도크소루비신 심독성 마우스 모델에서 심실 심근세포 분리

요약

이 프로토콜은 독소루비신 유도 심독성 모델에서 생존 가능한 성인 마우스 심실 심근세포를 분리하는 재현 가능하고 랑겐도르프 없는 방법을 설명합니다. 이 방법은 좌심실 전향성 직접 관류와 조절된 효소 소화를 사용하여 구조적, 분자적, 기능적 분석에 적합한 칼슘 내성 간상형 근세포를 생성합니다.

초록

독소루비신(DOX)은 주로 심실에 영향을 미치는 진행적이고 용량 의존적인 심장독성으로 인해 임상적 적용이 제한되는 효과적인 화학요법 약물입니다. 이러한 맥락에서 세포 손상 기전을 연구하려면 성인 심근세포의 신뢰성 있는 분리가 필요하며, 이는 병들었거나 구조적으로 취약한 심장에서는 기술적으로 어려운 과정입니다. 여기서는 DOX 유발 심독성을 가진 마우스에서 기능성 심실심근세포를 분리하기 위한 단순화되고 재현 가능한 랑겐도르프 무첨가 프로토콜을 설명합니다. C57BL/6 마우스에서 DOX 모델을 확립한 후, 심장을 신속히 절제하고 대동맥을 체외에서 클램프합니다. 비순환성 전향 관류는 칼슘 프리 및 효소 함유 완충제를 사용하여 좌심실을 통해 직접 수행됩니다. 소화된 심실 조직의 부드러운 기계적 해리를 통해 개별 심근세포가 생성되고, 이후 칼슘 내성을 회복하기 위해 통제된 칼슘 재도입이 이루어집니다. 이 방법은 면역형광, 근절 조직 분석, 세포자멸사 검출, 분자 신호 전달 연구 등 후속 분석과 호환되는 고품질의 생존 가능한 막대형 심근세포를 제공합니다. 전문 랑겐도르프 관류 장비의 필요성을 없애함으로써, 이 프로토콜은 DOX 유발 심장 손상 기전을 조사하는 실험실에 접근성 높고 접근성 높은 해결책을 제공합니다.

서론

독소루비신(DOX)은 강력한 안트라사이클린 화학요법제이지만, 누적된 심장독성으로 인해 확장성 심근병증과 심부전으로 진행될 수 있어 임상적 효용이 제한됩니다 ^1,2. 심근세포 세포자멸사는 이 독성에서 핵심적인 병원성 과정^중 하나이며^(3,4,5), 이러한 세포 사건을 연구하려면 DOX 손상 심장에서 유래한 기능성 성인 심근세포에 신뢰성 있게 접근해야 합니다. 그러나 DOX 노출은 심근세포를 구조적으로 취약하게 만들고 대^{사적으로 손상}시켜 격리 중 효소 및 기계적 스트레스에 크게 민감해지고 생존율이 낮아집니다. 더 넓은 문헌 내에서 Langendorff 관류는 성인 심근세포 분리의 주된 방법으로 남아 있습니다^. 하지만 손상된 심근에 적용할 때는 주목할 만한 제한이 있습니다. 이 방법은 특수 장비, 정밀한 대동맥 캐논리, 그리고 상당한 기술적 숙련도를 요구합니다; DOX 처리된 심장에서는 랑겐도르프 관류 중 추가적인 기계적 스트레스가 세포 손상을 악화시켜 불안정하고 종종 최적이 아닌 결과를 초래할 수 있습니다⁸.

이러한 도전을 극복하기 위해, 우리는 급성 DOX 유발 심독성 마우스 모델에서 칼슘 내성 성인 심실성 심근세포를 분리하는 간소화되고 접근 가능한 프로토콜을 수립^{하였습니다.} 기존의 랑겐도르프 관류를 없애고 좌심실을 통해 직접 통제된 체외 전행 관류를 시행함으로써 허혈성 노출을 최소화하고 심근의 기계적 조작을 줄입니다. 이러한 특징들은 수술 일관성을 개선하고 손상된 심장에서 유래한 취약한 심근세포의 생존율을 높일 것으로 기대됩니다 ^7,10.

현재 접근법은 Langendorff 없는 심근세포 분리의 신흥 진보를 기반으로 하여, 성숙한 수축 구조와 칼슘 처리 특성을 보존해야 하는 성인 심실 세포로 이 개념을 확장하는데, 이는 주로 신생아 심장을 위해 개발된 단순화된 소화 방법으로는 충분히 지원되지 않는 특징들입니다^11,12. 따라서 이 프로토콜은 전문 관류 시스템이 없는 실험실에 실용적이고 재현 가능한 대안을 제공합니다. 분리된 심근세포는 구조적 완전성을 유지하며, 근절 분석, 면역형광 영상, 세포자사멸사 신호 전달 연구 등 다양한 후속 응용에 적합하여 생리학적으로 중요한 맥락에서 DOX 유발 심장 손상의 직접적인 기전 연구를 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 DOX 손상 심장에서 생존 가능한 심근세포를 분리하는 데 있어 중요한 미충족 수요를 해결합니다.

프로토콜

모든 동물 시술은 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 기관 및 국가 지침에 따라 수행되었으며, 시안교통대학교 기관 동물 관리 및 이용 위원회(승인 번호)의 검토 및 승인을 받았습니다. XJTUAE2022-1441년). 사용된 소모품, 시약, 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. C57BL/6 마우스에서 DOX 유발 급성 심장독성 모델 구축

1. 동물 준비: 8-12주 된 수컷 C57BL/6마리 쥐(24-28g)를 사용하세요. 표준 환경에서 12시간 빛과 어둠 주기를 가진 집 동물과 자유 롭 게 먹이와 물을 사용할 수 있습니다. 쥐를 무작위로 DOX 처리 또는 식염수 대조군(n=3개)에 배정합니다.
2. DOX 행정
   1. 멸균 식염수에 1.5 mg/mL의 신선한 DOX 용액을 준비하세요. 용기를 알루미늄 호일로 감싸서 빛으로부터 용액을 보호하세요.
   2. 각 마우스의 무게를 재고 단일 복강 내 주입량인 15 mg/kg의 주입량을 계산하세요^13,14.
   3. 마우스를 부드럽게 묶고 복강내 주사 로 DOX 용액을 투여하세요. 쥐를 다시 우리에 넣고 실험 일정에 따라 진행하세요.
      주의: DOX는 세포독성 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비(실험복, 장갑, 안구 보호구)를 착용하고, 시약을 지정된 화학 안전 구역에서 다루세요.
3. 일정 및 모니터링: 쥐의 전반적인 건강과 행동을 매일 모니터링하세요. 이틀에 한 번씩 체중을 기록하세요. DOX 주입 후 7일 후에 심근세포 분리를 수행하세요.

2. 심근세포 분리를 위한 용액 및 외과적 도구 준비

1. 완충 준비: 이 용액들의 상세 준비 방법은 보충 표 1 을 참조하십시오.
   1. 관류 완충제와 EDTA 완충제를 준비하세요. NaOH를 사용해 모든 용액의 pH를 7.4로 조정하세요.
   2. 콜라게나제 II형, 콜라겐제 IV형, 프로테아제 XIV를 포함한 효소 소화액을 조제하고, 관류 완충제를 사용합니다.
   3. 수류 완충제에 5% 태아 소 혈청(FBS)을 보충하여 정지 완충제를 준비합니다.
   4. 0.1% 소 혈청 알부민(BSA), 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS), 10 mM 2,3-부타네디온 모녹심(BDM), 지질 농축액, 그리고 페니실린/스트렙토마이신(P/S)을 M199 배지에 첨가하여 완전한 배양 배지를 준비합니다.
   5. 최종 칼슘 농도가 각각 0.34 mM, 0.68 mM, 1.02 mM의 최종 배양액에 관류 완충액에 완전한 배양지를 첨가하여 칼슘 재도입 완충제를 준비합니다.
      참고: 모든 용액은 0.22 μm 여과를 사용하여 멸균 조건에서 준비하십시오. 용액은 4°C에서 빛을 차단한 상태로 최대 2주간 보관합니다. 한 마리의 마우스 심장 분리를 위해 50 mL EDTA 완충제, 100 mL 관류 완충제(콜라겐제 용액용 60 mL, 멈추기 완충용 10 mL, 관류 및 중력 침전용), 60 mL 콜라겐제 완충액, 10 mL 차단 완충액을 준비합니다.
2. 수술 도구 준비: 수술 전에 모든 수술 기구를 오토클레이빙으로 멸균하세요. 수술 부위에 다음 도구를 순차적으로 배치하세요: 가는 가위, 곡선 가위, 겸자, 곡선 정혈 겸자(그림 1A), 주사기 펌프(그림 1B).

3. DOX 치료 중인 심장에서 심근세포 분리

참고: 심근세포 분리 절차의 도식은 그림 2에 나와 있습니다. 모든 수술 기구, 장비, 용기가 준비되었음을 확인한 후 격리를 시작하세요.

1. 대동맥 클램프 및 심장 절제
   1. 3% 이소플루란으로 마취하고, 발가락 꼬집기에 반응이 없는지 확인해 마취 여부를 확인하세요¹⁵.
   2. 쥐를 해부 판 위에 누운 상태로 고정하세요.
   3. 피부와 흉벽을 중심 절개해 심장을 노출시키고, 하행 대동맥을 절단하세요.
   4. 약 1분 동안 통제되고 일정한 속도로 7mL의 EDTA 버퍼를 우심실에 주입하여 허혈 노출을 최소화하고 특히 취약한 DOX 손상 심장에서 심장 구조적 완전성을 유지하면서 심실에서 혈액을 빠르게 제거합니다(그림 2A).
   5. 상승 대동맥을 빠르게 클램프하고(그림 2B), 심장을 절제한 후 즉시 얼음 냉각 EDTA 완충제가 들어 있는 100mm 접시로 옮깁니다.
      참고: 허혈을 최소화하기 위해 흉강 절개술부터 심장 이식까지의 총 시간은 이상적으로 2분 이내로 유지되어야 합니다.
2. 관류 장치
   1. 주변 조직을 조심스럽게 다듬어내세요.
   2. 심장을 얼음 냉각 관류 완충제가 담긴 해부 접시에 넣으세요.
   3. 10mL의 EDTA 완충제를 6분 동안 좌심실 꼭대기에 주입하여 세포외 연결을 불안정하게 합니다.
   4. 심장을 다른 100mm 접시로 옮기고, 같은 카테터를 통해 3mL의 관류 완충제를 2분간 관류하여 심장 챔버에서 잔류 EDTA를 제거합니다.
      참고: 관류 중 심장 부종을 관찰하고, 대동맥을 곡선 정혈 겸자로 고정하여 폐쇄된 관류 시스템을 구축하세요. 관류 속도와 압력을 신중히 조절하여 과도한 정수압을 피하고 좌심방 파열 위험을 최소화하세요.
3. 효소 소화
   1. 절제된 심장을 5mL 효소 소화액이 들어 있는 100mm 접시에 옮깁니다.
   2. 주침 바늘을 효소 소화용액이 채워진 20mL 주사기에 연결하고, 멸균 표시 테이프로 바늘을 생물안전 캐비닛 작업면에 단단히 고정하세요.
   3. 주사기를 마이크로인젝션 펌프에 넣고 3분/mL의 통제된 속도로 관류를 시작하세요(그림 2C).
   4. 효소 용액을 왼쪽 심실을 통해 심장을 관류해 60-90분 동안 완전한 소화가 이루어지며, 조직 탄력성 상실과 심실 표면의 옅은 색깔로 나타납니다(그림 2D). 초기 관류 후 소화가 불완전하면, 소화를 계속하기 위해 효소 용액 15-20mL를 추가로 투여합니다.
      참고: 주사기 교체 시 바늘이 빠지는 것을 방지하세요; 만약 탈출되면 관류 경로를 보존하기 위해 원래 좌심실 부위에 다시 삽입하세요.
4. 조직 해리
   1. 소화된 심장을 5mL의 멈추 완충제가 들어 있는 60mm 접시에 옮깁니다.
   2. 심실 조직을 가는 겸자(핀셋)로 작은 조각으로 찢어버립니다(그림 2E).
   3. 5mL 피펫으로 심실 조직 현탁물을 부드럽게 분쇄하여 개별 심근세포를 해리시킵니다(그림 2F).
   4. 세포 부유물을 100 μm 세포 체로 여과하여 큰 조직 조각을 제거합니다.
   5. 세포 수율을 극대화하기 위해 5mL의 멈추 버퍼를 추가로 세척하세요.
      참고: 모든 분열 단계를 부드럽게 수행하고, 심근세포에 기계적 손상을 피하기 위해 피펫팅 횟수는 50회 이하로 제한하세요.
5. 칼슘 재도입
   참고: 심근세포가 15mL 원심분리기 튜브 안에서 3-4번의 연속 15분 중력 침강 과정을 겪도록 허용하세요(그림 2G). 각 침전이 끝난 후, 상원액의 80%를 조심스럽게 제거하고, 이후 칼슘 재도입 완충제인 3mL에 펠릿을 재현탁합니다. 각^{단계 16}에서 준비된 구배 용액을 사용해 칼슘 농도를 점진적으로 증가시킵니다.
6. 셀 카운팅과 플레이트
   1. 혈구세포계를 사용해 세포 밀도를 정량화하고, 막대형 심근세포와 둥근형 심근세포의 비율을 계산합니다 ^1,9 (그림 2H).
   2. 1-5 × 10⁵ 세포를 도금 배지에 넣고, 라미닌(10 μg/mL)으로 미리 코팅된 6웰 플레이트에 37 °C에서 1시간 동안 세척하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척합니다. 플레이트는 하루 전에 준비하고 필요 시 4°C에서 보관하세요. 배지는 1시간 후, 그 이후로는 48시간마다 신선하고 예열된 배양지로 교체하세요.
      참고: 프로토콜은 3.6단계 이후에 일시정지할 수 있습니다. 세포는 즉각적인 실험을 위해 최대 6시간 동안 단기 배양 상태로 유지할 수 있습니다.

4. 면역염색을 통한 심근세포 구조적 완전성 평가

1. 4% 파라포름알데히드 세포를 상온에서 15분간 고정하세요.
2. PBS로 세포를 세 번, 각각 5분씩 세척합니다.
3. 0.1% Triton X-100으로 PBS에 10분간 투과화시키고, PBS로 세 번, 각각 5분씩 세척합니다.
4. 비특이적 결합을 1% BSA로 PBS에 1시간 동안 차단하세요.
5. 사르코메릭 α-액티닌에 대한 1차 항체로 세포를 4°C에서 하룻밤 배양합니다.
6. PBS로 부드럽게 세 번 세척한 후, 적절한 형광 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 배양합니다.
7. PBS로 세 번 부드럽게 세척한 후, 핵을 DAPI로 5분간 반염색하세요.
8. 안티페이드 마운팅 매체를 사용해 유리 슬라이드에 커버슬립을 장착합니다.
9. 형광 현미경을 이용해 착색 패턴을 시각화하기 위해 이미지를 획득하세요.

5. 분리된 심근세포에서의 세포자사멸 신호 분석

1. 단백질 추출 및 정량화
   1. RIPA 기반 완충제 내 용해성 심근세포에 프로테아제와 인산효소 억제제를 보충합니다.
   2. 균질염을 12,000 × g 에서 4 °C에서 15분간 원심분리합니다. 상정액을 채취하여 후속 분석을 하세요.
   3. 비신코닌산 비광 측정법을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.
2. 서부 블롯 분석
   1. SDS-폴리아크릴아마이드 젤에 단백질 30 μg를 분리하여 PVDF 막에 전달합니다.
   2. TBS에 1% Tween-20을 함유한 5% 무지방 우유로 막을 차단한 후, DOX 심^{독성 연구에서} 흔히 평가되는 Bax, Bcl-2, 절단된 카스파제-3에 대한 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 배양합니다.
   3. 적절한 고추냉이 과산화효소 결합 2차 항체와 함께 인큐베이션합니다. 향상된 화학발광 시약을 사용해 신호를 탐지하고 디지털 영상 시스템으로 이미지를 획득할 수 있습니다¹⁸.
3. 데이터 분석
   1. 세 개의 독립적인 생물학적 복제체에서 나온 SEM 평균 ± 정량적 데이터를 제시합니다.
   2. GraphPad Prism을 사용하여 통계 분석을 수행하고, 여러 그룹과 시점 간 비교에 대해 양측 ANOVA를 적용하거나, 두 그룹 간 비교를 위해 쌍이 없는 양측 t-검정을 적용합니다. p 값 < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

결과

세포 수율 및 생존성 평가

DOX를 투여받은 쥐는 식염수 처리군에 비해 체중이 현저히 감소하는 모습을 보였다(보충 그림 1A). 급성 DOX 유발 심독성 모델의 성공적인 확립은 cTnT와 CK를 포함한 혈청 심장 손상 표지자의 현저한 증가(보충 그림 1B,C)와 심장 절편의 말단 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 dUTP 니크 엔드 표지(TUNEL) 염색으로 심근세포 세포자멸사의 현저한 증가를 통해 더욱 확인되었습니다(보완 그림 1D).

심근세포는 모델 확인 직후 분리되었습니다. 현미경 검사 결과, 식염수 및 DOX 처리된 심장에서 막대형 조기 심근세포가 일관되게 나타났다(그림 3A,B<...

토론

고품질 칼슘 내성 성인 심근세포의 성공적인 분리는 심장 병태생리의 세포 수준 연구에 필수적입니다. 이 프로토콜은 건강한 마우스 심장과 병리적 심장 모두에서 기능성 있는 심근세포를 신뢰성 있게 얻으며, 특히 두 단계가 세포 생존 보존에 매우 중요합니다. 먼저, 효소 관류 지속 시간을 신중하게 최적화하고 모니터링하세요. 소화가 부족하면 조직 해리가 부족하고 수율이 낮으며, 과도한 소화는 구조적 완전성을 저해하여 세포가 과수축하거나 둥글게 변하게 만듭니다. 최적의 종점은 조직 탄력 상실과 창백한 심실 색채로 나타난다. DOX 처리된 마우스와 같은 병리학적 심장은 더 취약하여 이 최적의 시기를 좁힙니다. 표준 소화 시간을 기준으로 시작하여 관찰된 세포 수율과 질에 따라 조절하세요. 둘째, 초기 칼슘 없는 관류로 유도된 역칼슘 마비에 단계적으로 칼슘 재주입을 시행합니다. 점진적으로 칼슘을 회복하면 심근세포가 칼슘 항상성과 수축 기능을 회복할 수 있습니다. 이 단계를 건너뛰거나 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100mm 셀 클루처 접시	제트 바이오-필터	TCD000100
100 & mu; M 세포 체감기	코닝	431752
15 mL 원심분리관	제트 바이오-필터	CFT011150
50 mL 원심분리기 튜브	제트 바이오-필터	CFT011500
60mm 세포 배양 접시	제트 바이오-필터	TCD100060
소 혈청 알부민 (BSA)	시그마-올드리치	A1470
콜라게나제 II	시그마-올드리치	C6885
콜라겐제 IV	시그마-올드리치	C5138
곡선 정혈 겸자	RWD 생명과학	F22003-10
곡선 끝 가위	RWD 생명과학	S12001-09
가위 좋은 사람	RWD 생명과학	S12000-09
겸자	RWD 생명과학	F13014-12
인데잉 캐뉼라 (26G)	벡턴, 디킨슨 앤 컴퍼니	381312
인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS)	메드켐익스프레스	HY-150287
이소플루란  그리고 nbsp;	RWD 생명과학	R510-22-10
라미닌 (마우스)	써모 사이언티픽	23017015
지질 농축물 (화학적으로 정의됨)	메드켐익스프레스	HY-K3019
M199 미디엄	시그마-올드리치	M4530
페니실린-스트렙토마이신	메드켐익스프레스	그리고 nbsp; HY-K1006
프로테아제 XIV	시그마-올드리치	P5147
멸균 표시 테이프	미네소타 광산 및 제조 (3M)	CT060934701
주사기 펌프 (ISPLab01)	바오딩 셴첸 정밀 펌프	SC-49464A