인간 원발 자궁내막 상피 세포의 분리 및 장기 확장을 위한 간소화되고 견고한 프로토콜

Summary

인간 자궁내막 상피세포(HEEC)의 1차 배양은 기술적으로 도전적입니다. 이 프로토콜은 혼합효소 소화와 ROCK 억제제(Y-27632)를 결합하여 세포 생존과 증식을 개선하면서 상피 정체성을 유지하며, 자궁내막 연구 및 재생 응용에 견고한 기반을 제공합니다.

Abstract

타목시펜 관련 자궁내막 과형성증을 포함한 자궁내막 질환에 대한 연구는 견고한 시험관 상피 모델의 부족으로 인해 제한되어 왔습니다. 인간 자궁내막 상피 세포(HEEC)를 분리하는 기존의 방법은 종종 비효율적이고 기술적으로 까다롭으며, 확장성이 떨어집니다. 여기서는 혼합 효효소 소화, 적혈구 용해, 지속 ROCK 억제제(Y-27632) 처리를 통합하여 1차 HEEC의 효율적인 분리 및 확장을 가능하게 하는 간소화되고 피더가 없는 프로토콜을 설명합니다. Y-27632의 포함은 해리로 인한 세포자멸사를 완화하고 초기 세포 부착을 증진하는 데 매우 중요합니다. 이 방법은 연속 통과를 지원하면서 최소 3개의 통로에 대해 상피 동일성을 유지하고, 10개의 통로 이상에서는 형태가 보존됩니다. 웨스턴 블롯과 면역형광 분석을 통해 사이토케라틴 18과 E-카데린의 높은 발현이 확인되었으며, 선택적 배양 조건에서 비멘틴 양성 기질 오염물질이 점진적으로 감소함이 확인되었습니다. 주요 기술적 한계를 해결함으로써, 이 방법은 기전 연구, 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 자궁내막 연구에서의 재생 응용을 위한 신뢰할 수 있고 확장 가능한 상피세포 공급원을 제공합니다. 표준화된 워크플로우는 복잡한 공동 배양 시스템에 대한 대안을 제공하여 고품질 1차 세포 모델에 대한 더 넓은 접근성을 촉진합니다.

Introduction

신뢰할 수 있는 시험관 내 모델은 특히 타목시펜(^TAM)과 관련된 자궁내막 질환 연구를 진전시키는 데 필수적입니다. TAM은 유방암 내분비 치료제로 널리 사용되지만, 자궁내막에서의 부분 에스트로겐-작용제 활성은 자궁내막 과형성, 용종, 그리고 경우에 따라 악성 변형²의 발생률을 현저히 증가시킵니다. 현재 타목시펜 관련 자궁내막 병리의 임상 관리는 주로 프로게스테론 치료나 외과적 개입에 의존하고 있으며, 두 가지 모두 상당한 한계가 있습니다. 프로게스테론 치료는 돌발 출혈과 체중 증가와 같은 부작용과 자주 연관되어 있으며, 수술적 접근법은 돌이킬 수 없는 자궁내막 손상과 생식 능력 저하를 초래할 수 있습니다^. 이러한 한계는 기전적 연구를 지원하고 개선된 치료 전략 개발에 도움이 될 수 있는 견고한 상피 모델의 필요성을 강조합니다. 그러나 이 분야의 진전은 주로 고순도, 확장 가능한 인간 자궁내막 상피세포(HEEC) 획득에 대한 기술적 어려움에 의해 제약을 받았습니다.

이 분야의 기초 연구는 Arnold 등(2001)에 의해 보고되었으며, 콜라겐제 소화와 순차적 체로 여과를 통해 기질 및 상피세포 집단을 분리하여 면역염색으로 98% 이상의 순도를 달성^{했습니다.} 성공에도 불구하고, 이 방법은 단일 효소 소화에 의존했고, 장시간 처리가 필요했으며, 기질 및 적혈구 오염물질을 제거하기 위해 단계별 여과에 의존해 작업 흐름이 노동 집약적이고^표준화가 어려웠습니다. 이후 Yokomizo 등(2002)은 기질 피^{더 세포와} 3차원 공동 배양을 사용하여 자궁적출 표본으로부터 1차 HEEC 배양 시스템을 확립했다. 피더 기반 미세환경이 부분적으로 상피 성장을 지원했지만, 시스템은 일반적으로 다섯 번을 넘지 않는 제한된 통과만 허용하여 대규모 안정적인 상피 확장 5가 필요한 응용 분야에서의 유용성을^{제한했다.}

이러한 한계를 극복하기 위해 HEEC 분리 및 장기 배양을 위한 단순화되고 재현성이 높은 프로토콜이 개발되었습니다. ROCK 억제제 Y-27632가 인간 각질세포, 치은상피세포, 유선 상피세포의 1차 배양 효율을 현저히 향상시킨다는 이전 연구를 바탕으로, 같은 원리가 자궁내막 조직 ^6,7,8에도 적용되었습니다. 이 접근법은 세 가지 핵심 특징을 포함합니다: 효율적인 조직 해리를 촉진하는 혼합효소 소화, 조기 오염을 줄이고 상피 부착을 촉진하는 필수 적혈구 용해 단계, 그리고 세포자사멸사를 억제하고 부착을 지원하며 증식 능력을 향상시키기 위한 Y-27632의 지속적인 보충입니다. 이 전략을 사용하면 HEECs는 상피 형태와 CK18 및 E-카^데린의 높은 발현을 유지하면서 여러 통로에 걸쳐 확장할 수 ^{있습니다.} 특히, 최소 3세대 이상의 연속 전달에서는 표현형 표이동이 감지되지 않아 배양 시스템의 안정성과 확장성을 입증했습니다.

이 방법은 높은 조직 투입 요구, 복잡한 워크플로우, 낮은 재현성, 제한된 증식 잠재력 등 1차 HEEC 배양에서 오랜 기술적 문제를 직접적으로 해결합니다. 배출 과정 전반에 걸쳐 상피 정체성과 기능 특성을 보존함으로써, 프로토콜은 자궁내막 재생, 병태생리학, 고처리량 약물 스크리닝, 세포-생체물질 상호작용 연구에 신뢰할 수 있는 기반을 제공합니다. 조직 처리와 직렬 확장을 통합함으로써 이 표준화된 워크플로우는 생식생물학의 오랜 병목 현상을 해소하고 조직공학, 재생 의학, 개인 맞춤형 치료 분야의 미래 응용을 지원합니다.

이 프로토콜은 수집 후 24시간 이내에 처리되는 신선한 조직 표본을 요구합니다. 세포 수율과 성장 특성은 자궁내막 용종과 정상 자궁내막 등 조직 출처에 따라 달라질 수 있습니다. 일반적인 실패 원인으로는 조직 소화 불완전, 과도한 적혈구 오염, Y-27632 보충 부족 등이 있습니다. 시스템은 여러 통로에 걸친 확장을 지원하지만, 확장 배양 기간 동안 표현형 안정성을 유지하기 위해 추가 최적화가 필요할 수 있습니다.

Protocol

저장중의의과대학 제1부속병원 환자들의 자궁 용종 검체에서 외과적으로 적출된 자궁내막 조직 샘플을 채취하였다. 모든 절차는 저장중화의과대학 제1부속병원 의료윤리위원회(프로토콜 번호 2025-KLS-569-01; 2025년 9월 14일 승인)에서 승인한 지침에 따라 진행되었습니다. 1차 인간 샘플의 취급은 실험실 코트, 장갑, 안구 보호 장비 등 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 Class II 생물학적 안전 캐비닛에서 수행되었습니다. 모든 효소 시약은 기관 안전 규정과 물질 안전 데이터 시트(MSDS) 지침에 따라 취급되었습니다.

1. 조직 획득

1. 성인 여성에게서 얻은 수술 표본에서 신선한 자궁내막 조직을 채취합니다. 조직을 10mL 인산염 완충식염수(PBS)에 3% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)을 보충한 멸균관으로 옮깁니다.
   참고: 모든 조직은 수술 채취 후 24시간 이내에 처리해야 합니다.

2. 조직의 전처리

1. 조직을 세척용액(표 1)에서 2분씩 연속 두 번 세척하여 점액과 혈전을 제거하세요.
2. 조직을 75% 에탄올 5mL에 5초간 짧게 헹구어 표면을 소독합니다.
3. 즉시 조직을 20mL 세척액에 옮기고, 두 번, 각각 5분씩 세척하여 잔여 에탄올을 제거합니다.
   참고: 에탄올은 가연성이므로, 이 과정을 불꽃에서 벗어나 기관 화학 안전 지침에 따라 에탄올 함유 폐기물을 처리하십시오.

3. 조직 소화 및 세포 채취

1. 조직 다짐
   1. 자궁내막 조직을 두 개의 멸균 칼날로 잘게 다듬어 1 mL 피펫 팁을 통해 흡취할 수 있을 때까지 (약 10분) 파편(~2 mm³)을 제거합니다.
   2. 다진 조직을 50mL 원심분리관에 옮기세요.
2. 효소 소화
   1. 조직 조각이 담긴 튜브에 소화액 10mL(표 1)를 추가합니다.
   2. 튜브를 37°C 물욕에 30분간 부양하세요. 소화를 돕기 위해 튜브를 15분마다 부드럽게 흔들어 주세요.
   3. 조직 조각이 눈에 띄게 해리되고 방출된 세포로 인해 용액이 흐릿해 보일 때까지 계속 배양합니다.
3. 소화 종료
   1. 효소 소화를 종료하기 위해 중화 용액 10mL를 추가하세요.
   2. P1000 피펫을 800 μL로 설정하여 약 15회 위아래로 피펫팅하여 충분히 혼합하세요.
4. 여과 및 원심분리
   1. 소화된 현탁액을 100 μm 메시 필터로 필터링합니다.
   2. 156 × g 에서 25°C에서 5분간 원심분리기.
5. 적혈구(적혈구) 용해
   1. 펠릿을 흔들지 않고 상정액을 조심스럽게 흡입하세요.
   2. 세포 펠릿을 2mL의 미리 냉각된 적혈구 용해 완충제에 재현탁합니다.
   3. 얼음(약 4°C)에서 3–5분간 부드럽게 교란하며 배양합니다.
6. 용해의 종료
   1. 용해 반응을 멈추기 위해 PBS 또는 전액 배지 ≥ mL를 추가하세요.
   2. 156 × g 에서 25°C에서 5분간 원심분리기.

4. 1차 문화의 시작

1. 세척 및 원심분리
   1. 펠릿을 흔들지 않고 상정액을 조심스럽게 흡입하세요.
   2. 펠릿을 중화용액 20mL에 재현탁합니다.
   3. 피펫으로 약 15회 섞으세요.
   4. 156 × g 에서 25°C에서 5분간 원심분리기.
2. 재현금 및 파종
   1. 상정액을 흡인하세요.
   2. 세포 펠릿을 10 mL의 초기 배양지(10 μM Y-27632가 함유)에 부드럽게 재현탁하며, 1 mL 피펫을 사용해 천천히 위아래로 8–10회 피펫팅합니다.
   3. 세포 현탁액을 100mm 배양 접시에 도판하세요.
      참고: 최적의 초기 씨앗 밀도를 위해 추정된 세포 수량에 따라 배양 용기를 선택하세요. 예상 수확량이 10개의⁶ 셀× >1이라면 100mm 접시를 사용하고, 낮은 수확량을 위해서는 60mm 접시를 사용하세요. 배지의 부피를 적절히 조절하세요(예: 100mm 접시는 10mL, 60mm 접시는 4mL).
3. 배양 조건
   1. 5%_CO2가 함유된 습기 환경에서 37°C에서 배양하세요.
   2. 3일마다 Y-27632가 없는 신선한 상피 배양 배양지로 배지를 교체하세요.
      참고: 세포 부착 및 형태를 모니터링하세요; 세포가 증식하기 시작하면 2일마다 배지를 교체하세요.

5. 세포 통과

1. 트립신화 준비
   1. 배양 비율이 80%에서 90%에 이르면 100mm 접시를 인큐베이터에서 꺼내세요.
   2. 사용한 매체는 버리세요.
   3. 세포를 2mL PBS로 두 번 헹구세요.
   4. 조심스럽게 흡인하여 남은 PBS를 제거하세요.
2. 트립신화
   1. 접시에 0.05% 트립신 2mL를 추가하세요.
   2. 세포층이 고르게 덮이도록 부드럽게 휘둘러 주세요.
   3. 37°C에서 7분간 배양합니다.
   4. 세포를 현미경(40배 대관)으로 검사하여 박리 여부를 확인하세요.
3. 중화 및 수집
   1. 트립신 소화를 멈추기 위해 중화용액 8mL를 추가하세요.
   2. 세포 현탁액을 15mL 원심분리관으로 옮깁니다.
   3. 피펫을 약 15회 사용해 단일 셀 현탁액을 얻습니다.
   4. 156 × g 에서 25°C에서 5분간 원심분리기.
4. 재현각 및 재파종
   1. 펠릿을 흐트러뜨리지 않고 상정액을 흡인하세요.
   2. 세포 펠릿을 10mL 상피세포 배지에 부드럽게 재현탁하여 1mL 피펫을 약 10회 위아래로 움직이게 합니다.
   3. 10mL 상피세포 배지에 10×⁶ 개의 세포를 새로운 100mm 접시에 씨앗 뿌립니다.
   4. 다음 날에는 과밀을 피하기 위해 파종 밀도를 조절해 고립되고 잘 퍼진 단일 세포나 작은 군집을 형성하세요.
5. 항해 후 유지
   1. 표준 배양 조건(37 °C, 5%_CO2)에서 배양합니다.
   2. 배양 과정을 정기적으로 관찰하고 상피 세포 배지를 2일마다 교체하세요.
      참고: 세포는 일반적으로 1차 또는 2차 통과 후, 건강하고 부착성 단일층이 ≥80% 합류율을 얻으면 후속 적용 준비가 완료됩니다.
      주의: 1차 인간 세포와 접촉한 모든 물질은 잠재적 생물학적 위험으로 취급되었습니다. 폐기나 추가 처리 전에 이 물질들은 기관 생물안전 지침을 준수하여 10% 표백제로 소독되었습니다.

Results

1차 HEEC 배양 시스템의 성공적인 확립은 형태학적, 증식적, 분자 평가를 통해 확인되었으며, 이는 그림 1에 설명되어 있습니다. 혼합 효소 소화, 적혈구 용해, ROCK 억제제를 결합하여 이 프로토콜은 인간 자궁내막 조직에서 상피 세포를 효율적으로 분리하고 안정적으로 증식할 수 있게 했습니다.

형태학적 관찰은 초기 문화 시기에 Y-27632가 본질적으로 차지했음을 보여주었다. 10 μM Y-27632로 처음 48시간 동안 배양한 HEEC는 빠르게 부착되어 3일째에는 고전적인 자갈로 이루어진 응집력 있는 상피 섬을 형성했다(그림 2). 이 집단들은 5일차와 7일차에 걸쳐 꾸준히 확장되어 결국 합류하는 상피 시트를 형성했다. 반면, Y-27632가 없는 배양은 부착 부실, 증식 속도가 느리며 관찰 기간 내내 조직화...

Discussion

인간 자궁내막 상피세포(HEEC)의 신뢰할 수 있는 시험관 내 모델 구축은 자궁내막 생물학과 병리학 연구에 필수적입니다¹¹. HEEC 절연을 위한 여러 방법이 개발되었으나, 대부분은 기술적 복잡성, 낮은 효율성, 제한된 팽창 전위 ^4,5로 인해 제한을 받고 있습니다. 많은 프로토콜은 또한 피더 계층에 의존하여 변동성을 발생시키고 확장성을 저해합니다^. 본 연구에서는 주요 HEEC의 효율적인 격리와 안정적 확장을 가능하게 하는 간소화되고 재현 가능한 프로토콜을 제시함으로써 오랜 과제들을 해결합니다. 이 방법의 성공은 세 가지 핵심 요소의 순차적 통합에 기인합니다: 효과적인 조직 해리를 위한 혼합 효소 소화, 초기 순도를 개선하기 위한 전용 적혈구 용해 단계, 그리고 R...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
분산	솔라비오	CAS: 42613-33-2	HEEC의 격리
콜라게나제형 I	머크	SKU:SCR103	HEEC의 격리
100 & 마이크로; M 메시 필터	솔라비오	431752	HEEC의 여과는
토끼 반 CK18	ABCAM	ab133263	HEEC의 분화 마커를 확인하기 위한 면역형광 염색을 위한
토끼 반 CDH1	ABCAM	AB40772	HEEC의 분화 마커를 확인하기 위한 면역형광 염색을 위한
토끼 반 VIM	ABCAM	AB16700	HEEC의 분화 마커를 확인하기 위한 면역형광 염색을 위한
4% 파라포름알데히드	솔라비오	P0099	HEEC의 분화 마커를 확인하기 위한 면역형광 염색을 위한
CO2 인큐베이터	써모 사이언티픽	42820906	세포 인큐베이션을 위해
원심분리기	에펜도르프	5404HN133048	셀 원심분리기
100mm 세포 배양 접시	코닝	430167	세포 배양을 위해
50ml 원심분리관	코닝	430829	세포 원심분리를 위해
1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브	네스트	081722CK01	세포 소화를 위해
셀 스트레이너	솔라비오	431752	세포 여과
인산염 완충 용액	테코노	20201033	세척 용액
DMEM	깁코	8122622	중화 매체의 구성 요소
페니실린/스트렙토마이신	써모 사이언티픽	15140-122	항생제
태아 소 혈청	깁코	2556132P	중화 매체의 구성 요소
0.05% 트립신	바살메디아	K431010	HEECs 에 대해; 해리
Y-27632	솔라비오	IY0040	ROCK 억제제
적혈구 용해 완충제	솔라비오	R1010	적혈구 용해
1% 트라이튼 X-100	써모 사이언티픽	HFH10	막 투과화
당나귀 항토끼 IgG	써모 사이언티픽	A32790TR	2차 항체
다피	써모 사이언티픽	62248	DNA 염색
1 x PBST	솔라비오	P1031	세척 완충제
주요 HEEC용 전용 매체	아이셀	iCell-f004-002h	HEEC의 문화를 위해
역방향 정초점 현미경	Zeiss	LSM880	면역형광 영상 획득에 사용; 40x 장착
MRC-5 세포주	아이셀	iCell-h146	인간 자궁내막선암세포주; STR 프로파일링.
이시카와 세포주	아이셀	iCell-h113	인간 자궁내막선암세포주; STR 프로파일링.