방법 논문

세포외 플럭스 분석법을 이용한 전체 재생 제브라피시 뇌실의 체외 대사 활동 평가

538 조회수

⸱

DOI:

10.3791/70459

⸱

2026년 4월 17일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, 2Institute of Developmental and Regenerative Medicine, University of Oxford, 3King Faisal Specialist Hospital & Research Centre, 4Department of Chemistry, University of Oxford

이 논문에서

요약

이 글에서는 성체 제 브라피시 뇌실의 산소 소비율과 세포외 산성화 속도를 정량화하여 산화 및 당분해 대사 능력을 특성화하는 상세한 프로토콜을 설명합니다.

초록

제브라피시가 성체가 되어도 심장을 재생할 수 있는 능력은 부분적으로 대사 적응에 기인합니다. 어류 심장이 당해에 크게 의존한다는 가설이 제기되었으나, 최근 연구들은 산화 대사가 심근세포 재분화와 성공적인 후기 심장 재생의 필수 요소로서 더 복잡한 대사 프로필을 밝혀냈습니다. 2025년에는 Seahorse 검사법(세포외 플럭스 분석)을 활용하여 체 외 내 전체 제브라피시 뇌실의 대사 프로필을 평가하기 위한 고처리량 방법을 적용하였습니다. 이 방법은 Seahorse XFe24 분석기의 XF Mito 스트레스 테스트를 사용하여 기저 및 최대 산소 소비량(OCR)과 세포외 산성화율(ECAR)을 신속하고 실시간으로 평가할 수 있게 합니다. 이 글에서는 전체 제브라피시 뇌실에 대한 세포외 플럭스 분석을 수행하는 상세한 프로토콜을 설명합니다. 생체 외 전심장에서 OCR과 ECAR를 정량화할 수 있는 능력은 발달, 질병 진행 및 재생의 중요한 시점에서 심장 대사를 밝힐 기회를 제공할 것입니다.

서론

인간과 달리 제브라피시(Danio rerio)는 성체 생활 내내 잃어버린 심장 조직을 재생할 수 있는 능력을 유지합니다. 심장 손상 시 상처 경계 부위의 심근세포는 탈분화하여 세포주기 2,3으로 재진입하여 심근세포번호 4를 회복하고 상처를 다시 채웁니다. 최근에는 재생 과정에서 심근세포 재분화의 중요성이 인식되고있습니다. 이 두 과정 모두 제브라피시 심장의 대사 변화에 의해 엄격히 조절되며, 당해작용이 증식을 촉진하고 산화 인산화(OXPHOS)가 재분화를 촉진합니다8. 재생 분야에서 대사 조작을 위한 약리학적 및 유전학적 방법이 널리 사용되고 있지만, 제브라피시 심장의 크기가 작아 복잡한 맞춤형 설정이 필요해 이러한 교란의 대사 효과 검증은 여전히 어렵습니다. 이는 질량분석법12 또는 NMR 분광8을 위한 다중 심장 집합 9,10,11 또는 여러 심장의 집합 설계가 필요하기 때문입니다. 13살.

이러한 한계를 우회하기 위해, 우리는 최근 Seahorse XFe24 분석기를 사용하여 전체 제브라피시 뇌실의 고처리량 대사 프로파일링을 연구했습니다. 세포외 플럭스 분석법은 세포, 췌장 섬, 구체의 산소 소비율(OCR)과 세포외 산성화율(ECAR)을 측정하도록 설계되었습니다. 이는 호흡 전자 전달 사슬 이용과 당화 의존적 락테이트 생성으로 각각 발생하는 매질 내 산소 및 양성자 농도(pH) 변화를 감지하는 고체 상태 센서를 통해 달성됩니다(그림 1A)14.

세포외 플럭스 분석은 96웰 플레이트 구성(XFe96 및 XF Pro), 8웰 미니플레이트, 또는 24웰 플레이트의 다양한 변형(XFe24)에서 수행할 수 있습니다. 96웰 플레이트가 더 높은 처리량을 제공하지만, 센서와 웰 바닥 사이의 작업 거리는 제브라피시 심실 전체를 수용하기에 적합하지 않습니다. 또한 96웰 플레이트 형식에서는 뇌실이 매체 내에 떠 센서에 간섭하는 것을 방지하기 위해 웰 바닥에 심실을 고정하는 장치가 없습니다. 반면, XFe24 섬 포획 마이크로플레이트는 원래 원발성 췌장 섬의 대사 특성 분석을 위해 설계되었으며, 그 결과 조직을 웰 바닥에 침착시키고 이를 스크린(격자)으로 고정할 수 있습니다. 제브라피시 심장의 크기가 작기 때문에, 우리는 섬 캡처 마이크로플레이트를 제브라피시 뇌실에 적용할 수 있었으며, 이 뇌실은 검사 기간 동안 격자 아래에 고정되어 있습니다.

미토콘드리아 호흡 능력을 평가하기 위해 전자전달 사슬 억제제와 아데노신 삼인산(ATP) 합성효소를 사용한 유사 스트레스 검사를 사용했습니다(그림 1A). 우선, OCR의 기준선 측정값(그림 1B, 마젠타)을 수집합니다. 그 후 복합체 V 억제제인 올리고마이신을 주입합니다. 올리고마이신은 ATP 합성효소 활성을 억제하여 OCR 감소를 초래하는데, 이는 ATP 생성에 기인합니다(그림 1B, 녹색). 남은 산소 소비는 분리 호흡과 비미토콘드리아 산소 소비의 결과입니다(그림 1B, 각각 주황색과 회색)15. 올리고마이신 후 FCCP를 주입하여 미토콘드리아 막을 가로지르는 양성자 구배를 분산시킵니다(그림 1A). 양성자 구배를 복원하기 위해 미토콘드리아는 산소 소비량을 최대 용량으로 상향 조절합니다(그림 1B, 파란색). 마지막으로, 로테논과 안티마이신 A의 혼합물이 각각 복합체 I과 III를 억제합니다(그림 1A). 이 약물 조합은 복합체 I과 III에서 복합체 IV15로 전자 흐름이 부족해 미토콘드리아 호흡 전자 전달 사슬 활동이 완전히 차단됩니다. 이로 인해 비미토콘드리아 산소 소비량을 측정할 수 있습니다(그림 1B, 회색).

전반적으로, 섬 캡처 마이크로플레이트와 미토 스트레스 테스트를 사용하여 우리는 전체 제브라피시 심실의 산화 및 당분해 대사 능력을 신속하고 재현성 있게 평가할 수 있었습니다. 아래에서 이 절차에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 마지막으로, 부상을 입지 않은 야생형 고립 심실의 체외 생존을 세포외 플럭스 분석기에서 보여주고, 냉동손상(DPCI) 후 14일 만에 미토 스트레스 검사를 검증했습니다.

프로토콜

아래에 설명된 모든 동물 관련 절차는 영국의 개정된 동물(과학적 절차)법 1986과 유럽의 지침 2010/63/EU를 준수하여 수행되었으며, 옥스퍼드 대학교 동물 관리 및 윤리 검토 중앙 위원회의 승인을 받았습니다.

참고: 이 프로토콜은 페놀 레드와 중탄산염 없이 Seahorse XFe24 분석기와 Seahorse DMEM 매체를 사용하여 수행되었습니다.

1. 제브라피시 심장 냉동손상 (선택 사항)

  1. 실험을 시작하기 전에 지역 기관과 국가 당국으로부터 적절한 윤리적 승인을 받으세요.
  2. 앞서 설명한 대로 얼룩말피시 심장에 냉동 손상을 시행합니다.16, 17, 18.

2. 센서 카트리지에 수분 공급하기

  1. 세포외 플럭스 분석 키트를 열고 24웰 유틸리티 플레이트(그림 2A)를 각 웰당 500 μL 캘리브랜트 용액을 피펫팅하여 적재합니다.
  2. 센서 카트리지와 하이드로 부스터를 사용해 유틸리티 플레이트를 닫으세요(그림 2A).
  3. 카트리지와 유틸리티 플레이트를 37°C의 가습 인큐베이터에서 하룻밤(18–72시간) 배양합니다. 센서 카트리지 뚜껑은 인큐베이션 내내 닫아두세요.

3. 약물 용액 및 배지 준비

  1. 약물의 스톡 용액을 만듭니다: 올리고마이신은 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 10 mM 농도로 녹이고, 카보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)페닐하이드라존(FCCP)은 DMSO에 5 mM 농도로, 로테논은 DMSO에 10 mM 농도로, 안티마이신 A는 에탄올에 10 mM 농도로 녹여 즉시 사용하지 않을 경우 -20 °C에 보관합니다.
    참고: 2-3개월마다 신선한 올리고마이신, 로테논, 항마이신 용액을 준비하고, 검사 전에 매번 FCCP 용액을 준비하는 것이 권장됩니다.
  2. 약물의 작동 농도(500 μM 올리고마이신, 300 μM FCCP, 각 로테논/안티마이신 A 혼합물 각 450 μM)를 DMEM 배지에 희석하여 준비합니다. 최종 작동 농도의 부피를 올리고마이신은 1.5 mL, FCCP는 1.65 mL, 로테논/항마이신 A는 1.8 mL로 설정하여 30개의 포트를 장전할 수 있도록 하세요(카트리지의 억제제당 24개 포트와 피펫팅 오류 보정을 위한 약물당 6개의 추가 포트).
    참고: 로테논/안티마이신 A에 일부 침전이 나타날 수 있지만, 잘 섞으면 이 부분이 최소화됩니다. 3.2에서 언급한 농도는 우물에 주입될 약물의 최종 농도의 10배에 해당합니다.
  3. DMEM 배지(pH 7.4)를 10 mM 포도당, 1 mM 피루베이트, 2 mM 글루타민을 포함하도록 준비하여 -20 °C에서 보관하여 사용 전까지 보관합니다.

4. 세포외 플럭스 분석기 켜기

  1. 분석기 옆 버튼에서 분석기를 하룻밤 켜서 온도를 환경과 균형 있게 하세요.
  2. 컴퓨터를 켜고 Wave 소프트웨어를 열어보세요.
  3. 소프트웨어에서 미토 스트레스 테스트를 선택하세요.
  4. 소프트웨어 왼쪽 하단의 히터를 끄면 분석기 온도가 37°C 이하로 떨어져 28–29°C에 도달하여 제브라피시 사육표준 온도에 근접합니다.
  5. 그룹 정의 페이지( 주입 전략 탭 아래)에서 화 합물 카탈로그에서 각 포트에 침착될 화합물을 추가하여 주입 전략을 설정하세요. 미토 스트레스 검사는 포트 A에 올리고마이신을, 포트 B에 FCCP, 포트 C에 로테논/항마이신을 추가하세요. 포트 D에는 이 프로토콜에서 사용하지 않는 한 가지 추가 약물을 추가할 수 있는 능력이 있습니다.
  6. 실험 전략이 정의되면 주입 전략 탭에 존재하는 다른 모든 사전 설계된 전략을 삭제하세요. 페이지의 Groups 부분에 실험 그룹(예: 야생형과 돌연변이)을 지정하고, 그들이 받을 주입 전략(4.5단계에서 정의된 것)을 명시하세요. 주사 전략이 그룹 간에 일치하고, 설계된 주사 전략도 일치하는지 확인하세요.
  7. 플레이트 맵 페이지에서 각 그룹을 클릭한 후 샘플을 포함할 웰을 클릭하여 24웰 플레이트 내 각 샘플의 위치를 지정하세요.
    1. 이 중 4개의 웰은 샘플 증착에 적합하지 않으며(그림 2B), 배경 보정에 사용할 빈 공간으로 사용된다는 점에 유의하세요. 각 그룹의 샘플이 플레이트 전체에 고르게 분포되어 측정이나 환경 조건에서 위치 편향을 고르게 줄여야 합니다.
  8. 프로토콜 페이지에서 위에 언급된 억제제 외에 추가 억제제가 없다면 대조 또는 실험 탭을 제거하고, 소프트웨어 포트가 카트리지의 약물 위치와 일치하는지 확인하세요.
  9. 소프트웨어는 조건별로 자동으로 3개의 혼합, 대기, 측정 사이클을 설정합니다. 사이클 수를 10회의 기준선(비처리), 3회의 올리고마이신, 7회의 FCCP, 9회의 로테논/항마이신 A 측정으로 변경하여 안정적인 미량과 억제제가 3D 조직에 작용하도록 합니다. 각 사이클은 3분 혼합, 2분 대기, 3분 계량으로 구성되도록 하세요.

5. 분석기 교정

  1. 가습 인큐베이터에서 카트리지와 유틸리티 플레이트를 분리하세요(2.1–2.3 단계 참조).
  2. 하이드로 부스터와 뚜껑(그림 2A)을 카트리지에서 분리하고, 센서 카트리지를 캘리브랜트가 들어 있는 유틸리티 플레이트 위에 올려놓습니다.
  3. 피펫 팁으로 포트 측면 벽을 접촉한 채 억제제를 부드럽게 각 포트에 삽입하여 액체가 원활하게 흐르도록 합니다: 포트 A에 올리고마이신 50 μL, 포트 B 에 FCCP 55 μL, 포트 C 에 로테논/안티마이신 A 60 μL (그림 2C).
    1. 액체는 포트 구멍의 표면 장력에 의해서만 고정되므로 이 단계부터는 갑작스러운 피펫 사용이나 테이핑을 피해야 합니다. 센서 포트에 액체가 들어가지 않도록 주의하세요(그림 2C). 이는 분석기를 손상시킬 수 있습니다.
  4. 소프트웨어에서 실행 시작 을 클릭하고 실행 이름을 붙인 후 컴퓨터에 저장하세요. 이 시점에서 분석기 트레이가 열려 카트리지와 유틸리티 플레이트를 놓습니다.
  5. 약물이 장전된 카트리지와 캘리브랜트가 담긴 유틸리티 플레이트를 트레이의 플레이트 맵(왼쪽 위 A1 웰)에 따라 분석기 트레이에 올려놓고 적절한 맞춤을 확인하세요. 트레이에 올리기 전에 소화전 부스터와 뚜껑(그림 2A)을 플레이트에서 분리하세요. 이를 하지 않으면 분석기가 손상됩니다.
  6. 준비가 되면 ' 분석 실행' 버튼을 눌러 소프트웨어에 분석을 시작하도록 지시하세요. 이 시점에서 분석기는 적재된 트레이를 받아들여 보정을 시작합니다.
  7. 심장 격리를 시작하세요(6.1–6.12 단계 참조). 보정은 약 40분간 진행되지만, 심장을 분리하고 섬 포획 마이크로플레이트에 삽입하는 동안 플레이트를 분석기에 보관할 수 있습니다(그림 2B, D).

6. 어류 심장을 분리하여 24웰 아슬렛 판에 적재

  1. 섬 포획 마이크로플레이트를 열고 24웰 섬 플레이트에 500 μL DMEM(10 mM 포도당, 1 mM 피루베이트, 2 mM 글루타민)을 실온에서 적재합니다.
  2. 모든 그리드를 35mm 페트리 접시에 실온에서 DMEM 매체를 넣어 완전히 잠기고 큰 기포가 없도록 하세요.
  3. 상온에서 DMEM(10 mM 포도당, 1 mM 피루베이트, 2 mM 글루타민)을 포함한 추가 35mm 페트리 접시를 준비합니다. 이 방법은 채취 시 심장을 세척하고 심방과 동맥구를 분리하는 데 사용됩니다.
  4. 5g/L MS-222에 한 마리의 물고기를 도량하고 반사 반응이 없는지 확인하세요.
  5. 물고기를 92mm 페트리 접시에 고정한 스펀지 위에 올려놓고, 심장강을 열어앞서 설명한 대로 심장을 해부합니다.
  6. 심장을 DMEM(10 mM 포도당, 1 mM 피루베이트, 2 mM 글루타민)이 포함된 35 mm 페트리 접시에 실온에서 세척하세요.
  7. 35mm 페트리 접시에서 겸자를 사용해 심방과 동맥구를 제거합니다.
  8. 심실을 부드럽게 흔들고 눌러서 혈액이 내강에서 빠져나가게 하세요. 심장을 세척할 때 심실벽을 손상시키지 마세요.
  9. 심장을 섬 포획 마이크로플레이트의 지정된 웰로 옮기고, 플레이트 맵에 따라 적절한 웰 중앙으로 가라앉게 합니다. 플레이트는 실온으로 유지하세요. 심실이 눈에 띄게 멈추더라도 모든 심실을 검사에 포함시키세요.
  10. 이 과정을 모든 물고기에 대해 반복하세요. 서로 다른 실험군의 대사 활동을 비교할 때는, 한 그룹의 모든 심장을 분리한 후 다음 그룹으로 넘어가는 것이 아니라 한 그룹당 한 개의 심장을 분리하는 것을 권장합니다. 분석기에서 심장은 최소 180분은 생존할 수 있지만(그림 3A), 우리는 매체 내 시간 분배를 균등하게 하기 위해 한 그룹당 한 번에 한 개의 심장을 분리하는 방식을 제안합니다.
  11. 모든 심장이 분리되면(20개의 심장 플레이트에 약 60분), 섬 포획 마이크로플레이트 웰 바닥에 심장을 놓고(그림 2B), 얇은 겸자를 사용해 웰 중앙에 위치시킵니다(그림 2D, E).
  12. 겸자를 사용해 그리드로 덮으세요(약 20분)(그림 2D). 격자가 올바른 방향(메쉬가 심장 쪽을 향하게)에 있고 큰 기포가 포함되어 있지 않은지 확인하세요. 이는 측정에 방해가 될 수 있습니다(그림 2E).
    1. 그리드가 제자리에 놓이면, 집게로 가장자리에서 밀어 넣어 약간의 딸깍 소리가 날 때까지 밀어 넣으세요. 겸자로 심장을 격자에 부딪히지 않도록 주의하세요.

7. 샘플을 분석기에 적재하고 측정값 획득

  1. 심장이 섬 캡처 마이크로플레이트에 봉인되면, 컴퓨터 화면에 녹색 체크 표시가 표시된 대로 모든 웰이 성공적으로 교정되었는지 소프트웨어로 확인해 보세요. 이제 트레이를 열어 유틸리티 플레이트를 배출하세요.
    참고: 이 시점에서 탄환은 배출되지 않으며, 캘리브랜트가 담긴 유틸리티 플레이트만 나타납니다.
  2. 유틸리티 플레이트를 분석기 트레이에 있는 샘플을 담은 아슬렛 마이크로플레이트로 교체하세요. 아슬릿 마이크로플레이트가 올바르게 위치되어 있는지(왼쪽 상단 모서리의 A1) 그리고 뚜껑이 제거되었는지 확인하세요. 뚜껑을 열지 않으면 분석기가 손상됩니다.
  3. 아슬렛 플레이트가 위치되면, 소프트웨어에 하중 셀 플레이트를 눌러 실험을 시작하도록 지시하세요. 약 처음 10분 동안 센서는 평형 단계를 수행하고, 이후 측정이 시작됩니다.
  4. 실험이 완료되면(약 4시간), 배출 카트리지를 눌러 트레이가 열리고 아슬렛 마이크로플레이트와 카트리지를 배출합니다.
  5. 아슬렛 마이크로플레이트와 카트리지를 제거한 후 트레이가 닫히도록 버튼을 눌러 닫 으세요. 이 시점에서 미디어 결과 조회 에서 수집된 데이터를 확인할 수 있습니다.
  6. 측정값을 저장하고 분석기 컴퓨터에서 내보내 분석 인터페이스에 업로드하여 추가 분석 및 처리를 위해 사용하세요. 이 과정에서 분석기에서 아이슬렛 플레이트와 카트리지를 절단하게 됩니다.
  7. 분석기에서 아슬렛 플레이트와 카트리지를 분리하고 뚜껑을 통해 카트리지를 닫으세요.
  8. 아슬렛 플레이트를 드라이아이스 위에 냉동하거나, 심장을 웰에서 꺼내어 단백질 분리(8단계 8)가 즉시 이루어지지 않으면 -20 °C에서 보관하세요.
  9. 데이터가 저장되면 소프트웨어, 분석기, 컴퓨터를 끄세요.
  10. 분석 인터페이스에 데이터를 업로드하고 표준 뷰 옵션에서 OCR 그래프를 선택하여 시각화하세요. 인터페이스에서 데이터를 OCR 및 ECAR 수준 또는 속도로 보고, 빈 유정을 기반으로 배경 보정을 하고, 플레이트 맵을 클릭하여 유정을 시각화할 수 있도록 선택하세요.

8. 단백질 분리 및 정량화를 위한 정량화

  1. 프로테아제 억제제 함유 방사면역침전 분석법(RIPA) 버퍼를 10mL RIPA 완충액에 용해하고 잘 혼합하여 제조합니다.
  2. 아직 하지 않았다면(7.8단계), 아슬렛 캡처 스크린 삽입 도구(그림 2F)를 사용해 아슬렛 플레이트에서 격자를 제거해 하트를 해제하세요. 하트는 격자에 붙어 있을 수 있으니 조심해서 제거하세요. 이럴 경우에는 겸자를 사용해 떼어주세요. 스크린 삽입 도구로 격자를 제거할 수 없다면, 판을 입체경 아래로 옮기고 미세해리 가위를 사용해 조심스럽게 격자를 잘라 심장을 분리합니다.
  3. 각 심실을 프로테아제 억제제가 첨가된 200 μL RIPA 완충제가 들어 있는 1.5 mL 튜브에 얼음 위에 넣습니다.
  4. 얼음에 일회용 공약을 넣은 균질화기를 사용해 심장을 균질화하세요.
  5. 제공된 소 혈청 알부민(BSA)을 RIPA 버퍼에 희석하여 표준 물질을 준비합니다: 2000 μg/mL, 1500 μg/mL, 1000 μg/mL, 750 μg/mL, 500 μg/mL, 250 μg/mL, 125 μg/mL, 25 μg/mL, 0 μg/mL.
  6. Pierce BCA 작동 용액(50:1, 시약 A: 시약 B, 제조사 지침에 따라 )을 준비하세요. 다음 공식을 사용하여 필요한 작동 시약의 부피를 계산합니다:
    (표준체 수 + 샘플 수) × 2 × 200 μL
    참고: 이 용량은 샘플과 표준형당 200 μL의 작업 용액을 사용할 수 있으며, 샘플과 표준형당 중복 측정을 얻을 수 있습니다.
  7. 96웰 플레이트에서는 각 표준체당 25μL씩 추가하고, 각 웰당 샘플을 두 배로 추가합니다.
  8. 각 웰당 작동 용액 200 μL을 추가합니다.
  9. 플레이트를 37°C에서 30분간 부양하세요.
  10. 플레이트를 실온까지 10분간 식힌 후 플레이트 실러로 밀봉하세요. 웰 내에 기포가 없는지 꼭 확인하세요. 이게 플레이트 리더기를 방해할 수 있습니다. 기포가 한정되어 있으면 팁이나 얇은 겸자로 터뜨리세요.
  11. 플레이트 리더기를 사용해 562nm에서 흡광도를 측정하세요.
  12. 표준체의 흡광도를 바탕으로 표준 곡선을 생성하고 샘플의 단백질 농도를 계산합니다.
  13. 각 웰의 분석 인터페이스 정규화 탭(그림 2G)에서 단백질 농도를 기록하세요.

9. 데이터 분석

  1. 단백질 함량에 대해 정규화한 후, 분석 인터페이스에서 데이터를 엑셀 또는 프리즈 파일로 내보내 그래프 오른쪽 상단의 클라우드 버튼을 통해 추가 분석을 할 수 있습니다.
  2. 정규화된 데이터를 사용하여, 신호가 첫 세 번의 획득에서 불안정할 수 있으므로 기준선 측정값의 평균으로 기준선 OCR과 ECAR를 계산합니다.
  3. 정규화된 데이터를 사용하여 최대 OCR과 ECAR를 지정하고, FCCP 처리의 상위 세 개 획득 사례의 평균 측정값을 계산합니다.

결과

이 프로토콜은 전체 제브라피시 뇌실의 OCR과 ECAR를 정량화할 수 있게 합니다. 약물 치료 없이 손상되지 않은 야생형 KCL 심실을 분석기 안에서 배양하여 체 외 환경에서 심실의 생존성을 검증했습니다(그림 3A). 데이터는 심실의 OCR과 ECAR가 안정적이며, 최소 180분 이상 빈 우물의 기준선 측정치보다 유의미하게 높음을 나타냅니다(그림 3A). 이 데이터는 뇌실이 이 외부 생체 환경에서 정상적인 호흡 기능과 생존을 보인다는 것을 시사합니다.

우리는 다양한 약물 농도와 배지 제형을 사용하여 여러 차례 OCR 측정을 수행하여 심실에 대한 최적 용량을 파악하였습니다(그림 3B). 우리는 [올리고마이신] 10 μM, [FCCP] 8 μM, [로테논/안티마이신] 25 μM의 조합을 사용할 때 OCR 접힘 변화(FCCP/기저)가 약간 증가하는 것을 관찰했으며, [올리고마이신] 50 μM, [FCCP] 30 μM, [로테논/항미신] 45 μM은 약간 더 큰 증가를 관찰했습니다(그림 3B). 결과적으로 우리는 실험에 후자의 농도를 사용하기로 했습니다. 심실이 3차원 구조이기 때문에, 약물이 조직의 외부 세포에 강하게 작용하지만 심실의 하내막 세포에는 도달하지 못할 가능성이 있습니다. 이를 해결하기 위해 우리는 DMEM(갈락토스 10 mM, 피루브산 1 mM, 글루타민 4 m)에서 인큐베이션 30분 전 30분 동안 심장을 0.5% 사포닌으로 처리하는 투과화 단계를 수행했습니다. 이로 인해 FCCP 주사 후 OCR이 지속적으로 감소하고 예상되는 OCR 증가가 나타나지 않아 심장이 대사적으로 기능 저하를 시사했습니다. 따라서 우리는 실험을 위해 심실을 투과시키지 않았습니다.

더 나아가, 여기서는 원래 실험8에서 정규화된 흔적을 제시합니다. 7종 야생형 제브라피시 균주의 재생 잠재력의 자연스러운 변화를 활용하여, 우리는 세포질 말레이트 탈수소효소 1Ab mdh1ab가 심근세포 재분화를 통해 재생에 유익한 효과를 보인다는 것을 확인했습니다. 이 결과를 검증하기 위해, 우리는 심근세포 특이적 방식으로 mdh1ab 를 과발현하는 형질전환 제브라피시(mdh1ab cOE)와 녹색 형광 단백질 과발현 대조 어류(GFP cOE)를 생산하였습니다. 우리는 그들의 심실을 냉동 손상시키고, 14 dpci에서 채취한 뒤 미토 스트레스 검사(그림 3D)를 사용해 대사를 조사했습니다. 올리고마이신 치료는 OCR에 유의미한 변화를 주지 않았으나, ECAR 수치가 경미하게 증가하는 것이 관찰되었습니다. 배지에 FCCP를 주입하면 OCR과 ECAR가 예상대로 증가했으며, mdh1ab cOE 샘플이 가장 높은 최대 호흡 능력을 유지하였습니다(그림 3D). 마지막으로 로테논/항마이신은 두 그룹 모두에서 대사를 완전히 멈추게 만들었습니다. 전반적으로 이 방법은 mdh1ab 과발현 뇌실과 7가지 서로 다른 야생형 제브라피시 계통 간의 대사 능력에서 유의미한 차이를 확인할 수 있게 해주었습니다8.

figure-results-1
그림 1: 미토 스트레스 검사 중 포도당 대사. (A) 포도당 대사의 도식적 표현. 포도당은 GLUT 수송체를 통해 세포에 들어가 당화과정을 통해 피루브산으로 전환됩니다. 젖산 탈수소효소(LDH)는 피루베이트를 젖산으로 전환시키고, 생성된 양성자가 세포에서 분비됩니다. 피루브산은 아세틸-CoA로 전환되어 미토콘드리아와 TCA 회로에 들어가 내막의 호흡 전자전달 사슬을 활성화합니다. 복합체 I, III, V 억제제와 분리 결합체 FCCP는 빨간색으로 표시되어 있습니다. 호흡 전자전달 사슬을 통해 전자가 이동하는 것은 파란색 화살표로 표시되며, 이는 결국 산소와 양성자가 물로 변환되는 과정으로 이어집니다. (B) 미토 스트레스 테스트 결과 도식. 기저 호흡은 마젠타색으로 관찰됩니다. 올리고마이신 주사 시 OCR이 떨어져 ATP 연관 호흡(녹색)과 양성자 누출(주황색)을 계산할 수 있게 됩니다. FCCP는 OCR을 세포의 최대 호흡 용량(파란색)까지 증가시킵니다. 로테논과 항마이신 A 주사는 미토콘드리아 호흡을 멈추게 하여 비미토콘드리아 호흡만 허용합니다(회색). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

figure-results-2
그림 2: 센서 카트리지와 아슬릿 캡처 마이크로플레이트 레이아웃. (A) 뚜껑-센서 카트리지-하이드로 부스터-유틸리티 플레이트 복합체(상단)와 뒤집힌 센서 카트리지(하단) 이미지. 스케일바: 1cm. (B) 제브라피시 뇌실이 적재된 섬 포획 마이크로플레이트 이미지. 빨간 원은 심실이 없는 빈 웰을 나타내며, 분석 중 배경 보정 역할을 합니다. 스케일바: 1cm. (C) XFe24 센서 카트리지의 포트 레이아웃 회로식. 포트 A에는 올리고마이신, B에는 FCCP, C에는 로테논/안티마이신 혼합물이 들어 있습니다. 포트 D는 비워둘 수도 있고, 추가 약물을 추가할 수도 있습니다. S는 센서 포트를 나타내며, 분석기를 손상시키지 않도록 액체가 들어가지 않아야 합니다. (D) 우물 바닥에 있는 제브라피시 뇌실의 대표 이미지로, 격자로 둘러싸여 있는 모습(왼쪽)과 격자로 둘러싸여 있는 모습(오른쪽). 스케일바: 5mm. (E) 심실, 격자(노란색), 센서 카트리지(녹색)를 포함하는 섬 포획 마이크로플레이트의 도식적 단면도. P는 포트를, S는 센서를 나타냅니다. 물결 무늬 선은 매체를 나타냅니다. (F) 섬 캡처 스크린 삽입 도구. 스케일바: 1cm. (G) 분석 인터페이스의 정규화 탭 아이콘. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

figure-results-3
그림 3: 제브라피시 뇌실의 대표적인 OCR 및 ECAR 측정값. (A) 검사에서 사용된 억제제로 처리되지 않은 야생형 제브라피시 뇌실(KCL 균주)의 대표적인 OCR 및 ECAR 흔적(n = 2, 빨간 선). 생물학적 물질이 전혀 없는 빈 우물에서 나오는 흔적은 회색(n = 4)으로 표시되며; OCR, 양방향 반복 측정 ANOVA, 시간 요인 P = 0.0200, 우물 상호작용 시간 P = 0.0196, 웰 ×< P 0.0001, 그룹 요인 P < 0.0001; ECAR 양방향 반복 측정 ANOVA, 시간 인자 P = 0.1323, 우물 상호작용 ×시간 P = 0.0216, 우물 인자 P = 0.0009, 그룹 인자 P<0.0001; 데이터는 SEM 평균± 제시됩니다. (B) 다양한 약물 농도와 사용된 배지에 따른 OCR 폴드 변화. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA (P = 0.0032). [O] 5 μM, [F] 4 μM, [RA] 2 μM, n = 6; [O] 10 μM, [F] 8 μM, [RA] 25 μM, n = 8; [O] 25 μM, [F] 16 μM, [RA] 45 μM, n = 8; [O] 50 μM, [F] 30 μM, [RA] 45 μM, n = 8; [O] 100 μM, [F] 60 μM, [RA] 90 μM, n = 8. O, 올리고마이신; F, FCCP; 류마티스포스, 로테논/안티마이신. (C) 사포닌 투과성 심실(빨간색, n = 4)과 치료받지 않은 심실(회색, n = 4)의 흔적; 양측 반복 측정 ANOVA, 시간 인자 P < 0.0001, 시간 × 시본 상호작용 P < 0.0001, 처리 인자 P < 0.0001, 표본 인자 P = 0.824; 데이터는 SEM 평균± 제시됨. 사포닌 처리된 심실과 치료되지 않은 심실의 OCR최대 값; 짝을 이루지 않은 학생의 T 검정(P = 0.0850). (D) mdh1ab cOE(빨간색, n = 8)와 GFP cOE(회색, n = 8) 14dpci 심실에서 대표적인 OCR 및 ECAR 흔적. OCR, 양방향 반복 측정 ANOVA, 시간 인자 P < 0.0001, 시간 × 표본 상호작용 P < 0.0001, 유전자형 인자 P < 0.0001, 표본 인자 P = 0.1098; ECAR, 양방향 반복 측정 ANOVA 시간 인자 P < 0.0001, 시간 × 표본 상호작용 P = 0.7507, 표본 인자 P = 0.2154, 유전자형 인자 P < 0.0001. 데이터는 Lekkos 등, 20258 에서 각색되었으며 SEM 평균± 제시되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

토론

여기서는 Seahorse XFe24 분석기와 미토 스트레스 테스트를 사용하여 체외 제브라피시 뇌실의 OCR 및 ECAR 분석 프로토콜을 자세히 설명합니다. 심근세포 대사는 심장 재생에 필수적인 역할을 합니다 21,22,23,24. 그러나 재생 중인 제브라피시 심장의 대사 표현형 검증은 도전적이며, 논문에서 종종 부족한 경우가 많습니다 6,7. 제브라피시 심장의 크기가 작기 때문에, NMR 분광법이나 질량분석법과 같은 기법은 적절한신호 8,12,13을 얻기 위해 여러 뇌실을 모아야 합니다. 반면, 여기서 설명하는 방법은 여러 개별 뇌실에서 OCR 및 ECAR 측정값을 획득할 수 있어 통계적 검정력을 높입니다.

대사체학과 같은 고전적 대사 프로파일링 방법은 조직이 채취된 시점의 대사 프로필을 스냅샷으로 보여줍니다. 미토 스트레스 검사를 통해 뇌실이 다양한 대사 도전에 어떻게 적응하는지, 특히 최대 호흡 능력에 대한 실시간 실시간 데이터를 수집할 수 있었는데, 이는 다른 방법론에서는 알 수 없는 부분입니다. 제브라피시 뇌실의 실시간 표현형을 얻기 위해 제브라피시 심장에 대한 관류가 시도되었습니다9, 10, 11. 이는 저처리량 방법을 유지하면서도 캐뉼레이션을 달성하기 위해 복잡한 맞춤형 장비와 고도로 숙련된 기술자가 필요합니다. 분석기는 상업적으로 구할 수 있는 장비를 사용하여 고처리량(한 번에 20개의 심실) 표현형 분석을 위한 더 간단한 대안을 제공합니다. 우리가 아는 한, 이 논문에서 설명한 방법을 클라크형 전극과 같은 다른 라이브 산소 측정 기법과 직접 비교한 바는 없습니다.

중요한 점은, 우리가 설명하는 방법은 연구 질문에 따라 적응 가능하다는 것입니다. 이 분석법은 이전에 전체 제브라피시 배아를 특성화하는 데 사용된 바 있습니다25,26. 여기서 설명한 미토 스트레스 테스트 외에도, 미토 연료 플렉스 테스트는 인간 심장 절편의 대사 연료 이용을 평가하도록 최적화되었습니다27. 더 나아가, 세포 에너지 표현형 검사는 재생 가능한 Astyanax mexicanus 심장28의 당분해 능력을 특성화하는 데 적용되었습니다. 이 프로토콜은 심장 오가노이드와 같은 다른 3D 구조에도 활용될 것으로 예상되며, 손상되지 않은 제브라피시 심장에서 대사 경로의 유전적 교란을 검증하는 데 유용할 것입니다.

이 기법에는 일정한 한계가 있음을 인지하고 있습니다. 기술적 문제로는, 분리 시 심장을 상온에서 DMEM 배지를 다루었으며, 제브라피시19의 최적 온도인 28°C로 관리하지 않았습니다. 수온을 18°C로 낮추는 것은 제브라피시 심장 현상 기능에 큰 영향을 미칠 수 있습니다 29,30. 그러나 단기간 실온 노출이 고립된 뇌실의 생리학에 큰 영향을 미치지는 않을 것으로 예상하는데, 심실은 빠르게 28 °C 분석기로 돌아오기 때문입니다. 우리 손에서는 심방 박리 시 심실 대부분이 눈에 띄게 멈췄는데, 이는 심박조율기 자극이 없었던 것이 비수축의 원인임을 시사합니다. 게다가 격리 기간 동안 배지는 산소가 공급되지 않아 경미한 저산소증이 발생할 수 있으며, 첫 측정 전에 분석기에 혼합되면 정상 산소 농도로 회복됩니다.

심장 온도에 관한 추가적인 실용적 고려사항은 분석기에서 히터가 꺼지면서 온도가 37°C에서 28–29°C로 떨어지는 것과 관련이 있습니다. 분석기는 히터 전력을 원하는 온도로 줄이지 않습니다. 그럼에도 불구하고, 분석기가 작동 중일 때 트레이 내부 온도는 실내 온도보다 6–7 °C 높습니다. 이 온도 범위는 최적의 제브라피시 사육 온도19와 일치합니다.

이 분석은 벌크 제브라피시 뇌실에 대해 수행됩니다. 따라서 OCR과 ECAR에서 관찰된 변화에 대해 개별 세포 유형이 기여하는 것을 구분하는 것은 불가능합니다. 이는면역 세포의 높은 유입이 심근세포의 OCR 변화를 가릴 수 있는 초기 재생 시점의 대사율을 조사할 때 중요한 의미가 있을 수 있습니다. 또한, 심실 내강에 남아 있는 잔류 혈액은 대사 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 헤파린7 이 있는 상태에서 심장 출혈을 허용하면 심장 내 혈액 응고의 영향을 더욱 줄일 수 있습니다. 더불어, 심실 내부 세포로 사용되는 억제제의 확산을 촉진하기 위해 사포닌을 이용한 투과화 단계를 시도했습니다. 사포닌 투과화로 인해 검사 기간 내내 OCR이 지속적으로 떨어져 심실이 호흡부전으로 이어졌다. 이러한 한계는 분리된 심근세포의 분리, 배양 및 분석으로 피할 수 있으나, 이 방법은 세포32 의 장기 배양이 필요하여 재생 환경에는 최적이 아닐 수 있습니다.

손상된 조직이 사용되는 정규화 방법에 영향을 미칠 수 있습니다. 본 연구에서는 BCA 분석법을 이용해 μg 단백질/mL로 OCR을 정규화합니다. BCA 분석법은 콜라겐 단백질의 하이드록시프롤린 및 프로린 함유 조성 때문에 강하게 반응하지 않으며, 코퍼로 검출하기 어렵지만, 다른 세포 결핍 상처 성분의 존재가 정규화에 영향을 미칠 수 있습니다. 향후 연구에서는 총 DNA33 을 심실 내 살아있는 세포를 정확히 반영하는 방법으로도 고려할 수 있습니다.

더욱이, 복합체 V15의 올리고마이신 의존적 억제로 인한 예상된 OCR 감소를 재현하지 못했습니다. 일부 연구에서는 올리고마이신 처리로 분리된 심근세포에 대한 OCR 감소가 나타났음을 보여주지만, 이 데이터의 결과는 최근 성체 생쥐 심근세포에 대한 연구에서 보고된 반응 부재와 유사하다36. 우리가 사용하는 올리고마이신 농도가 앞서 언급한 연구들보다 상당히 높기 때문에, 최종 농도를 50 μM 이상으로 올려도 효과가 있을지는 불분명합니다.

마지막으로, 산소 소비는 주로 호흡에 의존하지만, 세포외 산성화는 당화작용으로 생성된 젖산에만 의한 것이 아니라 이산화탄소가 탄산으로 전환되는 과정에 의해서도 촉진됩니다. 포도당 영양 근모세포에서 기저 조건37에서 이산화탄소에 의한 세포외산성화의 3분의 1이 보고되었습니다. 따라서 호흡에 의한 산성화 비율에 대한 보정이 이루어지지 않은 경우, Seahorse 분석기에서 나온 ECAR 측정값 해석에 대해 신중할 것을 권고합니다.

공개 사항

저자들은 이해 충돌이 없음을 선언한다.

감사의 글

이 방법 개발 과정에서 지원과 비판적 논의를 해주신 닉 하우(애질런트 테크놀로지스)와 토마스 니콜(옥스퍼드 대학교)께 감사드립니다. 옥스퍼드 대학교 생의학 서비스 부서 1층 동물 시설과 옥스퍼드 대학교 발달 및 재생 의학 연구소 직원분들께 제브라피시를 보존하고 이송해 주신 점에 감사드립니다. 이 연구는 의학연구위원회(MR/W006731/1에서 KL로 이동), 킹 파이살 전문병원 및 연구센터(박사후 연구원 지원), 웰컴 기관 전략 지원 기금(204826/Z/16/Z에서 JSOM으로), 영국 심장재단 IBSRF(FS//17/58/33072에서 LCH), 유럽 연구위원회(ERC, 유럽연합 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램(715895) 하에 지원받았습니다. CAVEHEART, ERC-2016-STG에서 MTMM에 발송), 영국 심장 재단 프로젝트 보조금(PG/15/111/31939 및 PG/23/11189 to MTMM), MTMM은 옥스퍼드 대학교 BHF 옥스퍼드 연구 우수 센터(RE/24/130024)와 BHF 재생 의학 센터(RM/13/3/30159)의 지원을 인정합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5ml 에펜도르프 튜브와 nbsp;스타랩S1615-5550
96웰 플레이트  서모피셔AB-0800
안티마이신 AChemCruz SC-202467A
DMEM 매체애질런트1035755-100
DMSO시그마-올드리치  D2650-100mL
드라이아이스 
에탄올수펠코1.00983.2500
세포외 플럭스 분석 키트  애질런트103518-100팩에는 유틸리티 플레이트, 하이드로 부스터, 센서 카트리지, 뚜껑(아슬렛 플레이트와 함께 제공됨)이 들어 있습니다.
FCCP시그마-올드리치  C2920
포도당애질런트103577-100
글루타민애질런트103579-100
인큐베이터
섬 캡처 마이크로플레이트애질런트101122-100팩에는 25개의 그리드가 포함되어 있습니다
Islet 캡처 스크린 인스터 도구애질런트101135-100
미세박리 겸자아이디아텍31317605-S 크기 (심실과 동맥 및 심방을 분리하기 위해 2배 필요)
미세해리 가위FST15009-08
MS-222시그마-올드리치  E10521
올리고마이신MP 151786
공자, 모토르 호모제니저 VWR431-0100
공약VWR431-0094
페트리 접시 35mm그레이너 바이오-원627102
페트리 접시 92mm스타스테트82.1473
피어스 BCA 분석 키트써모 사이언티픽23227
피어스 프로테아제 및 인산효소 억제제 미니 정제, EDTA 프리써모 사이언티픽A32961
피루베이트애질런트103578-100
RIPA 용해 완충제산타크루SC-364162
로테논MP 02150154-CF
시호스 애널리틱스 인터페이즈애질런트https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/agilent-seahorse-analytics-787485
시호스 XFe24 분석기애질런트https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-analyzers/seahorse-xfe24-analyzer-740878
실러써모 사이언티픽AB-0558
스펙트로스타 나노MG LABTECH GmbH601-0298
스펀지물어가 배 쪽이 위로 들어갈 수 있을 만큼 길고 깊게 절개를 하세요
웨이브 (버전 2.6.1.56)애질런트https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop
XF 구경  애질런트100840-000

참고문헌

  1. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science (1979). 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  2. Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
  3. Kikuchi, K., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4+ cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
  4. Bertozzi, A., et al. Is zebrafish heart regeneration "complete"? Lineage-restricted cardiomyocytes proliferate to pre-injury numbers but some fail to differentiate in fibrotic hearts. Dev Biol. 471, 106-118 (2021).
  5. Nguyen, P. D., et al. Interplay between calcium and sarcomeres directs cardiomyocyte maturation during regeneration. Science (1979). 380 (6646), 758-764 (2023).
  6. Fukuda, R., et al. Stimulation of glycolysis promotes cardiomyocyte proliferation after injury in adult zebrafish. EMBO Rep. 21 (8), e49752(2020).
  7. Honkoop, H., et al. Single-cell analysis uncovers that metabolic reprogramming by ErbB2 signaling is essential for cardiomyocyte proliferation in the regenerating heart. Elife. 8, e50163(2019).
  8. Lekkos, K., et al. Oxidative phosphorylation is required for cardiomyocyte redifferentiation and long-term fish heart regeneration. Nat Cardiovasc Res. 4 (10), 1363-1380 (2025).
  9. Zhang, H., et al. A Langendorff-like system to quantify cardiac pump function in adult zebrafish. Dis Model Mech. 11 (9), dmm034819(2018).
  10. Zhang, P. C., Llach, A., Sheng, X. Y., Hove-Madsen, L., Tibbits, G. F. Calcium handling in zebrafish ventricular myocytes. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 300, 56-66 (2011).
  11. Lin, E., et al. Construction and use of a zebrafish heart voltage and calcium optical mapping system, with integrated electrocardiogram and programmable electrical stimulation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 308, R755-R768 (2015).
  12. Miklas, J. W., et al. Amino acid primed mTOR activity is essential for heart regeneration. iScience. 25 (1), 103574(2022).
  13. García-Poyatos, C., et al. Cox7a1 controls skeletal muscle physiology and heart regeneration through complex IV dimerization. Dev Cell. 59 (14), 1824-1841.e10 (2024).
  14. How Agilent Seahorse XF Analyzers Work. , Agilent. https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/how-seahorse -xf-analyzers-work?srsltid=AfmBOopkIZodH4uZO 5puXTOp1U5gdkky661L6TKluz5XgBWGqujHEzww (2026).
  15. Yoo, I., Ahn, I., Lee, J., Lee, N. Extracellular flux assay (Seahorse assay): Diverse applications in metabolic research across biological disciplines. Mol Cells. 47 (8), 100095(2024).
  16. Chablais, F., Jaźwińska, A. Induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury. J Vis Exp. (62), e3666(2012).
  17. González-Rosa, J. M., Mercader, N. Cryoinjury as a myocardial infarction model for the study of cardiac regeneration in the zebrafish. Nat Protoc. 7 (4), 782-788 (2012).
  18. Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), e18503(2011).
  19. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2019).
  20. Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. J Vis Exp. (55), e3165(2011).
  21. Duan, X., Liu, X., Zhan, Z. Metabolic regulation of cardiac regeneration. Front Cardiovasc Med. 9, 933060(2022).
  22. Yu, F., Cong, S., Yap, E. P., Hausenloy, D. J., Ramachandra, C. J. Unravelling the interplay between cardiac metabolism and heart regeneration. Int J Mol Sci. 24 (12), 10300(2023).
  23. Cook, M., Lal, S., Hume, R. D. Transcriptional, proteomic and metabolic drivers of cardiac regeneration. Heart. 111 (18), 851-858 (2025).
  24. Chen, X., et al. Metabolic reprogramming: A byproduct or a driver of cardiomyocyte proliferation. Circulation. 149 (20), 1598-1610 (2024).
  25. Bond, S. T., McEwen, K. A., Yoganantharajah, P., Gibert, Y. Live metabolic profile analysis of zebrafish embryos using a seahorse XF 24 extracellular flux analyzer. Methods Mol Biol. 1797, 393-401 (2018).
  26. Gibert, Y., McGee, S. L., Ward, A. C. Metabolic profile analysis of zebrafish embryos. J Vis Exp. (71), e4300(2013).
  27. Trampel, K. A., et al. Seahorse metabolic analysis for human and mouse cardiac organotypic slices. bioRxiv. , (2025).
  28. Ruggiero, G., et al. A balanced circadian glycolytic rhythm drives cardiomyocyte cell cycle progression during fish heart regeneration. bioRxiv. , (2025).
  29. Lee, L., et al. Functional assessment of cardiac responses of adult zebrafish (Danio rerio) to acute and chronic temperature change using high-resolution echocardiography. PLoS One. 11 (1), e0145163(2016).
  30. Shaftoe, J. B., Geddes-McAlister, J., Gillis, T. E. Integrated cellular response of the zebrafish (Danio rerio) heart to temperature change. J Exp Biol. 227 (20), jeb247522(2024).
  31. Ryan, R., Moyse, B. R., Richardson, R. J. Zebrafish cardiac regeneration—looking beyond cardiomyocytes to a complex microenvironment. Histochem Cell Biol. 154 (5), 533-548 (2020).
  32. Angelini, A., Pi, X., Xie, L. Evaluation of long-chain fatty acid respiration in neonatal mouse cardiomyocytes using SeaHorse instrument. STAR Protoc. 3 (2), 101392(2022).
  33. Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Rodríguez Colman, M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protoc. 2 (1), 100386(2021).
  34. Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. J Mol Cell Cardiol. 74 (100), 340-352 (2014).
  35. Cheng, Y. Y., et al. Metabolic changes associated with cardiomyocyte dedifferentiation enable adult mammalian cardiac regeneration. Circulation. 146 (25), 1950-1967 (2022).
  36. Li, X., et al. Inhibition of fatty acid oxidation enables heart regeneration in adult mice. Nature. 622 (7983), 619-626 (2023).
  37. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochim Biophys Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  38. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and analysis of extracellular acid production to determine glycolytic rate. J Vis Exp. (106), e53464(2015).

재인쇄 및 허가

태그

Seahorse
세포외 플럭스 분석법을 이용한 전체 재생 제브라피시 뇌실의 체외 대사 활동 평가
문의하기
사서에게 추천하기

개인정보

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.