우리는 새로 진단되고 재발한 종양에서 생성된 환자 유도 자기 교모세포를 이용한 3D 교모세포종 이동 모델을 제시합니다. 이 플랫폼은 환자별 이동 역학을 시각화하고 치료 효과 평가를 가능하게 합니다. 이 분석법은 이동 후 다중화되어 단백질 위치와 발현 패턴을 평가할 수 있습니다.
방법 논문
저산소 조건에서 자기 나노입자를 이용한 구형 위치 측정을 이용한 재현 가능한 3D 교모세포종 이동 검사
이 논문에서
요약
초록
우리는 임상적으로 중요한 저산소 상태에서 새로 진단되고 재발한 종양에서 환자 유래 교모세포종 교모구의 이동 및 침습적 가능성을 모델링하는 재현 가능한 3D 이동 분석법을 기술합니다. 균일한 크기의 교모구는 얇은 세포외 기질 층에 옮겨지고, 자기 철산화물 나노입자와 공동 배양되어, 배양 웰 내에서 자기 플레이트 홀더에 위치시켜 중앙에 위치시킬 수 있게 합니다. 시딩에 자기 산화철 나노입자를 포함함으로써 개별 환자 유래 교모구의 정밀하고 국소적인 영상 촬영이 가능해지고, 위치 변동성을 줄여 자동 이미지 처리 파이프라인을 최적화합니다. 이 분석법은 생리학적으로 중요한 미세환경에서 교모세포종의 이동 행동을 상세히 연구할 수 있게 하며, 새로 진단된 환자와 재발 환자 유래 교모구체 간 침습적 잠재력과 이동 행동을 직접 비교할 수 있게 합니다. 이 방법은 생세포 영상 및 다중화 분석과 호환되어, 교모세포종 이동, 침습 가능성, 치료 반응의 전임상 연구를 위한 확장 가능한 플랫폼을 제공합니다.
서론
교모세포종은 신경종양학에서 가장 중요한 도전 과제 중 하나로 남아 있습니다. 이 질환은 환자 내 및 내 광범위한 이질성, 표준 치료에 대한 강한 회피, 세포자살멸 유도에 대한 저항성, 그리고환경 조건에 대한 놀라운 가소성에 의해 유발됩니다. 최근에는 종양 미세환경(TME)의 복잡성에 대해 상당한 주목을 받고 있으며, 특히 미세환경 변화에 반응하여 표현형과 세포 상태를 전환할 수 있는 교모세포종 줄기유사세포(GSCs)의 역동적인 특성에 관심이 집중되고 있습니다 2,3. 이러한 표현형 가소성은 종양의 진행을 촉진하고, 적극적인 최전선 표준 치료에도 불구하고 불가피한 재발에 기여합니다. 외과적 절제술은 환자 예후를 개선하는 가장 효과적인 치료법이지만, 교모세포종은 매우 침투적이고 미세한 침습성으로 인해 완전한 종양 제거는 불가능합니다. 다양한 질환 단계와 종양 특이적 상태에서 환자 샘플의 침습적 역학을 모델링하는 것은 교모세포종 이동의 역동적이고 가소적인 능력에 대한 더 깊은 이해를 돕고, 따라서 효과적인 새로운 치료 접근법을 식별하는 데 도움이됩니다. 5. 따라서 환자별 침입 및 이동 역학을 포착하는 생리학적으로 관련 있는 모델을 개발하는 것은 전임상 연구를 강화하고 이러한 목표를 진전시키는 데 필수적입니다. 더불어, 이러한 모델은 수술과 병행하여 잔여 미세 침윤을 예방하고 궁극적으로 재발 위험을 줄이기 위해 개발될 수 있는 새로운 항종양 치료의 효능 평가에 매우 중요합니다. 교모세포종의 복잡성은 주요 종양 구조적 특징을 재현할 수 있는 첨단 복합 전임상 모델의 필요성을 정당화합니다. 환자 유래 3차원 모델은 세포 간 상호작용을 보존하고, 영양소, 산소, 치료제의 구배를 유지하며, 천연 종양의 구조적 완전성을 재현하는 능력으로 주목받고 있습니다 6,7. 하지만 이러한 3D 모델을 시각화하는 데는 구형 위치 확인, 영상 변동성, 분석 재현성 등 기술적 도전이 따릅니다.
여기서는 저산소 조건에서 수행되는 환자 전용 3D 교모세포종 이동 모델을 설명하여, 치료 미숙 및 재발성 종양 샘플을 포함한 다양한 환자 종양 아형과 질환 단계에서 유래한 샘플 간 이동 역학을 조사할 수 있게 합니다. 이 플랫폼은 치료제에 대한 차이 반응 평가를 가능하게 하며, 이미지 분할을 통한 다중화 이주 후 분석을 지원하여 이동 역학, 구형 성장 및 단백질 발현의 정량적 평가를 가능하게 합니다. 자기 산화철 나노입자의 도입은 부드러운 자기력을 가하여 각 우물 내에서 구형체를 일관되게 집중시킬 수 있게 합니다. 표준 다웰 플레이트에서 배양된 구체는 종종 웰 가장자리 쪽으로 이동하는 경향을 보이는데, 이는 특히 플레이트 경계 9,10,11 우물에서 액체 반월판 형성과 말초 증발에 의해 영향을 받는 것으로 여겨집니다. 이러한 현상은 특히 투과광 현미경 시에 영상 아티팩트와 배경 잡음을 유발하여 침입 역학의 타임랩스 영상을 복잡하게 만들 수 있습니다. 2D 단층 배양과 달리, 균일한 세포 밀도의 영역을 선별하여 영상을 촬영할 수 있지만, 단일 구체 침투 분석은 전체 구상체 및 이동 영역을 영상 필드 내에서 정밀하고 일관되게 위치시켜야 합니다. 이는 유정 내 이동이나 불규칙한 위치가 데이터 품질과 재현성을 저해할 수 있어 추가적인 도전 과제를 만듭니다. 따라서 멀티웰 플레이트 내에 구체를 일관되게 중앙 배치하면 이러한 도전 과제를 최소화할 수 있으며, 영상 품질뿐만 아니라 실험적 일관성, 이미지 처리 파이프라인 및 이동 후 분석도 향상됩니다. 또한, 이러한 특수 구형 배양판에서 균일한 세포 밀도로 구형 배양을 시작하면 재현 가능한 구형 형성이 촉진되어 형태, 성장 속도, 구조적 완전성의 변동성을 줄인다10,11. 실제로는 이러한 분석법에 사용되는 일반적인 교모구(gliomasphere)의 직경이 150–300 μm 사이로, 표준화된 세포 밀도 하에서 재현성 있게 형성됩니다. 배양은 저산소 상태(1%–2% 산소2) 상태에서 유지됩니다.
여기서 설명된 플랫폼은 96웰 플레이트와 같은 중간에서 고처리량 포맷을 지원하여 환자 샘플당 다중 복제를 가능하게 하며, 약물 스크리닝 또는 다중 조건 분석법12 에도 확장 가능합니다. 따라서 구형 위치 최적화와 배양 조건을 최적화하는 것은 교세포종 침윤 잠재력 및 기타 동적 세포 과정을 연구하는 데 사용되는 3D 전임상 모델의 견고성과 임상적 관련성을 높이는 데 필수적입니다.
프로토콜
환자 유래 교모세포종 세포는 네덜란드 로테르담의 Erasmus MC와 캐나다 토론토의 Sick Children 병원에서 제공되었습니다. 이 라인의 1차 환자 샘플은 환자의 사전 동의 하에 받은 일상적 절제술의 일부로 얻어졌습니다(윤리적 승인 번호, MEC-2013-090, 0020010404).
1. 자기 환자 유래 교모구의 준비 (그림 1)
- 교모구체 해리 최소 30분 전에는, 실험에 필요한 충분한 세포 박리 효소 배지와 교모구체 배지를 추출하여 실온에 보관합니다.
- 멸균 조건에서 10 mL 혈청학적 피펫과 피펫 보조 도구를 사용해 부드러운 흡인으로 배양 플라스크에서 교모구를 채취하여 15 mL 원뿔 튜브로 옮깁니다. 원심분리기는 300 x g 에서 3분간 돌립니다. 세포 펠릿을 건드리지 않고 상정액을 조심스럽게 버리세요.
- 펠릿을 1mL 상온 세포 분리 효소 배지에 재현탁하여 10–15분간 배양하고, 2-3분마다 P1000 피펫으로 부드럽게 저어 단일 세포 현탁액으로 해리를 촉진합니다.
- 효소를 비활성화하기 위해 같은 양의 교모구체 배지를 추가하세요. 300 x g 에서 37°C에서 3분간 단일 세포 현탁액을 원심분리한 후, 세포 펠릿 크기에 따라 3–5 mL의 완전한 교모구체 배지에 부드럽게 재현탁하며, 이후 세포 계수에 사용된 정확한 부피를 기록합니다.
참고: 효소 배지 배양 시간은 배양 내 교모구의 크기에 크게 좌우되며, 사용 전에 항상 육안으로 점검하고 적절히 채택해야 합니다. - 대표적인 10 μL 단일 세포 현탁액을 1.5 mL 마이크로 원심분리관 안에서 10 μL 트리판 블루와 부드럽게 섞습니다. 이 혼합물의 10 μL을 혈액세포계나 자동 세포 계수기에 투여하여 생존 가능한 세포를 결정합니다.
- 웰당 500개의 단일 교모세포를 초저부착 96웰 구형 마이크로플레이트에 시딩합니다. 최적의 파종 밀도는 환자 샘플마다 다를 수 있습니다.
- 웰당 1 μg/mL 프로피디움 요오드화물(PI)과 0.05 μL 산화철 나노입자를 추가합니다(예: 20개의 구상체에 1.5 μL 자기 나노입자를 사용하며, 이는 약 10,000개의 단일 세포에 해당합니다). 첨가 전에 100 μL로 설정된 P100으로 피펫팅하여 산화철 나노입자를 균질화합니다.
참고: 사용되는 산화철 나노입자의 부피는 사용되는 세포주에 따라 최적화할 수 있으나, 이 경우 10,000 세포당 1.5 μL만으로도 구체를 중심에 위치시키기에 충분했습니다. 이 구조는 환자 샘플 간 구체 크기를 일정하게 보장하여, 침투 분석 중 침입 및 성장 역학을 직접 비교할 수 있게 합니다. - 교모구체 형성을 위해 37°C, 5%CO2 , 21%O2 의 가습 배양 인큐베이터에서 48시간 동안 배양판을 배양합니다.
그림 1: 철산화물 나노입자와 함께 배양된 균일한 크기와 위치의 교모구. (A) 새로 진단되고 재발한 환자 종양에서 유래한 교모구는 이중 표현형과 무작위 세포 간 연관성을 보입니다. (B) 씨앗 후 48시간 이내의 균일한 크기의 구형 형성 도식. (C) (상단 패널) 없이(하단 패널) 철산화물 나노입자가 포함된 둥근 바닥 구형 마이크로플레이트에서 48시간 동안 배양된 교모구의 투과광 이미지. 철산화물 나노입자가 포함된 교모구체의 어둡고 얼룩진 모습을 주목하세요. (D) 나노입자 없이 배양된 교모구의 무작위 위치 측정(위)과 비교하여 나노입자로 배양된 교모구의 일관된 중심 위치 측정(아래)으로 배경 잡음이 줄고 화질 향상. 스케일 바 = 100 μm. Biorender.com 로 만든 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
2. 세포외기질(ECM) 코팅된 다중 웰 플레이트 준비 (이동 분석 1시간 전)
- 제조사 지침에 따라 ECM을 분리하여 보관하세요. ECM 1mL 알리코트(1:10 희석)를 4°C에서 얼음 위에서 천천히 하룻밤 녹입니다. 도금 직전에, 얼음처럼 차가운 완전 신경구체 매질에서 1:10 스톡을 추가로 1:10 희석하여 1:100(v/v) 비율로 최종 작동 용액을 준비합니다. 희석된 ECM은 조기 중합을 방지하기 위해 항상 얼음 위에 보관하세요. 이 희석은 항상 얼음 위에 보관하세요. ECM은 상온에서 빠르게 중합됩니다.
- 1:100 ECM 작업 용액 50 μL을 96웰 투명 평평 바닥판 또는 μ클리어 바닥판의 각 웰에 투여합니다. 각 웰에서 ECM이 굳어지고 얇은 매트릭스를 형성할 수 있도록 37°C에서 최소 1시간 정도 배양하세요.
- 배양 후에는 각 웰에서 30 μL을 조심스럽게 제거하고, 각 웰 바닥에는 20 μL의 중합 ECM(최종 농도 1:100 v/v)을 코팅합니다. ECM은 이 기간 동안 가능한 한 차갑게 유지해야 하며, 이는 실온에서 빠르게 중합되기 때문입니다. 이 과정에서 영상판은 미리 냉각되어 얼음 위에 보관할 수도 있습니다.
3. 영상 플레이트 설치 및 라이브 셀 영상
- 분석 당일(교모구체 시딩 48시간 후)에 ECM 코팅된 마이크로플레이트를 그림 2B, C에 표시된 자기 96웰 플레이트 드라이브에 올려놓습니다. 자기 플레이트를 70% 에탄올로 분사하고 닦아 말려서 소독하세요. 담그지 마세요.
- 구형의 품질과 균일성을 육안으로 점검하세요. 피펫을 사용해 각 웰에서 단일 교모구를 포함한 80 μL 배지를 옮기고, ECM 표면이 있는 플레이트에 부드럽게 피펫을 옮깁니다.
참고: 특히 큰 구형의 경우, 이동 시 전단 응력을 최소화하는 데 주의해야 합니다; 이는 P100 피펫 팁의 끝부분에서 가위로 1-2mm 정도 잘라내어 입구를 넓히고 기계적 손상을 줄이는 방식으로 달성할 수 있습니다. 사용 전에 가위를 자외선 아래에서 반드시 소독하세요. 무엇보다도, 기포 추가를 최소화하는 것이 중요합니다. 이는 영상에 큰 영향을 미치기 때문입니다. - 실험 설계에 따라 구체를 처리하세요. 처리 용액을 원하는 농도로 20 μL 부피로 준비한 후, 각 구체가 포함된 각 웰에 이 20 μL를 첨가하여 최종 부피 100 μL에 도달합니다.
참고: 이렇게 교모구를 처리하면 피펫팅이 줄어들고 구체체가 웰에서 제거될 위험도 최소화됩니다. - 플레이트를 자기 드라이브에 남긴 채 이미징 시스템으로 옮겨 실시간 이미징을 합니다. 플레이트를 자기 홀더에서 분리할 때는 주의하고, 구체가 우물 중심에서 움직이지 않도록 최대한 곧게 유지하세요.
- Plan-Apochromat 5x/0.35 NA 대물렌즈, 0.5배 튜브 렌즈, Axiocam 506 카메라(binning =2), Zen 3.1(Blue Edition) 소프트웨어를 장착한 프로그래밍 가능한 역전세포 현미경을 사용해 라이브 이미징을 수행합니다. 픽셀 투 마이크론 보정은 영상 시스템에 내장되어 있으며 소프트웨어가 자동으로 처리하므로 수동 보정이 필요하지 않습니다. 이 경우, 2.5배(5배 대물렌즈, 0.5배 튜브 렌즈)로 촬영하고, 카메라를 2 x 2로 비잉하여 1 픽셀 = 3.645 μm의 보정을 수행합니다.
- 가스 믹서에서 나오는 공기 흐름을 매우 느리게 유지하면서, 환경 조절 장치를 1% 산소와 5%CO2 로 조절하세요. 이는 가습 병을 통과하는 공기가 들어올 때 원치 않는 증발을 방지하는 데 도움이 됩니다.
- 초기 영상 촬영 기간 동안 교모구(gliomasphere) 변위를 방지하기 위해 현미경의 스테이지 가속과 속도를 10%로 줄여 구형 부착 전 ECM 표면을 가로지르는 움직임을 최소화합니다.
- 자기 구동 없이 멀티웰 플레이트를 현미경에 부드럽게 넣으세요. 해당되는 경우, 소프트웨어에서 판 재질을 선택하여 광학 부품이 일치하도록 조정해야 합니다.
- 침습 시야 전체를 포괄하는 적절한 확대 렌즈를 사용하세요. 예를 들어, 셀 디스커버러 7에서는 5배 대물렌즈와 0.5배 튜브 렌즈를 선택해 2.5배 배율을 제공했습니다.
- 각 교모구를 찾아 x-y-z 좌표를 포함하는 위치를 집중 및 할당하세요. 하드웨어 자동 초점이 가능하다면 실험 내내 동일한 초점면의 일관된 영상 촬영을 보장하는 데 사용해야 합니다.
- 위상 그라데이션 대비(투과광)와 형광 채널을 모두 확인하고, 노출 시간과 빛 세기를 조절해 과노출이 없는지 확인하세요. 590nm LED를 이용해 프로피듐 요오화물(죽은 세포 염색)을 여기합니다. 쿼드 밴드패스 필터를 사용하여 618–756 nm 파장 대역을 포착하여 방출을 수집합니다. 이는 필터와 광원에 따라 다른 현미경에 따라 다를 수 있습니다.
- 원하는 일수 동안 매시간 사진을 찍도록 설정하세요.
그림 2: 영상 플레이트 설치 설명. (A) 설명된 프로토콜을 나타내는 회로도. (B) 자기 판 구동장치 인접한 다중 웰 판의 이미지 및 자기 구동 장치 위에 멀티웰 판을 단순하게 장착하는 것, 각 자석이 각 웰 중앙에 위치하여 교모구의 위치를 촉진하는 방식. Biorender.com 로 만든 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
4. 다중화 단백질 분석을 위한 침투 분석 후 구체의 고정 현상(그림 3)
- 침입 분석이 완료된 후, 각 우물에 100μL PBS를 세척합니다. 이렇게 하면 부피가 200 μL/well이 됩니다. 이 과정을 반복하여 PBS 100 μL를 제거하고 추가로 100 μL PBS로 교체합니다.
- 배지 200 μL을 조심스럽게 제거한 후, 각 웰에 4% 파라포름알데히드(PFA) 100 μL 첨가하여 훈기 후드 아래 실온에서 10분간 배양합니다.
주의: 파라포름알데히드는 독성 화학물질이므로 위험이나 노출을 최소화하기 위해 주의해야 합니다. - 고정 후에는 각 웰에서 PFA를 제거하고, PBS를 3번 세척하여 PFA를 제거하고 매번 100mL PBS를 첨가합니다.
- 제조사 지침에 따라 면역 염색을 추가하세요. 또는 장기 보관을 위해서는 PBS에 아지드나트륨(0.02%)을 첨가하여 멸균을 유지하고 투명 필름으로 플레이트를 밀봉합니다. 필요할 때까지 4°C에서 보관하세요.
그림 3: 웰 중앙과 가장자리에 위치한 교모구의 이동 분석 후 대표적인 단백질 분석. 이주 후 분석에서 교모세포종 줄기세포 표지 CD44를 표적으로 하는 항체로 면역염색한 반복 교모구의 레이저 스캐킹 공초점 현미경. CD44-FITC(녹색)와 Hoechst(핵, 파란색). 스케일 바 = 100 μm. 화살촉은 우물의 가장자리를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
5. 환자 유도 이동 역학의 이미지 처리 파이프라인
참고: 우리 데이터셋 경험에 따르면, WEKA 처리는 높은 코어 수를 가진 멀티코어 프로세서와 상당한 메모리를 갖추는 것을 권장합니다. WEKA 처리는 높은 코어 수를 자랑하며 데이터셋 크기에 따라 사용 가능한 메모리를 활용할 수 있기 때문입니다. 사용 사양 및 권장 사양은 아래에 나열되어 있습니다. 이 워크플로우에서는 GPU 처리가 사용되지 않는다는 점에 유의하세요.
CPU: >= 6코어 | >= 2 GHz (권장); 32코어 | 2.1 GHz (사용)
메모리: > 32GB (권장); 192GB (사용)
- Open Fiji13 [현재 포함된 ImageJ-win64.exe 실행 파일이 분석에 사용됨]. 파일 >로 탐색하여 이미지를 엽니다 – Open Select 다중 채널, 다중 장면 타임랩스 이미지 파일(.czi)은 피지 인터페이스에서 열립니다(스크립트를 사용할 경우 보조 파일 1).
- GUI에서 필요한 이미지를 선택하세요. 실험에서 가장 침습적인 교모구가 분류기(즉, 대조군 – DMSO)를 처음에 훈련시키는 것이 가장 효과적입니다. 이 이미지는 각 구간, 즉 침입/이동 세포의 외관, 구체, 배경의 특징을 제공합니다.
- 그 다음 이미지 > 컬러 > 분할 채널 로 이동하세요 - 이 채널은 이미지를 두 개의 채널로 나누는데, 하나는 프로피디움 아이오다이드 염색 채널이고, 다른 하나는 투과된 빛을 처리하는 채널입니다.
- 분할 채널을 선택하세요 – 이 경우 이동 역학을 나타내는 투과된 빛 채널입니다. 플러그인 > 세분화 > Trainable WEKA 세분화로 이동하세요 14.
- 두 기본 클래스를 다음과 같이 이름 변경하세요: 클래스 1: 교모구(Gliomasphere); 클래스 2: 침공/이주. 배경(Background)이라는 세 번째 클래스(선택 사항이지만 권장)를 설정에서 새 클래스 > 배경> 탐색하면 됩니다.
- Freeline 도구를 사용해 각 이미지 스택과 클래스 내에서 대표적인 영역에 그려 훈련 영역에 주석을 달아, 즉 구체에 소용돌이를 그려 ' 구상체에 추가 '를 클릭하세요. 침입 영역과 배경에 대해 이 과정을 반복하여 모든 영역이 각 클래스에 모두 표시될 때까지 반복합니다. 분류기를 훈련하려면 '분류기(Train Classifier)'를 클릭하세요. 필요하다면 분류기를 더 훈련시키기 위해 추가 이미지에 주석을 달아 정확도를 높일 수 있습니다.
- 만족하면 학습된 분류기 모델을 CellLine_Treatment_Classifier.model과 같은 파일 이름으로 저장하세요. 세그멘테이션 창이 완료되면 닫으세요.
- 저장된 분류기를 사용하는 새 이미지는 플러그인 > 세분화 > Trainable WEKA 세그멘테이션 >분류기 로드> 저장된 분류기 CellLine_Treatment_Classifier 열 기로 가세요 (.model 파일 저장 스크립트 실행 전에 이 자료를 준비하는 것이 보조 파일 2 의 한 가지 요건입니다. 스크립트가 시작되면 적절한 샘플 파일을 선택해야 합니다).
- Trainable WEKA 분할 인터페이스에서 Navigate to Get 확률 - 이 인터페이스는 선택한 각 클래스(예: 교모구, 침입/이동, 배경)에 대해 확률 지도를 생성하며, 이미지에 할당된 각 픽셀 값이 특정 클래스나 영역에 속할 가능성을 나타냅니다. 이 작업은 각 이미지마다 32비트 다이내믹 레인지를 가진 확률 맵(Gliomasphere, Invasion, Background) 3개의 별도 이미지를 생성합니다.
- 침략/이주에 해당하는 확률 지도를 선택하세요. 하이퍼스택 이미지를 > 탐색> 차원을 줄이세요. 출처 유지를 선택하세요.
- 채널은 체크를 해제하되 프레임은 유지하세요 - 이렇게 하면 시간이 지남에 따라 맵이 단일 채널로 줄어듭니다. 이 경우 침공 확률 맵입니다. 글리오마스피어에 해당하는 확률 지도를 선택하세요.
- 5.10-5.11 단계를 반복합니다. 이제 이동 장면과 구체 영역에 대해 원래 전송된 빛의 타임랩스 이미지에 대응하는 두 개의 확률 지도가 생깁니다. 두 파일을 모두 다음과 같은 파일 이름 규칙으로 저장하세요: ImageName_Scene_Gliomasphere_ProbabilityMap와 ImageName_Scene_Invasion_Probability Map을 선택한 실험에 대응하는 폴더, 즉 CellLine_Treatment.
- 이진 마스크를 만들기 위해 임계값을 설정하세요: 이미지로 가 서 > 임계값을 조정하세요>. 임계값 방법(예: Yen, Otsu)을 선택하세요. 선택한 방법은 모든 처리된 이미지에서 동일하게 유지하세요.
- 분석> 측정값을 설정하세요. 원하는 측정값 선택; 틱 면적, 통합 밀도, 평균을 입력한 후 확인 버튼을 누르세요. 분석> 입자 분석으로 탐색하세요. 침공/이주 시 세트 크기: 0 – 무한대; 순환도: 0.00 – 1.00. 교모구의 경우 세트 크기: 일반적으로 1500 – 무한대(세포주/처리의 구체 크기에 따라 필요에 따라 조정 - 대조구 구체는 자연스럽게 더 커집니다); 순환성: 0.05 – 1.00. 모든 사람에게 픽셀 유닛을 선택하세요.
- 분석>픽셀 분석> 보기: 마스크 선택. 마스크가 생성된 후에는 타임랩스 스택 전체에 걸쳐 관심 영역이 세분화되어 정확한 추적을 보장합니다. 이진 연산을 Process > 적용 이진 > ... (예: 구형 마스크를 정제할 때 '구멍 채우기'를 선택), '분석 > 입자 분석> 보여주기> '아무것도 선택하지 않음', '요약하기'로 이동하세요. 이 도구는 선택된 측정값의 요약 창을 제공합니다.
- 결과를 저장하려면 파일 > 결과 저장 > 클릭하세요. .csv 파일로 저장하세요. 스프레드시트나 다른 분석 소프트웨어에서 열어보세요.
- 모든 분할 클래스(예: 교모구, 침입)에 대해 임계값 조정과 입자 분석을 반복하여 시간에 따른 측정값을 추출합니다. 출력 .csv는 시간에 따라 면적(픽셀 또는 마이크론 단위, 보정에 따라 다름)을 제공합니다.
- PI 염색을 나타내는 형광 채널(예: 채널 2)을 선택하세요. 위에서 언급한 임계값 측정과 입자 분석을 적용하여 죽은 세포를 식별합니다. Calculator Plus 플러그인을 사용해 PI 양성 세포의 마스크를 교모구체 마스크와 곱하고, 침범 마스크와 각각 곱하여 특정 부위의 죽은 세포를 정량화하세요.
- 마스크, 확률 지도, 요약 표를 TIFF 및 CSV 파일로 내보내고, 문서화 및 후속 분석을 위해 명확하고 설명적인 파일 이름을 제공합니다. 보충서에 제공된 스크립트를 사용할 때는 다음과 같은 명명 규칙을 찾을 수 있습니다: FileName_Scene#_(PI-)Invasion_Summary.csv (시간에 따른 객체 데이터), FileName_Scene#_(PI-)Invasion.zip (분석 입자로 정의된 영역).
참고: 보조 파일 1은 각 장면별로 타임랩스 이미지가 포함된 단일 tif 파일을 생성합니다. 보조 파일 2 는 모든 장면과 각 타임랩스의 모든 이미지에 대해 미리 정의된 분류 모델 파일을 기반으로 WEKA 픽셀 분류를 실행하여 교모구와 침입 세포의 확률 지도를 제공합니다. 보조 파일 3은 모든 이미지를 교모구와 침입 세포로 구분하고, 사망(PI-양성) 세포가 덮는 영역과 영역의 구분을 정량화합니다. 보조 파일 4 는 특정 임계값 방법과 분석할 특정 영역을 가정하며, 보조 파일 3 은 사용자가 임계값을 설정하고 각 장면별로 영역을 조정할 수 있게 합니다. 임계값은 각 장면별로 다른 메서드로 변경해서는 안 되며, 각 객체별로 다른 메서드로 설정할 수 있습니다.
그림 4: 교모구의 부실한 분할로 인한 재현 가능한 이미지 처리 문제. 피지에서 훈련 가능한 WEKA 분할 플러그인을 사용한 이미지 처리 파이프라인에서는 (A) 중심에 국소화된 교모구가 배경에 더 많은 이동 면적 분할을 보인 반면, (B) 교모구는 가장자리에 국한되어 있어 이미지 분할이 불완전하고 복제가 불가능해졌습니다. 교모구의 위치 지정에 일관성을 보장함으로써, 생물학적 복제체 간 이미지 처리가 (A)에서 보듯이 나타나 분석의 재현성과 자동화가 크게 향상됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
결과
저산소 상태에서 설명된 3D 이동 분석을 사용하여, 재발 환자 종양의 교모구는 차량 또는 약물 X로 치료되었고, 침윤 역학은 72시간 동안 매 시간마다 모니터링되었습니다. 그림 5 는 침윤 역학에 대한 WEKA 분할 분석을 설명하며, 임상적으로 관련 있는 저산소 조건에서 약물 X가 차량 대조군에 비해 재발성 교모구의 침습 가능성을 유의미하게 감소시킨다는 것을 보여줍니다.
약물 X가 이동 후 줄기세포 특성에 미치는 영향을 추가로 평가하기 위해, 교모구체를 고정하고 면역염색하여 교모세포종 줄기세포 표지자 CD44의 발현 및 위치를 확인하였으며, 이는 그림 6에 나타난 것이다. 이 다중화 분석은 이동 역학과 줄기세포 표지 발현의 시각화를 용이하게 하여, 임상적으로 중요한 저산소 상태에서 약물 X가 재발성 교모세포종 모델의 침습적 잠재력과 줄기유사 특성을 어떻게 조절하는지에 대한 통찰을 제공합니다.
그림 5: 최적화된 이동 분석법은 새로운 약물 X가 반복적인 교모구의 이동을 예방하는 데 효과적 임을 강조합니다. 환자들은 저산소 상태에서 차량 또는 약물 X로 72시간 동안 치료를 받아 재발성 교모구를 얻었습니다. 침입 역학은 72시간 동안 매 시간마다 포착되었습니다. (A) 0시간과 72시간의 침입 역학을 대표적으로 투과한 빛 이미지가 상단 패널 - 차량 처리, 하단 패널 - 약물 X 처리됨. (B) 분할 분석에 사용되는 침입 지역의 대표성 확률 지도. (C) 약물 X로 치료된 재발성 교모구는 차량 치료된 교모구에 비해 침습성이 현저히 낮았다. 72시간 침습 부위의 정량화는 고정 시점에 덮인 전체 면적으로 표시된 약물 X 치료의 교모구에서 침범이 유의미하게 감소함을 보여주었습니다. 데이터는 n=3개의 독립적인 복제에 따른 침입 지역을 나타냅니다. 통계적 유의성은 비쌍 t-검정을 사용하여 평가하였으며; p < 0.005는 **로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 6: 처리 후 이동 및 줄기세포 표지 발현. 그림 5 에 설명된 교모구는 이동 후 고정되었고, 교모세포종 줄기세포 표지 CD44를 표적으로 하는 항체를 이용해 면역염색을 하여 치료체 또는 약물 X 치료를 받았습니다. 이 그림은 표준 면역염색 기법을 사용하여 수행할 수 있는 다중화 이동 후 분석 유형을 보여줍니다. 이미지에는 CD44-FITC(녹색)와 Hoechst(핵, 파란색)가 나와 있습니다. 스케일 바 = 200 μm. 이 수치의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.
보조 파일 1: 현미경에서 멀티씬 CZI 파일을 단일 씬으로 TIF 파일로 재저장하기.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보조 파일 2: Weka 모델을 이용한 확률 지도 생성.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보조 파일 3: 임계값 없는 세분화 분석. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보조 파일 4: 임계값을 가진 세분화 분석. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
토론
교모세포종과 같은 매우 공격적인 종양의 침습적 역학을 모델링하는 것은 질병 과정에 대한 이해를 높이고 더 효과적인 치료 전략을 찾는 데 매우 중요합니다. 교모세포종 세포 이동의 복잡하고 적응적이며 가소적인 특성은 개별 교모세포가 중심 종양 덩어리에서 이동할 때 나타나는 동적 행동을 정확히 포착할 수 있는 전임상 모델이 필요합니다. 중요하게도, 질병의 다양한 단계에서 환자 유래 샘플을 모델링함으로써 연구자들이 종양 이질성 문제를 더 잘 해결하고 침윤 역학에서 단계별 변화를 식별할 수 있습니다.
이러한 복잡성을 고려할 때, 전임상 모델도 동등한 수준의 정교함을 가질 것이라고 합리적으로 추정할 수 있습니다. 여기서는 철산화물 나노입자와 함께 균일한 크기의 환자 유래 교모구를 생성하는 정교한 방법을 설명합니다. 이 접근법은 각 웰 중심의 교모구를 제어하여 침입 역학을 자동으로 생세포 영상화할 수 있게 합니다. 여러 연구에서 기존 3D 배양 방법을 사용할 때 구형 크기, 형태, 성장 속도론에 상당한 변동성이 있음을 강조했으며, Sayde와 동료들은 구체가 분류되지 않은 암 줄기세포 집단과 분리된 세포 사이에 넓은 직경 분포를 보일 수 있음을 보여주었으며, 이는 구형 형성의 고유한 변동성을 반영합니다15,16. 이러한 이질성은 구형 기반 약물 스크리닝 분석에서 재현성 문제의 주요 원인으로도 확인되었으며, 균질한 구형 집단을 생성하는 것의 중요성을 더욱 강조합니다12. 이러한 발견은 기능 분석을 수행하기 전에 구형 형성 조건을 표준화하는 필요성을 강조하며, 이 방법이 직접 해결하는 도전 과제입니다. 구형 크기와 위치를 표준화함으로써 재현성을 크게 높이고 3D 세포 배양 시스템에서 불균등한 구형 형성이 후속 분석에 영향을 줄 수 있는 변동성을 최소화합니다.
이 분석법의 초기 개발 과정에서 복제체 간 구상체 위치 현상에 상당한 변동성이 있었으며, 통계적으로 유의미한 결과를 얻기 위해서는 실험당 많은 수의 우물과 많은 생물학적 복제가 필요했습니다. 이로 인해 작업량이 크게 증가했을 뿐만 아니라 상당한 양의 사용 불가능한 데이터가 생성되고, 분석 효율성과 재현성이 저하되었습니다. 따라서 이로 인한 변동성은 침입 행동의 차이보다는 정량화 가능한 데이터의 손실을 반영한 것입니다. 각 웰 내에 교모구를 중앙에 집중시킴으로써, 자기적 위치 지정은 침입 역학의 생물학적 차이가 관찰되더라도 모든 복제체의 이미지를 일관되게 분할하고 분석할 수 있게 합니다.
산화철 나노입자의 도입은 부드러운 자기력을 도입하여 교모구를 모든 유정에 일관되게 집중시키며, 이미지 처리 파이프라인, 데이터 처리, 이동 후 분석의 성능을 크게 향상시키면서도 교모구의 생물학이나생존 가능성에 영향을 주지 않습니다. 이 시스템의 주요 장점은 이동 후 다중화 분석과의 호환성입니다. 예를 들어, 그림 6 은 교모세포종 줄기세포 표지 CD44의 시각화를 나타내며, 이는 환자 샘플 간 이동 및 치료 후 줄기세포 유사 발현을 평가할 수 있게 합니다. 이 능력은 침습적 표현형과 분자 특징을 연결하는 통합 연구의 잠재력을 강조하며, 미세환경 신호에 반응하는 교모세포종 줄기세포의 표현형 가소성과 치료를 회피하여 불가피한 종양 재발을 촉진하는 능력을 고려할 때 중요한 고려사항입니다.
이 분석법은 단일 구형 침입 역학의 시각화 재현성을 크게 향상시키지만, 향후 분석의 최적화를 위해 고려해야 할 몇 가지 중요한 한계점이 여전히 존재합니다. 마트리젤은 널리 사용되는 기저막 모델이지만, 쥐 육종에서 유래한 복잡하고 정의되지 않은 세포외기질(ECM) 대체물로, 인간 뇌 미세환경을 완전히 재현하지는 못한다. 향후 분석법의 최적화는 뇌종양 미세환경을 더 잘 모방하기 위해 뇌 특이적 ECM 모델을 통합할 수 있으며, 이는 시험관 내 뇌 침범 모델의 필수 최적화 단계라고 믿습니다(18,19). 마트리젤은 여전히 널리 채택된 ECM 모델이지만, 쥐 육종에서 유래한 비뇌 특이적 세포외기질을 나타냅니다. 따라서 인간 뇌 미세환경의 생화학적 및 기계적 특성을 완전히 재현하지는 못합니다. 중요한 점은, 여기서 설명된 자기 위치 추적 전략이 매트릭스에 독립적이며, 향후 연구에서 뇌 특이적 ECM 시스템에 쉽게 적용되어 생리학적 관련성을 더욱 높일 수 있다는 것입니다.
이 분석법의 다른 고려사항은 침입 형태의 샘플 이질성과 변이로 인해 각 세포주별로 새로운 WEKA 분할 모델을 훈련시키는 잠재적 필요성입니다. 또한, 각 세포주와 구형 유형별로 시딩 밀도와 나노입자 농도를 최적화하여 고처리량 이동 분석의 균일성과 생존 가능성을 유지해야 합니다. 이러한 한계에도 불구하고, 이 플랫폼은 환자별 교모세포종 침윤과 치료 반응을 연구할 수 있는 확장 가능하고 적응 가능한 프레임워크를 제공합니다. 생세포 영상, 자동 분할 파이프라인, 다중화 후 분석과의 호환성은 환자 종양의 매우 이질적인 샘플에서 침입에 대한 고함량 스크리닝, 복합요법, 기전적 침윤 연구의 기회를 열어줍니다. 더 나아가, 이 분석을 성상교세포, 뉴런, 미세교세포와 같은 상주 뇌세포나 혈액뇌장벽 상호작용 모델과 같은 공동 배양 시스템으로 확장하면 교모세포종의 진행과 재발을 유발하는 종양 기질의 상호작용에 대한 추가 통찰을 얻을 수 있습니다.
재현성과 전체 분석의 성능을 결정하는 중요한 요인으로 평가 개발 과정에서 여러 기술적 단계가 확인되었습니다. 분석 전에 세포주의 씨앗 밀도를 표준화하면 초기 교모구의 크기가 일정하게 유지되어, 세포주, 처리 및 조건 간에 구형 성장 역학을 비교 가능하게 합니다. 이 표준화 단계가 없으면 초기 구형 크기는 상당한 변동성을 더하며, 이는 교세포구의 실험 조건 반응 변화를 반영할 수 있습니다. 각 유정 내에서 교모구의 정밀한 중앙 위치 지정은 정확한 자동 이미지 획득과 하위 분할의 핵심 요구사항입니다. 중심에서 벗어난 구형체는 상당한 영상 노이즈를 발생시키고, WEKA 분할을 통해 이미지를 명확히 정의된 영역으로 분할하는 수단으로 사용할 수 없게 만듭니다. 모든 교모구가 중심에 국한되도록 함으로써, 동일한 WEKA 분류기를 여러 번 사용할 수 있어 노이즈가 크게 줄어들고 화질이 크게 향상됩니다. 이 표현의 형태는 그림 1에 나와 있습니다. 따라서 자기 산화철 나노입자의 도입은 교모구의 중심 위치를 보장하고 위치 변동성을 최소화하며 복제체 간 이미지 처리 및 비교 가능성을 크게 향상시키는 방법입니다. 마지막으로, WEKA 파이프라인 내의 세분화 모델 훈련은 추가적인 중요한 표준화 단계를 의미합니다. 환자 간 이질성과 침습 형태의 차이로 인해 단일 분할 모델이 모든 샘플에 일반화되지 않을 수 있습니다. 각 세포주에 대한 분류 매개변수를 재학습하거나 정교하게 조정하면 침입 지역의 확률 지도가 정확해지고 정량화 오류를 방지할 수 있습니다.
전반적으로 이 분석법은 환자 유래 교모세포종 샘플의 동적 침습 행동을 실시간으로 연구할 수 있는 재현 가능하고 확장 가능한 플랫폼을 제공합니다. 다중화 영상 및 하위 분자 분석과의 호환성은 기초 및 중개 교모세포종 연구 모두에 강력하고 다재다능한 도구로 작용하여 전임상 교모세포종 모델의 번역적 관련성을 크게 높일 것입니다.
공개 사항
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감사의 글
이 연구는 Research Ireland(Science Foundation Ireland)의 지원으로 보조금 코드 20391A01과 보건 연구 위원회의 지원으로 ERA-TRANSCAN-2022-002를 지원했습니다. 세포는 토론토의 SickKids Dirks 연구소와 로테르담의 Erasmus Medical Center(EMC)에 있는 협력자들이 친절하게 제공해 주었습니다.
재료
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| 나노셔틀-PL | 그라이너 | 657841 | 1.5 µ l/10,000 셀 |
| 페니실린 - 스트렙토마이신 | 머크 | P4333 | 1% |
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