방법 논문

전통 한의학 공식에 의한 장 재조합 아데노 관련 바이러스 흡수 증진

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DOI:

10.3791/70413

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2026년 4월 24일

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1Faculty of Traditional Chinese Medicine, Naval Medical University, 2Oncology Department of Traditional Chinese Medicine, Changhai Hospital, Naval Medical University, 3State Key Laboratory of Genetics and Development of Complex Phenotypes, School of Life Sciences, Zhongshan Hospital, Fudan University, 4Shanghai Key Laboratory of Gene Editing and Cell Therapy for Rare Diseases, Engineering Research Center of Gene Technology (Ministry of Education), Fudan University, 5Institutes of Integrative Medicine, Fudan University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기서는 전통 중의학(TCM)과 재조합 선조 관련 바이러스(rAAV) 간 장내 흡수 과정 상호작용을 평가하기 위한 내장 내복 모델 구축 프로토콜을 제시하며, 경구 유전자 전달 전략을 최적화할 수 있는 체외 내 플랫폼을 제공합니다.

초록

경구 재조합 선도염 관련 바이러스(rAAV) 전달은 상당한 치료 잠재력을 지니고 있으나, 비효율적인 장 흡수로 인해 제한이 있습니다. 경구 제제에 널리 사용되는 전통 중의학(TCM)은 흡수 촉진제의 유망한 공급원입니다. 그러나 rAAV 흡수와 전도에 미치는 잠재적 영향은 아직 거의 탐구되지 않았습니다. 뒤복된 장낭 모델은 이러한 상호작용을 조사할 수 있는 정량적인 체외 실험 플랫폼을 제공합니다. 여기서는 뒤집힌 장낭 모델을 활용해 장상피를 가로지르는 아데노 관련 바이러스(rAAV)의 전위와 장내 조직 내 유전자 전달을 통제된 실험 조건 하에서 정량적으로 평가하는 상세 프로토콜을 제시합니다. 주요 단계는 실험실 설치류에서 소장 구간을 채취하고, 구간을 뒤집어 주머니를 형성하며, 각 주머니를 산소 완충제로 채우는 것입니다. 뒤집힌 주머니는 rAAV 입자가 포함된 산소 완충기에 담가 37 °C에서 배양하여 하루내알 노출과 벡터 수송을 가능하게 합니다. 종말 분석은 상피를 통과한 rAAV 입자를 측정하기 위해 내부(혈청) 체액을 샘플링하고, 전도 효율을 판단하기 위해 주머니 조직의 형질 발현을 분석하는 것을 포함합니다. 여러 장 영역을 검사함으로써 프로토콜은 rAAV 흡수의 구간 특이적 차이에 대한 통찰을 제공합니다. 또한, 인큐베이션 중 고전적인 TCM 공식인 GZNG를 포함함으로써 벡터 흡수 및 전도에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다. 뒤쪽 장낭 접근법은 rAAV 혈청형, 전달 증강자, rAAV 벡터와 TCM 구성 요소 간 상호작용을 스크리닝하는 데 유용한 플랫폼을 제공합니다. 간단하고 병렬화 가능한 설계 덕분에 전임상 연구에서 고처리량 스크리닝도 가능합니다.

서론

재조합 선상연관바이러스(rAAV)는 전신 유전자 치료의 유망한 플랫폼으로, 현재 세 가지 주요 전달 경로가 연구되고 있습니다: 정맥 주사1, 복막 내 주사2, 경구 투여3. 정맥 주사 및 복막 내 주사 경로는 광범위하게 연구되었으나, 비침습적 접근법인 경구 투여는 비교적 미흡하게 연구되고 있습니다. 경구 rAAV 투여의 타당성은 Xin 등4에 의해 처음 입증되었으며, 이들은 rAAV2 경구 투여 후 장 점막의 성공적인 전달과 항HIV 면역 반응 유도를 보고했습니다. 마찬가지로 Hara 등(3,5)은 경구 rAAV/Aβ가 위장 점막을 전달하고 뇌 아밀로이드 침착을 감소시킬 수 있음을 입증했으며, Steel 등은 경구 백신이 근육 주사에 비해 생존율과 항종양 면역이 우수함을 발견했습니다. 같은 연구에서는 rAAV6가 rAAV5보다 더 강한 장 내 친형성을 보였다고 보고했습니다. 백신 적용 외에도 다른 질병 모델에서도 치료 잠재력이 달성되었습니다. Ma 등7과 Hao 등8은 경구 rAAV가 위장관 전달 후 각각 간과 위에서 종양 억제와 항섬유화 치료를 촉진함을 증명했습니다. Huang 등은 경구 투여 후 갈색 지방 조직을 선택적으로 전달하는 인공 혈청형 Rec2를 확인했으며, 이는 정맥 주사 투여에서 관찰된 우세한 간 영양성과 대조적이다10. 이러한 선구적 발견에도 불구하고, 경구 rAAV 투여에 관한 연구는 대규모 평가를 위한 시험관 내 스크리닝 시스템의 부재로 인해 제한적이다.

1954년 Wilson과 Wiseman이 개발한 뒤집힌 장낭 모델은 장내 약물 흡수 메커니즘을 연구하는 데 여전히 가치 있는 시험관 내 플랫폼으로 남아 있다. 다른 흡수 시뮬레이터 장치와 달리, 이 시스템은 단순한 수동 확산 이상의 여러 생리학적 과정을 독특하게 설명한다12. 이 특성은 TCM13 연구에 특히 유리하다. 이 시스템을 사용하면 TCM 화합물들이 위장관 전반에 걸쳐 구절 의존적인 장 흡수 패턴을 자주 보인다는 것이 문서화되었다. 예를 들어, 한 연구에서는 우웨이 칭저오산에서 나온 여러 알칼로이드가 서로 다른 장 구간에서 선택적으로 흡수되며, 공주와 회장이 가장 활발한 흡수를 보인다는 것을 보여주었다14. 또한, TCM 성분의 공동 투여는 장 흡수를 조절할 수 있습니다. Liao 등15는 Radix Angelicae dahuricae 추출물과의 공동 투여가 푸에라린 장내 흡수를 유의미하게 향상시켰으며, 이는 TCM 상호작용이 분절적 흡수에 미치는 영향을 강조했습니다. 따라서 내복된 장낭 모델은 TCM 제형 및 기타 약물에 내재된 복잡한 흡수 행동과 시너지 상호작용을 밝히는 데 이상적인 도구입니다.

rAAV 흡수 연구를 위한 적절한 모델을 선택하려면 생리학적 정확성, 기술적 복잡성, 처리량 간의 균형을 세밀하게 이해해야 합니다. 아래 표는 장 흡수 연구에 사용되는 주요 실험 모델을 요약한 것입니다.

이 연구는 뒤집힌 장낭 모델이 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 벡터의 장 내 흡수를 조사하는 데 사용될 수 있음을 개념 증명합니다. TCM 병용 투여가 rAAV 매개체의 장 내 흡수에 미치는 영향에 대한 귀중한 통찰을 제공하며, 생리적으로 중요한 조건에서 이들의 기전적 상호작용을 추가로 특성화할 필요성을 강조합니다. 이 접근법을 통해 TCM 강화 경구 전달 전략을 최적화하면 비침습적 rAAV 치료제 개발을 촉진하여 환자의 순응도와 치료 접근성을 향상시킬 수 있습니다.

연구자들은 실험 목표에 부합하는지 확인하기 위해 다음 기준에 따라 뒤복된 장낭 모델을 평가해야 합니다. 적절한 적용에는 혈청형 신속 스크리닝, 보조제/강화제 평가, 지역적 반응학이 있으며, 부적절한 적용 및 제한으로는 장기 발현 연구(>48시간)와 전신 약리학이 포함됩니다.

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프로토콜

모든 동물 시술은 해군 의과대학 동물 윤리 위원회가 승인한 지침(승인 CHEC (A.E)-2025011)에 엄격히 따라 진행되었습니다.

1. 타이로드 용액 및 바이러스 용액 준비

  1. 타이로드의 해법 전조건화:
    1. 타이로드 용액(pH 7.4) 500mL 알리코트 두 개를 준비합니다( 재료표 참조).
    2. 한 쪽은 4°C로 식히고, 다른 쪽은 37°C로 데워주세요.
    3. 각 알리코트에 95% O₂/5% CO₂를 넣어 버블을 만듭니다.
  2. 바이러스 용액 제조:
    1. 재조합 AAV9-CMV-EGFP를 37°C 타이로드 용액에 첨가하여 최종 농도인 1 x 1011 vg/mL(대조 조건)를 달성합니다.
    2. 실험 조건에서는 AAV9-CMV-EGFP 제제에 환체에 용해된 TCM 공식 GZNG(표 2)를 보충하여 최종 농도는 200 mg/mL로 만듭니다.
    3. GZNG 단독 대조군의 경우, AAV9 CMV-EGFP 없이 Tyrode 용액에 GZNG(200 mg/mL)를 첨가합니다.
      참고: 감염성 보존을 위해 사용 직전에 바이러스 희석제를 준비하십시오. GZNG 용액의 pH는 약 5.0–6.0입니다.

2. 동물 준비 및 장 조직 채취

  1. 단식: 수술 전 24시간 동안 8주 된 스프래그–도울리 쥐를 단식시키세요. 이 기간 동안 수분 섭취를 위해 자유롭게 물을 마시도록 하세요.
    참고: 단식은 장 내용물을 최소화하고 체외 실험 중 장 흡수 정확도를 보장하는 데 도움을 줍니다.
  2. 단식 전에 동물 건강을 확인하고 상태가 양호한지 확인하세요. 고통이나 질병의 징후가 있는 동물은 연구에서 제외하세요.
  3. 심부 마취를 유도하기 위해 펜토바르비탈 나트륨(200 mg/kg, 복강 내 투여)을 투여합니다. 반사 신경 부족과 호흡 부족을 통해 동물이 완전히 마취되었는지 확인하세요.
    주의: 펜토바르비탈은 유해 통제 물질입니다; 피부 접촉/흡입을 피하기 위해 방풍 후드에서 장갑과 개인 보호 장비를 착용해 다루며, 안전한 폐기 및 긴급 대응을 위한 기관 지침을 준수하십시오.
  4. 심마취가 확인되면 경추 탈구에 의한 안락사를 시행하세요.
  5. 복부와 흉부 부위를 75% 에탄올로 면봉하여 피부를 소독하고 수술 중 미생물 오염을 줄이세요.
  6. 멸균 수술용 가위로 복부 중앙을 따라 복강을 노출시키세요.
  7. 위와 장을 부드럽게 분리하고 노출하세요. 시술 중에는 멸균 드레이프를 사용해 주변 조직과 장기를 보호하세요.
  8. 유문 괄약근을 조심스럽게 절단하여 위와 근위 십이지장을 분리하세요. 십이지장은 이후 시술을 위해 온전하게 유지되도록 하세요.
  9. 직장-항문 접합부의 원위 대장을 절개하면서 주변 조직에 손상을 주지 않도록 하세요.
  10. 소장에서 장간막 부착물을 조심스럽게 풀어내는 것은 가늘게 핀셋이나 가위로 사용하세요. 장막을 늘리거나 찢지 않도록 주의하세요.
  11. 즉시 온전한 소장을 얼음처럼 차가운 산소 크렙스-링어 완충제(타이로드 용액, 4°C)로 옮기세요.

3. 생체 전 복 장낭 준비

  1. 장 분절을 다음과 같이 선택하는데, 유문에서 10cm 떨어진 8cm 분절은 십이지장 분절로 지정되었습니다.
  2. 십이지장 분절에서 16cm 떨어진 곳에서 시작하여 8cm 길이의 공주음 마디를 채취합니다.
  3. 공주동맥 마디에서 16cm 더 먼 지점부터 8cm 장의 회장 마디를 얻으세요.
  4. 대장의 경우, 맹장 실명 끝에서 5cm 근위에 위치한 8cm 구간을 채취합니다.
    참고: 조직이 탄력적이고 온전하여 준비 중 전복에 적합한지 확인하세요.
  5. 얼음처럼 차갑고 산소가 풍부한 타이로드 용액이 채워진 2mL 주사기로 장 내강을 헹구세요.
  6. 기관 생물학적 위험 폐기물 프로토콜에 따라 폐류물을 처리하여 멸균을 유지하고 오염을 방지하세요.
    주의: 생물학적 폐기물은 장갑과 적절한 보호 장비를 착용하여 감염성 물질에 노출되지 않도록 처리하십시오. 모든 생물학적 폐기물과 폐류물은 환경 오염을 방지하기 위해 기관의 생물학적 위험 안전 지침에 따라 처리하십시오.
  7. 장 마디의 근위 끝을 4mm 광택 유리 막대에 삽입하세요. 점막 찢어짐을 방지하기 위해 막대 표면이 매끄럽게 만들어지도록 하세요.
  8. 마디의 원위 끝을 2-0 실크 봉합사로 묶어 조직을 막대에 고정하세요. 역전 중에도 조직이 안정적인지 확인하세요.
  9. 조직을 막대를 따라 미끄러뜨려 점막이 완전히 노출될 때까지 부드럽게 장 구간을 내출하세요. 조직의 완전성을 유지하기 위해 과도한 늘림이나 비틀림을 피하세요.
  10. 얼음처럼 차갑게 식은 타이로드 용액 2mL를 내강에 주입하여 누출 여부를 확인하세요. 허용 가능한 누출량은 1분 이내에 <5%여야 합니다. 누출이 감지되면 봉합사를 조정하고 점막 표면이 완전히 뒤집혔는지 확인하세요.
    참고: 효실 분해를 최소화하고 조직의 생존력을 유지하기 위해 추운 환경에서 전복을 수행하십시오.
  11. 수혈 입구 역할을 하기 위해 3mm 유리 모세관을 5cm 길이의 개방된 구간에 삽입합니다. 점막 찢어짐을 피하기 위해 캐뉼라를 부드럽게 밀어주세요.
  12. 캐뉼라를 2-0 실크 봉합사로 고정하세요. 캐뉼라가 무너지거나 액체 흐름을 방해하지 않고 고정되도록 하세요.
  13. 장낭의 올바른 형태를 유지하기 위해 봉합사에 부드러운 장력을 가하세요. 휘어짐이나 비틀림은 관류를 방해하고 흡수 결과를 변화시킬 수 있으므로 방지하세요.
  14. 과도한 조임은 조직을 손상시키거나 주머니를 변형시킬 수 있으니 피하세요. 실험 내내 균일한 장력을 유지하세요. 내복된 장주머니에 누출이나 구조적 손상이 있는지 정기적으로 검사하세요. 누출이 5%를 초과하면 계속하기 전에 해당 부분을 수리하거나 교체하세요.

4. AAV 전개 및 배양

  1. 각 뒤집힌 주머니를 37°C 산소화된 타이로드 용액 4mL가 담긴 7mL 원뿔형 튜브에 넣습니다.
  2. 바이러스 용액을 다음과 같이 첨가합니다: 대조군: AAV9-CMV-EGFP 단독; 실험용: AAV9-CMV-EGFP + GZNG.
  3. 37°C에서 2시간 동안 정적으로 배양하며, 이 기간 동안 95% O2/5%CO2 가스 혼합물을 지속적으로 용액에 기포로 넣었습니다.

5. 샘플링, 최종 처리 및 분석

  1. 시간 경로 샘플링
    1. 보정된 마이크로주사기를 사용해 0, 30, 60, 90, 120분에 각 장낭에서 50 μL의 혈청액을 추출합니다. 기포를 유입하지 않고 정확한 샘플링을 보장합니다.
    2. 즉시 추출된 유체를 50 μL 예열(37 °C) 타이로드 용액으로 교체하여 삼투 균형과 내부 부피를 유지합니다. 추출과 교체 사이의 시간을 최소화하여 일관된 실험 조건을 유지합니다.
      참고: 마이크로 주사기(예: 해밀턴 주사기)를 사용할 때는 무균을 유지하고 장낭 손상을 방지하기 위해 조심스럽게 다루세요.
    3. 각 시점마다 신속하게 샘플링을 수행하여 배양 환경의 교란을 최소화하세요.
  2. 바이러스 역가 결정
    1. 제조사의 지침에 따라 상용 동물 유전체 DNA 추출 키트를 사용하여 혈관액에서 총 DNA를 추출하세요.
    2. qPCR로 rAAV 벡터 게놈 복제 번호의 절대 정량화를 수행합니다. ITR 프라이머가 포함된 SYBR Green 키트를 사용하세요. 표준 96웰 플레이트에서 열 사이클러를 사용하여 다음 사이클 조건으로 qPCR 증폭을 수행합니다: 초기 변성: 95°C, 10분; 변성: 95°C, 15초; 어닐링 및 확장: 60°C, 1분; 총 40사이클
    3. 게놈 복사본 수를 정량화하기 위해 플라스미드 rAAV-CMVp-gfp(1 ng, 0.1 ng, 0.01 ng)의 연속 희석을 사용하여 표준 곡선을 생성합니다. 이 희석을 이용해 해당 사이클 임계값(Ct) 값을 기반으로 바이러스 게놈 복사 수를 계산합니다.
    4. 표준 곡선을 사용하여 채취된 혈관액에서 벡터 유전체 복사본 수를 결정합니다. 결과는 추출된 DNA 100 ng당 유전체 복사본으로 보고되었습니다.
      참고: DNA 추출 및 qPCR 분석 시 오염을 방지하기 위해 모든 시약과 장비가 멸균되었는지 확인하세요. qPCR 정확도를 검증하기 위해 적절한 대조군(non-template controls, NTC)과 플라스미드 표준 등을 사용하세요.
    5. 각 샘플에 대해 3배로 qPCR을 수행하여 결과의 재현성과 신뢰성을 보장합니다.
  3. 말단 조직 처리
    1. 각 장낭에서 남은 하내액을 멸균 피펫으로 흡인하세요. 조직이 파열되지 않도록 조심스럽게 다루세요.
    2. 각 주머니를 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S)이 함유된 인산 완충식염수(PBS)로 세 번 헹구어 잔류 배지, 박테리아, 불순물을 제거합니다. 하류 적용을 위해 멸균 상태를 유지하기 위해 철저한 세척을 반드시 하세요.
    3. 멸균 수술용 가위나 칼날을 사용해 장 조직을2 mm 3 (2 mm * 2 mm * 0.5 mm) 조각으로 절단합니다. 조각들은 일정한 크기로 유지하여 일정한 배양을 유지하세요.
    4. 조직 조각을 10 mL DMEM에 10% FBS 및 1% (v/v) P/S를 보충한 상태에서 37°C에서 5% CO₂를 포함한 가습 인큐베이터에서 48시간 배양합니다. 배양 배지는 배양 기간 동안 12시간마다 갱납해야 합니다.
      참고: 이 단계는 조직의 생존력을 유지하고 실험 후 세포 회복을 가능하게 합니다. 절단 및 세척 시 점막이 온전하게 유지되도록 하세요. 이물질과 미생물 오염물질을 제거하기 위해 세 번의 완전한 PBS 세척을 수행하세요. 대사 활동과 조직 건강을 지원하기 위해 일정한 온도(37 °C)와 높은 습도를 유지하세요.
      주의: 조직 조각은 멸균 도구로 다루고 기계적 스트레스를 피하여 상피의 완전성을 유지하세요.
  4. 인큐베이션 후 분석
    1. Aliquot A (조직학적 분석):
      1. 세포 구조를 보존하기 위해 조직 샘플을 4% 파라포름알데히드(PFA)에 4°C에서 24시간 고정합니다.
      2. 고정 후에는 조직을 OCT 화합물에 박고 헤마톡실린과 이오신(H&E) 염색을 수행하여 조직의 완전성과 형태를 평가합니다.
        주의: 파라포름알데히드는 유해한 고정제입니다; 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 연기호 내에서 다루십시오
    2. Aliquot B (형광 분석 및 유전체 정량):
      1. 남은 조직을 액체 질소에 급동하여 -80 °C에서 보관하여 추가 가공을 기다리세요.
      2. 형광 현미경 검사를 위해 냉동 샘플을 사용하여 EGFP 발현을 검출하고, 형질전환 효율 또는 바이러스 흡수를 평가합니다.
      3. DNA 추출 후 qPCR을 수행하여 바이러스 게놈 복사 수 또는 형질전환유전자 발현을 결정합니다.

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결과

이 프로토콜은 AAV9 매개 유전자 전달의 소장 각 구간에서의 효율성과 GZNG 처리가 유전자 전달 및 발현 증진에 미치는 영향을 평가하는 데 사용되었습니다. 프로토콜의 성공적인 적용과 특정 조건에서 발생할 수 있는 변이성을 보여주는 여러 주요 결과가 관찰되었습니다.

소장(십이지장, 공주, 회장, 결장) 전반에 걸친 조직학적 (H&E 염색) 및 형광(EGFP) 분석을 통한 AAV9 매개 EGFP 발현 평가 결과, 모든 검사 조직에서 성공적인 전도가 확인되었습니다(그림 1). 밝은 필드 이미지(그림 1A–D)는 이 조직들의 구조적 완전성을 시사하며, 정상적인 조직학적 구조를 보였습니다. 대응하는 형광 영상(그림 1E–H...

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토론

본 연구에서는 고전적인 수복 장낭 모델을 적용하여 장내 rAAV 흡수를 평가하는 새로운 시험관 내 접근법이 확립되었습니다. 이 방법은 통제된 조건 하에서 소장 전반 전이 효율을 구분별로 분석하고 TCM과 rAAV 간 시너지 효과를 평가할 수 있게 합니다. 여기서는 중요한 단계, 문제 해결 및 수정, 한계 및 유전자 치료 및 약물 전달에서의 광범위한 응용에 대해 논의합니다.

중요한 기술적 단계
rAAV 전도술 연구에 뒤집힌 장낭 모델을 구현하려면 프로토콜의 성공에 중요한 여러 기술적 단계에 세심한 주의가 필요합니다. 조직 선정과 준비가 매우 중요합니다. 재현 가능한 결과를 보장하기 위해 장 구간은 일관되게 채취해야 합니다(예: 해부학적 랜드마크에 대해 정의된 십이지장, 공주교, 회장, 결장 길이를 식별하는 경우). 주머니 전복 ...

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공개 사항

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

저자들은 이 연구 전반에 걸쳐 귀중한 논의와 기술 지원을 제공해 주신 모든 동료와 협력자들에게 감사드립니다. 또한 이 연구를 가능하게 한 제도적 지원에도 감사드립니다. 이 연구는 중국 국가자연과학기금(CL에 제공)의 보조금 #82474349로 재정적으로 지원받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEM거나무319-005-CL액체, 4.5 g/L D-포도당, L-글루타민, 페놀 레드, 피루브산나트륨 함유
EGFP CDS 영역 qPCR 프라이머칭커F: 5'-ACTTCTTCAAGTCCGCCATG-3'; R: 5'-TGTCGGCCATGATATAGACG-3'
태아 소 혈청거나무086-550우수한 품질, 1차 세포 배양 등급
페니실린-스트렙토마이신(P/S)거나무450-201-EL이 용액에는 10,000 단위/mL의 페니실린과 10,000 및 마이크로 유닛이 포함되어 있습니다; 스트렙토마이신 g/mL.
PrimeScript RT 마스터 믹스 (퍼펙트 리얼타임)타카라RR036A
TaKaRa MiniBEST 범용 RNA 추출 키트타카라9767
칭케 TSE401 ArtiCanCEO SYBR qPCR 믹스칭커TSE401이 제품은 SYBR Green 염료법을 이용한 형광 정량 실험에 적합하며, 다양한 실시간 형광 정량 PCR 기기와 호환됩니다.
칭케 TSP202-200 Trelief  하이-퓨어 동물 유전체 DNA 키트칭커TSP202-200
타이로드의 해법위안 예R20268-500ml주로 염화나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, 인산염, 염화칼슘, 포도당, 그리고 HEPES로 구성되어 있습니다.

참고문헌

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