밀봉되어 다양한 배양 용도가 가능함을 보여줍니다.
PDMS-플라스틱 결합에 접근하는 여러 가지 방법이 있으며, 이는 PDMS의 유익한 특성(가스 투과성 또는 패턴성 등)과 플라스틱 막의 세포 배양 생존성 등으로 인해 흔히 볼 수 있는 결합 전략입니다. 여기에는 O2 플라즈마를 이용한 표면 활성화, 코로나 또는 오존 처리가 포함되며, 이는 실리콘 또는 유리20 사이의 공유 결합 형성을 촉진합니다. 또는 APTES((3-아미노프로필)트리에톡실란) 또는 MPTMS((3-머카토프로필)트리메톡실실란과 같은 유기실란을 이용한 화학적 접착 기술이 두 물질의 표면에 반응성을 첨가하여 기능화합니다21. 또는 PDMS와 플라스틱 기판은 에폭시나 기타 접착제를 이용한 접착 방식으로 접착할 수있습니다. 우리는 표면 활성화와 화학적 접착의 하이브리드를 제시하는데, 다공성 막과 진공을 이용해 막을 통해 물리적 연결을 만들어O2 플라즈마 표면 활성화만으로도 결합할 수 있습니다. 톨루엔으로 PDMS를 희석함으로써 진공 상태에서 막의 기공을 통해 PDMS가 침투할 수 있게 되어, 칩 반쪽과 모르타르가 박힌 막을 가로지르는 PDMS-PDMS 결합을 통해 서로 다른 막들이 공유 결합될 수 있습니다. 이러한 기공을 통해 실리콘 네트워크를 생성함으로써, 표면 화학 처리나 뜨거운 엠보싱 기계가 제공하는 열과 압력 작업을 피할 수 있습니다. 이 기계들은 종종 이러한 기술을 돕습니다23.
본 연구에서는 다양한 기능을 수행할 수 있는 대규모 2개 챔버 칩(보충 파일 1)이 제공됩니다. 둘째, 주기적 수평 신축이 가능한 칩(보충 파일 2). 이 장치들은 Airway on Chip 기능으로 작동하며, 앞서 보여준13처럼 내장 내장 칩으로도 사용할 수 있습니다. 주로 몰드 생산, 멤브레인 준비, 칩 제작에 관한 다양한 옵션을 단계별로 안내하며, 연구자들이 원하는 용도에 따라 추가 신형 칩 플랫폼에 적용할 수 있습니다. 최종 밀봉에는 O2 플라즈마 오븐을 사용하는 것이 권장됩니다. 그럼에도 불구하고, 휴대용 플라즈마 장치나 PDMS 박격포를 이용한 수동 압축 장치도 이24단계에 성공한 것으로 관찰되었습니다. 이 밀봉 절차에 대한 프로토콜에서는 각 지점에서 주요 장애물과 사양이 강조되었습니다. 여기에는 막을 미리 코팅할 수 있는 옵션, PDMS/톨루엔 모르타르의 즉각적인 사용의 중요성, 모르타르가 배양 구역에 들어가지 않는 것, 그리고 모르타르와 연결된 후 막이 움직이지 않는 것이 얼마나 중요한지가 포함됩니다.
이 봉인 절차의 재현은 조사관들에 의해 서면 프로토콜에 따라 반복적으로 수행되어 왔으며; 두 번째 시도에서 성공적으로 봉인하기 위해서는 다음과 같은 설명만 필요했습니다. 스트레스 검사나 장기 세포 배양 중 누출이 발생하면 몇 가지 옵션을 탐색할 수 있습니다. 첫째, 연구자는 모르타르가 경화되지 않은 PDMS 액체에서 신선하게 만들어졌고, 톨루엔과 충분히 혼합되었는지 확인해야 합니다. 모르타르의 낮은 점도 덕분에 얇고 매끄러운 층이 공기를 진공 흡입할 때 막 구멍으로 흘러들어갈 수 있습니다. 둘째, 모르타르를 충분히 발라서 막의 하단과 상단 전체를 덮어야 하며, 너무 많이 발라면 압축 상태에서 배양 부위로 유입되고, 너무 적으면 빈틈이 생겨 챔버 간 누출 경로가 생깁니다. 셋째, 부착 전과 부착 중에 막은 평평해야 합니다. 마지막으로, 수작업이 필요함에도 불구하고 칩은 완전한 최종 접착을 위해 대부분 오염되지 않아야 하므로 빠르고 깨끗한 작업이 필수적입니다.
이 논문에서 세 가지 유형의 다공성 막이 부착되는 현상을 보여주었으나, 이 방법이 다른 막에 미치는 기능은 예측할 수 없습니다. 이는 톨루엔에 대한 다양한 화학 저항성과 기공의 밀도 및 크기가 이 밀봉 절차의 결과에 영향을 미치기 때문입니다. 그러나 우리는 최초의 완전 ECM 기반 신축 가능한 막 결합을 보여주었는데, 이는 프로토콜의 높은 다양성을 시사합니다. 그러나 스트레칭 성능의 일관성은 신뢰성 있게 검증되지 않았으며, 서로 다른 기저막 영역, 기관, 출처에 따라 기계적 차이가 발생한다. 또한, ECM 막의 세포 배양 생존 가능성도 배양및 저장 시 시간에 따라 변하기 쉽습니다. 이 방법은 다양한 멤브레인과 칩 구성에 적용되지만, 효과적이려면 모르타르를 수동으로 도색해야 하며, 이는 비교적 적은 시간이 걸리지만 저희가 제공하는 대형 모델에서는 더 자주 성공할 수 있습니다. 마지막으로, 막 결합 공정은 PDMS, 톨루엔, 멤브레인, 진공 챔버만으로 충분하지만, 칩의 최종 밀봉은 보편적으로 구할 수있는 것은 아닌 산소 플라즈마 적용에 의존합니다.
제한에도 불구하고, 제공되는 프로토콜은 새롭고 전문적인 기술이 필요하지 않습니다. 우리가 아는 한, 저점도 PDMS 모르타르를 진공 흡입하여 막 구멍을 통해 실리콘 네트워크를 생산하는 것은 최초의 사례입니다. 기능적 칩의 기저에 있는 다양한 재료 간의 다른 화학적 또는 기계적 기능적 연결 방식과 달리, 이 해결책은 대부분의 실험실 환경에서 가능합니다.
공개 사항
저자들은 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 정밀 의학 포 더 많은 산소(P4O2) 컨소시엄과 Stichting Proefdiervrij의 자금 지원을 받았습니다. 실리콘 네트워크 시각화에 PDMS와 섞일 수 있는 나일 레드 스테인을 사용하자는 아이디어를 준 Isadora Kraguljac님께 깊은 감사를 드립니다. 또한 막을 재능 있게 절단하고 장착한 Marjan Reinders-Luinge님께도 감사드립니다. 저자들은 제약 분석 부서와 Sabeth Verpoorte가 산소 플라즈마 오븐에 접근할 수 있도록 제공해 주신 것에 깊은 감사를 표합니다. 이 과정은 이 기능이 없었다면 불가능했을 것입니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2mL 와이드 노젤 주사기 | BD 에메렐드 | 307727 | |
| 2mm 생검 펀치 | 카이 메디컬 | BP-20F | |
| 칼루-3 세포주 | ATCC | HTB-55 | RRID: CVCL_0609 |
| HBSS (행크스 밸런스 소금 용액) | 깁코 | 14170112 | |
| O2 플라즈마 오븐 | 해릭 플라즈마 | PDC-002 | |
| PC 트랙 에칭 세포 배양막 | ip셀컬처 | 1000M25/620N403/47 | |
| PET 트랙 에칭 세포 배양막 | ip셀컬처 | 2000M23/610N403/47 | |
| 폴리디메틸실록산/실가드 184 실리콘 엘라스토머 베이스 및 경화제 | 다우 코닝 | DOWC25100445 | |
| 폴리메틸 메타크릴레이트 (8mm) | 콜텍 | 해당 없음 | |
| 표준 광분자 수지 (회색)(1kg) | 엘레구 | 해당 없음 | |
| 톨루엔 | 머크 | 1,08,325 | |
| 진공 챔버 | 피셔스티언 | 12080253 |
참고문헌
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